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摘 要 以自制的保护型缩宫素MBHA树脂为原料，通过优化裂解反应中的裂解液配比、反应时间并在低反应浓度下采用双氧水氧化进行成环反应，建立了缩宫素新生产工艺。新生产工艺操作简便、省时高效，且所得中间产物的含量提高、杂质减少，对缩宫素粗品纯化有利。
关键词 缩宫素 环化 裂解
中图分类号：O629.72； TQ464.7 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2019）09-0065-02
Study on the optimization of process for the production of oxytocin
JIANG Ximing， ZHU Xinlei， HUANG Zhenhui*
（ SPH No.1 Biochemical & Pharmaceutical Co.， Ltd.， Shanghai 200240， China）
ABSTRACT Using self-made protective oxytocin MBHA resin as a raw material， a new process for the production of oxytocin was established by optimizing the ratio of lysate in cleavage solution， reaction time and cyclization reaction by oxidation of hydrogen peroxide at low reaction concentration. This process was simple， time-saving and efficient， and the content of intermediate products was increased and the impurities were reduced， which was of benefit to the purification of crude oxytocin.
KEY WORDS oxytocin； cyclization； cleavage
缩宫素是一种由9个氨基酸组成并含有一个二硫键的环肽（图1），临床上主要用于引产、催产以及治疗产后或流产后因宫缩无力或缩复不良而引起的子宫出血，也可用于促使排乳。
本研究旨在以固相合成得到的保護型缩宫素MBHA树脂为原料，通过优化裂解和成环反应条件，建立缩宫素的新生产工艺。
1 试剂
保护型缩宫素MBHA树脂、纯化水，均自制；三氟乙酸、甲基叔丁基醚（MTBE）、醋酸、氢氧化钠，均国药集团化学试剂有限公司生产；三异丙基硅烷（TIS），吉尔生化（上海）有限公司生产；色谱乙腈，美国Tedia有限公司生产；30%双氧水，上海凌峰化学试剂有限公司生产。
2 实验方法
2.1 保护型缩宫素MBHA树脂的裂解反应[1]
在10 L双层玻璃砂芯反应釜中按比例配制三氟乙酸/TIS/纯化水裂解液，降温至<10 ℃，搅拌下加入保护型缩宫素MBHA树脂，22 ～ 30 ℃下反应1 ～ 1.5 h。过滤，滤液减压浓缩，浓缩液倒入冷的MTBE中，出现大量白色沉淀物，静置30 min后离心处理并去上清液。沉淀物以冷的MTBE洗涤、离心处理并去上清液；再重复操作2次。沉淀物经真空干燥，即得还原型缩宫素。
2.2 还原型缩宫素的成环反应[2-4]
用50%醋酸溶液溶解还原型缩宫素，再用纯化水稀释还原型缩宫素浓度至1 mg/ml，然后加入30%双氧水并用4 mol/L的氢氧化钠溶液调节反应液pH至7.0 ～ 9.0，室温下反应。反应结束后用醋酸调节反应液pH至3.0 ～ 5.0，用0.45 μm膜过滤，即得缩宫素粗品溶液。
2.3 缩宫素粗品的纯化[5]
采用Varian Prepstar SD-1制备型高效液相色谱仪进行缩宫素粗品纯化：色谱柱Load & lock 4002，50 mm×260 mm，填料Kromasil 100-10-C18。流动相A：0.02%醋酸/水；流动相B：0.02%醋酸/色谱乙腈。流速100 ml/min，操作柱压700 psi左右，检测波长210 nm。梯度洗脱，收集样品主峰，然后浓缩去乙腈，冷冻干燥，所得白色粉末即为缩宫素纯品。
3 结果与讨论
3.1 不同裂解液配比对所得还原型缩宫素纯度的影响
我们对裂解反应中的裂解液配比进行了研究，重点考察了不同配比的裂解液对所得还原型缩宫素纯度的影响。结果显示，同于室温下反应1 h，裂解液配比（V/V/V）为三氟乙酸∶TIS∶纯化水=90∶7.5∶2.5时所得还原型缩宫素的纯度最高（表1）。
3.2 裂解反应时间对所得还原型缩宫素纯度的影响
我们以最优裂解液配比（V/V/V）三氟乙酸∶TIS∶纯化水=90∶7.5∶2.5进行实验，考察了裂解反应时间对所得还原型缩宫素纯度的影响。结果显示，随着裂解反应时间延长，所得还原型缩宫素的纯度逐渐下降（表2），同时杂质含量逐渐增加。
3.3 氧化方式及其时间对成环反应结果的影响 我们比较了空气氧化和双氧水氧化两种成环反应所得缩宫素粗品溶液中的缩宫素和杂质的含量。结果显示，当采用空气氧化时，随着成环反应时间延长，还原型缩宫素逐渐转化为缩宫素，24 h后反应基本完全，最终所得缩宫素粗品溶液中的缩宫素含量为64.77%（表3）；而当采用双氧水氧化时，成环反应进行10 min，还原型缩宫素即基本完全转化成缩宫素，所得缩宫素粗品溶液中的缩宫素含量为72.64%（表4）。
3.4 还原型缩宫素的反应浓度对成环反应结果的影响
我们在双氧水氧化成环反应中还考察了还原型缩宫素的反应浓度对所得缩宫素粗品溶液中缩宫素和杂质含量的影响。结果显示，当还原型缩宫素的反应浓度为1 mg/ml时，所得缩宫素粗品溶液中的缩宫素含量最高，杂质含量最低（表5）。实验中还发现，反应浓度越高，反应液越浑浊，甚至出现黄色黏稠物，为多聚物。
4 小結
本研究以固相合成得到的保护型缩宫素MBHA树脂为原料，通过优化裂解和成环反应条件，包括优化裂解反应中的裂解液配比、反应时间和采用双氧水氧化成环反应等，建立了缩宫素新生产工艺。新生产工艺不仅操作简便、经济环保、省时高效，且所得缩宫素粗品溶液中的缩宫素含量也提高，同时杂质含量降低，有利于缩宫素粗品的进一步纯化操作。
参考文献
[1] 徐仲， 李宁， 刘卓. 奥曲肽固相合成及环化的研究[J]. 哈尔滨工业大学学报， 2008， 40（2）： 292-295.
[2] 王良友， 潘和平， 陈正英. 多肽合成中几种形成二硫键方法的介绍[J]. 有机化学， 1998， 18（6）： 576-580.
[3] 唐艳春， 田桂玲， 叶蕴华. 环肽合成方法的研究进展[J].高等学校化学学报， 2000， 21（7）： 1056-1063.
[4] 周艳荣， 戴秋云. 肽合成中多对二硫键的形成策略及分析方法[J]. 生物技术通讯， 2002， 13（3）： 232-233； 241.
[5] 白泉， 葛小娟， 耿信笃. 反相液相色谱对多肽的分离、纯化与制备[J]. 分析化学， 2002， 30（9）： 1126-1129.
关键词 缩宫素 环化 裂解
中图分类号：O629.72； TQ464.7 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2019）09-0065-02
Study on the optimization of process for the production of oxytocin
JIANG Ximing， ZHU Xinlei， HUANG Zhenhui*
（ SPH No.1 Biochemical & Pharmaceutical Co.， Ltd.， Shanghai 200240， China）
ABSTRACT Using self-made protective oxytocin MBHA resin as a raw material， a new process for the production of oxytocin was established by optimizing the ratio of lysate in cleavage solution， reaction time and cyclization reaction by oxidation of hydrogen peroxide at low reaction concentration. This process was simple， time-saving and efficient， and the content of intermediate products was increased and the impurities were reduced， which was of benefit to the purification of crude oxytocin.
KEY WORDS oxytocin； cyclization； cleavage
缩宫素是一种由9个氨基酸组成并含有一个二硫键的环肽（图1），临床上主要用于引产、催产以及治疗产后或流产后因宫缩无力或缩复不良而引起的子宫出血，也可用于促使排乳。
本研究旨在以固相合成得到的保護型缩宫素MBHA树脂为原料，通过优化裂解和成环反应条件，建立缩宫素的新生产工艺。
1 试剂
保护型缩宫素MBHA树脂、纯化水，均自制；三氟乙酸、甲基叔丁基醚（MTBE）、醋酸、氢氧化钠，均国药集团化学试剂有限公司生产；三异丙基硅烷（TIS），吉尔生化（上海）有限公司生产；色谱乙腈，美国Tedia有限公司生产；30%双氧水，上海凌峰化学试剂有限公司生产。
2 实验方法
2.1 保护型缩宫素MBHA树脂的裂解反应[1]
在10 L双层玻璃砂芯反应釜中按比例配制三氟乙酸/TIS/纯化水裂解液，降温至<10 ℃，搅拌下加入保护型缩宫素MBHA树脂，22 ～ 30 ℃下反应1 ～ 1.5 h。过滤，滤液减压浓缩，浓缩液倒入冷的MTBE中，出现大量白色沉淀物，静置30 min后离心处理并去上清液。沉淀物以冷的MTBE洗涤、离心处理并去上清液；再重复操作2次。沉淀物经真空干燥，即得还原型缩宫素。
2.2 还原型缩宫素的成环反应[2-4]
用50%醋酸溶液溶解还原型缩宫素，再用纯化水稀释还原型缩宫素浓度至1 mg/ml，然后加入30%双氧水并用4 mol/L的氢氧化钠溶液调节反应液pH至7.0 ～ 9.0，室温下反应。反应结束后用醋酸调节反应液pH至3.0 ～ 5.0，用0.45 μm膜过滤，即得缩宫素粗品溶液。
2.3 缩宫素粗品的纯化[5]
采用Varian Prepstar SD-1制备型高效液相色谱仪进行缩宫素粗品纯化：色谱柱Load & lock 4002，50 mm×260 mm，填料Kromasil 100-10-C18。流动相A：0.02%醋酸/水；流动相B：0.02%醋酸/色谱乙腈。流速100 ml/min，操作柱压700 psi左右，检测波长210 nm。梯度洗脱，收集样品主峰，然后浓缩去乙腈，冷冻干燥，所得白色粉末即为缩宫素纯品。
3 结果与讨论
3.1 不同裂解液配比对所得还原型缩宫素纯度的影响
我们对裂解反应中的裂解液配比进行了研究，重点考察了不同配比的裂解液对所得还原型缩宫素纯度的影响。结果显示，同于室温下反应1 h，裂解液配比（V/V/V）为三氟乙酸∶TIS∶纯化水=90∶7.5∶2.5时所得还原型缩宫素的纯度最高（表1）。
3.2 裂解反应时间对所得还原型缩宫素纯度的影响
我们以最优裂解液配比（V/V/V）三氟乙酸∶TIS∶纯化水=90∶7.5∶2.5进行实验，考察了裂解反应时间对所得还原型缩宫素纯度的影响。结果显示，随着裂解反应时间延长，所得还原型缩宫素的纯度逐渐下降（表2），同时杂质含量逐渐增加。
3.3 氧化方式及其时间对成环反应结果的影响 我们比较了空气氧化和双氧水氧化两种成环反应所得缩宫素粗品溶液中的缩宫素和杂质的含量。结果显示，当采用空气氧化时，随着成环反应时间延长，还原型缩宫素逐渐转化为缩宫素，24 h后反应基本完全，最终所得缩宫素粗品溶液中的缩宫素含量为64.77%（表3）；而当采用双氧水氧化时，成环反应进行10 min，还原型缩宫素即基本完全转化成缩宫素，所得缩宫素粗品溶液中的缩宫素含量为72.64%（表4）。
3.4 还原型缩宫素的反应浓度对成环反应结果的影响
我们在双氧水氧化成环反应中还考察了还原型缩宫素的反应浓度对所得缩宫素粗品溶液中缩宫素和杂质含量的影响。结果显示，当还原型缩宫素的反应浓度为1 mg/ml时，所得缩宫素粗品溶液中的缩宫素含量最高，杂质含量最低（表5）。实验中还发现，反应浓度越高，反应液越浑浊，甚至出现黄色黏稠物，为多聚物。
4 小結
本研究以固相合成得到的保护型缩宫素MBHA树脂为原料，通过优化裂解和成环反应条件，包括优化裂解反应中的裂解液配比、反应时间和采用双氧水氧化成环反应等，建立了缩宫素新生产工艺。新生产工艺不仅操作简便、经济环保、省时高效，且所得缩宫素粗品溶液中的缩宫素含量也提高，同时杂质含量降低，有利于缩宫素粗品的进一步纯化操作。
参考文献
[1] 徐仲， 李宁， 刘卓. 奥曲肽固相合成及环化的研究[J]. 哈尔滨工业大学学报， 2008， 40（2）： 292-295.
[2] 王良友， 潘和平， 陈正英. 多肽合成中几种形成二硫键方法的介绍[J]. 有机化学， 1998， 18（6）： 576-580.
[3] 唐艳春， 田桂玲， 叶蕴华. 环肽合成方法的研究进展[J].高等学校化学学报， 2000， 21（7）： 1056-1063.
[4] 周艳荣， 戴秋云. 肽合成中多对二硫键的形成策略及分析方法[J]. 生物技术通讯， 2002， 13（3）： 232-233； 241.
[5] 白泉， 葛小娟， 耿信笃. 反相液相色谱对多肽的分离、纯化与制备[J]. 分析化学， 2002， 30（9）： 1126-1129.