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中图分类号 R284.1 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2021）20-2473-06
DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.20.07
摘 要 目的：建立浙贝母配方颗粒的指纹图谱，并测定其中3种成分的含量。方法：采用高效液相色谱（HPLC）法。以贝母素乙为参照，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》绘制13批浙贝母配方颗粒的HPLC指纹图谱，并进行相似度评价，确定共有峰;采用相同的HPLC法测定浙贝母配方颗粒中贝母辛、贝母素甲和贝母素乙的含量，并比较不同生产企业样品的质量差异。结果：13批浙贝母配方颗粒中共有5个共有峰，相似度为0.669～0.971;指认了贝母辛、贝母素甲和贝母素乙等3个共有峰。贝母辛、贝母素甲和贝母素乙检测质量浓度的线性范围分别为30.00～180.00 μg/mL（r=0.999 9）、79.58～477.50 μg/mL（r=0.999 6）、97.33～584.00 μg/mL（r=0.999 4）;精密度、稳定性（24 h）、重复性试验的RSD均小于3%;平均加样回收率分别为95.82%（RSD=1.17%，n=6）、99.00%（RSD=1.96%，n=6）、95.39%（RSD=2.00%，n=6）。13批样品中，贝母辛、贝母素甲、貝母素乙的含量分别为0.17～1.02、0.52～2.26、0.70～3.50 mg/g，平均总含量为3.62 mg/g。其中，企业C、A样品中上述成分的平均总含量较高，分别为5.02、4.61 mg/g，其次是企业E、B样品，分别为3.48、3.02 mg/g;最低为企业D样品，仅为1.87 mg/g。结论：所建指纹图谱和含量测定方法简便、可行，重复性好，可用于浙贝母配方颗粒的质量评价;不同生产企业样品的含量存在一定差异。
关键词 浙贝母;配方颗粒;指纹图谱;高效液相色谱法;含量测定
Fingerprint Establishment and Content Determination of 3 Components in Fritillaria thunbergii Formula Granules
HUANG Xiaolan1，2，HE Xufeng1，ZHOU Nong2，YANG Wenwu1，QIAN Linqun2（1. Chongqing Wanzhou Food and Drug Inspection Institute， Chongqing 404100， China; 2. College of Food and Biological Engineering/Chongqing Engineering Laboratory for Green Cultivation and Deep Processing of the Three Gorges Reservoir Area’s Medicinal Herbs， Chongqing Three Gorges University， Chongqing 404100， China）
ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the fingerprint of Fritillariae thunbergii formula granules and determine the contents of 3 components. METHODS： HPLC method was used. Using peiminine as reference， HPLC fingerprints of 13 batches of F. thunbergii formula granules were drawn with Similarity Evaluation System of TCM Chromatogram Fingerprint（2012 edition）. Similarity evaluation and common peak identification were conducted. The contents of peimisine， peimine and peiminine in F. thunbergii formula granules were determined by the same HPLC method. The quality difference of samples were compared among different manufacturers. RESULTS： There were 5 common peaks in 13 batches of F. thunbergii formula granules， and the similarity was 0.669-0.971. Three common peaks of peimisine， peimine and peiminine were identified. The linear ranges of peimisine， peimine and peiminine were 30.00-180.00 μg/mL （r=0.999 9）， 79.58-477.50 μg/mL （r=0.999 6） and 97.33-584.00 μg/mL （r=0.999 4）， respectively. RSDs of precision， stability （24 h） and reproducibility tests were all lower than 3%. The average recoveries were 95.82% （RSD=1.17%，n=6）， 99.00%（RSD=1.96%，n=6） and 95.39%（RSD=2.00%，n=6）， respectively. In the 13 batches of samples， the content of peimisine， peimine and peiminine were 0.17-1.02 mg/g， 0.52-2.26 mg/g， and 0.70-3.50 mg/g， respectively. Their average total content was 3.62 mg/g. The average total content of manufacturer C and A was higher （5.02 mg/g and 4.61 mg/g）， followed by manufacturer E and B （3.48 mg/g and 3.02 mg/g）; the lowest was manufacturer D （only 1.87 mg/g）. CONCLUSIONS： Established fingerprint and content determination method is simple， feasible and reproducible， which can be used for the quality evaluation of F. thunbergii formula granules. There are some differences in content among different manu- facturers. KEYWORDS Fritillaria thunbergii; Formula granules; Fingerprint; HPLC; Content determination
浙貝母为百合科植物浙贝母Fritillaria thunbergii Miq.的干燥鳞茎，其味苦、性寒，归肺、心经，具有清热化痰止咳，解毒散结消痈之功效，常用于治疗风热或痰热咳嗽、肺痈吐脓、疮痈肿毒等症[1]。该药是传统的“浙八味”药材之一，也是常用的大宗中药材[2]。现代研究表明，浙贝母含有生物碱、多糖、总皂苷和核苷类等成分[2-5]，具有镇咳、祛痰、松弛平滑肌、镇痛抗炎、降压活血、抗肿瘤等药理活性[6-7]，其中生物碱类成分贝母辛、贝母素甲和贝母素乙是浙贝母的主要活性成分[8]。
中药配方颗粒作为一种新型的配方用药，与传统的中药饮片相比，具有剂量准确、质量稳定、便于贮存、携带服用方便等特点[8-9]。目前，中药配方颗粒尚缺乏统一的国家质量标准，加之药材/饮片质量存有差异、生产工艺各有不同，使得不同企业生产的配方颗粒的质量和药效参差不齐，无法保证其质量的一致性[10]。为此，国家药典委员会组织审定了部分中药配方颗粒的国家药品标准，形成了含有160种中药配方颗粒的国家药品标准草案[11]，旨在为中药配方颗粒的质量评价提供参考。浙贝母配方颗粒是以浙贝母饮片为原料，经水煎煮提取、浓缩、干燥、制粒等现代化生产工艺制成，具有止咳化痰、清热解毒的作用，对风热感冒引起的咳嗽疗效较好。但浙贝母配方颗粒不在上述标准草案中，且市售配方颗粒使用的是各生产企业的内部质量标准，故亟需建立控制其质量的统一标准。
由于中药配方颗粒经水煎煮后，失去了药材原有的特点，无法进行传统的性状鉴别，而中药指纹图谱分析技术是建立在中药化学成分研究基础上的一种综合的、可量化的鉴定方法，具有整体性和模糊性的特点，现已被广泛应用于中药材及其制剂的质量评价领域[12]。有研究指出，以指纹图谱作为检验手段可强化中药配方颗粒真伪鉴别及优劣评价的专属性[13]。目前，指纹图谱在浙贝母药材的质量评价和控制方面应用广泛[14-17]，而有关浙贝母配方颗粒的研究则主要集中在其处方、工艺优化以及贝母素甲、贝母素乙的含量测定等方面[8，16]。基于此，本研究建立了浙贝母配方颗粒的高效液相色谱（HPLC）指纹图谱，并同法测定了其中贝母辛、贝母素甲和贝母素乙等3种主要活性成分的含量，旨在为完善浙贝母配方颗粒质量评价和相关国家标准提供参考。
1 材料
1.1 主要仪器
本研究所用主要仪器有1260型HPLC仪及配套的在线脱气机、柱温箱、自动进样器、四元泵、蒸发光散射检测器（ELSD）和ChemStation Edition for LC（C.01.06版）数据处理工作站（美国Agilent公司），QUINTIX313-1CN型万分之一电子天平、MSE125S型十万分之一电子天平（德国Sartorius 公司），DZKW-S-6型电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器有限公司），Sigma 4-16S型高速离心机（德国Sigma公司）等。
1.2 主要药品与试剂
贝母辛对照品（批号PS200722-02，纯度≥98.0%）、贝母素甲对照品（批号PS000150，纯度≥98.0%）、贝母素乙对照品（批号PS011156，纯度≥98.0%）均购自成都普思生物科技股份有限公司;乙腈、甲醇为质谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯净水。
13批浙贝母配方颗粒（编号S1～S13）的来源信息如表1所示。将浙贝母配方颗粒研磨成粉，用自封袋密封，置于干燥器中保存，备用。
2 方法与结果
2.1 HPLC指纹图谱的建立
2.1.1 色谱条件 以Durashell C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm）为色谱柱，以乙腈（A）-0.03%二乙胺溶液（B）为流动相进行梯度洗脱（0～15 min，20%A→40%A;15～28 min，40%A;28～30 min，40%A→70%A;30～32 min，70%A→100%A;32～35 min，100%A;35～35.1 min，100%A→20%A）;流速为1.0 mL/min;柱温为35 ℃;进样量为20 ?L。检测器为ELSD，检测器增益为200;喷雾器模式为加热模式;动力级别为40%;漂移管温度为45 ℃;样品室温度为20 ℃;载气流速为2.0 L/min。
2.1.2 对照品贮备液的制备 精密称取贝母辛、贝母素甲、贝母素乙对照品各适量，分别置于5 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释，制成质量浓度分别为1.441、3.820、4.673 mg/mL的单一对照品贮备液。
2.1.3 供试品溶液的制备 取样品粉末约1.0 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加浓氨水5.0 mL使样品分散均匀，浸润1 h后，加入氯仿-甲醇混合溶液（4 ∶ 1，V/V）30 mL，混匀，置于90 ℃水浴中，加热回流2 h，冷却至室温后，将提取液转移至离心管中，以4 000 r/min离心5 min，取有机相，置于蒸发皿中蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至5 mL量瓶中，再用甲醇定容，摇匀，经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.1.4 精密度试验 取“2.1.3”项下供试品溶液（编号S1），按“2.1.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录色谱图。以贝母素乙为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，5个共有峰相对保留时间的RSD不高于1.05%（n=6），相对峰面积的RSD不高于1.76%（n=6），表明方法精密度良好。
2.1.5 重复性试验 取样品（编号S1）约1.0 g，共6份，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。以贝母素乙为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，5个共有峰相对保留时间的RSD不高于1.48%（n=6），相对峰面积的RSD不高于1.80%（n=6），表明方法重复性良好。 2.1.6 稳定性试验 取“2.1.3”项下供试品溶液（编号S1），分别于室温下放置0、2、4、8、16、24 h时按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。以贝母素乙为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，5个共有峰相对保留时间的RSD不高于1.62%（n=6），相对峰面积的RSD不高于1.94%（n=6），表明供试品溶液于室温下放置24 h内稳定性良好。
2.1.7 HPLC指纹图谱的建立 取13批样品，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》对13批样品的HPLC图谱进行分析，设定5个响应较高的色谱峰，选择MARK峰匹配法生成浙贝母配方颗粒的叠加指纹图谱和对照指纹图谱（R）。结果，13批浙贝母配方颗粒共有5个共有峰。结果见图1。
2.1.8 相似度的评价 采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》，以HPLC图谱共有模式为对照，计算13批样品的相似度。结果显示，13批样品与共有模式的相似度为0.669～0.971，表明不同生产企业样品的质量差异较大;但相同企业不同批次样品的相似度接近，表明同一企业的原料和生产工艺相对稳定。结果见表2。
2.1.9 共有峰的指认以及相对保留时间、相对峰面积的计算 通过与单一对照品（图略）比对，共指认了3个共有峰，分别为贝母辛（峰1）、贝母素甲（峰4）、贝母素乙（峰5）。由于贝母素乙的峰面积较大且周围基线平稳，干扰峰较少，故选择贝母素乙为参照，计算其余共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，各共有峰的出峰时间相对稳定，但峰面积差异较大，表明含量差异较大。结果见表3、表4。
2.2 贝母辛等3种成分的含量测定
2.2.1 色谱条件 同“2.1.1”项。
2.2.2 混合对照品溶液的制备 分别精密吸取“2.1.2”项下各单一对照品贮备液2.50 mL，置于10 mL量瓶中，用甲醇稀释，制成质量浓度分别为0.360、0.955、1.168 mg/mL的混合对照品溶液。
2.2.3 供试品溶液的制备 同“2.1.3”项。
2.2.4 空白对照溶液的制备 不加样品，按“2.1.3”项下“加浓氨水5.0 mL……取续滤液，即得”操作，制得空白对照溶液。
2.2.5 系统适用性试验 取上述混合对照品溶液、供试品溶液、空白对照溶液各适量，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图（图2）。结果显示，各成分色谱峰峰形尖锐且对称，以贝母素甲峰计理论板数均大于5 000，分离度均大于1.5，且空白对照无干扰。
2.2.6 线性关系考察 取“2.2.2”项下混合对照品溶液适量，用甲醇逐级稀释，制成贝母辛质量浓度分别为30.00、60.00、90.00、120.00、150.00、180.00 μg/mL，贝母素甲79.58、159.17、238.75、318.33、397.92、477.50 μg/mL，贝母素乙97.33、194.67、292.00、389.33、486.67、584.00 μg/mL的系列工作溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以各待测成分质量浓度的自然对数（X）为横坐标、峰面积的自然对数（Y）为纵坐标进行线性回归。结果见表5。
2.2.7 精密度试验 取“2.2.6”项下系列工作溶液（贝母辛、贝母素甲、贝母素乙质量浓度分别为60.00、159.17、194.67 μg/mL）适量，按“2.2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果显示，贝母辛、贝母素甲、贝母素乙峰面积的RSD分别为2.42%、1.01%、1.92%（n=6），表明仪器精密度良好。
2.2.8 重复性试验 取样品（编号S4）约1.0 g，共6份，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并按标准曲线法计算样品中各待测成分的含量。结果显示，贝母辛、贝母素甲、贝母素乙含量的RSD分别为2.61%、1.86%、2.88%（n=6），表明方法重复性良好。
2.2.9 稳定性试验 取“2.2.3”项下供试品溶液（编号S4），分别于室温下放置0、2、4、8、16、24 h时按“2.2.1”項下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果显示，贝母辛、贝母素甲、贝母素乙峰面积的RSD分别为1.70%、0.44%、0.81%（n=6），表明供试品溶液于室温下放置24 h内稳定性良好。
2.2.10 加样回收率试验 精密称取已知含量的样品（编号S4）0.5 g，共6份，分别加入“2.1.2”项下各单一对照品贮备液适量，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率。结果显示，贝母辛、贝母素甲、贝母素乙的平均加样回收率分别为95.82%、99.00%、95.39%，RSD分别为1.22%、1.98%、2.10%（n=6），表明方法准确度良好。结果见表6。
2.2.11 样品含量测定 取13批浙贝母配方颗粒样品，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并按标准曲线法计算样品中各待测成分的含量。每样品平行测定3次，结果见表7。
3 讨论
3.1 提取条件优化
本课题组参考相关文献[16]对浙贝母配方颗粒的提取方法进行考察。结果发现，当加入浓氨水2.0 mL水解浙贝母配方颗粒时出现了结块现象，导致水解不充分、提取不完全，故通过增加浓氨水量至5.0 mL以保证样品粉末充分浸润，提取率明显提高。样品回流结束后，本课题组分别采用滤纸过滤和离心两种方式对所得溶液进行处理，结果发现，滤纸过滤时的重复性较差，而采用离心时的准确度和重复性均较好。 3.2 指纹图谱分析
13批样品中共有5个共有峰，比秦建平等[17]、朱广磊等[18]关于浙贝母药材的指纹图谱研究结果少2～4个共有峰，其原因可能为浙贝母配方颗粒在制备过程中采用水提方式，导致某些脂溶性成分不能被充分提取[13]。13批浙贝母配方颗粒样品与共有模式的相似度为0.669～0.971，表明不同生产企业的配方颗粒质量差距较大，这可能跟浙贝母配方颗粒的生产工艺特别是样品相当于饮片量的不一致有关;相同企业不同批次浙贝母配方颗粒样品的相似度接近，提示相同生产企业的原料和生产工艺相对稳定。
3.3 样品含量结果分析
含量测定结果显示，13批不同生产企业浙贝母配方颗粒样品间的含量存在一定差异，而相同企业不同批次样品的含量基本一致。从总含量方面看，企业C、A的平均总含量最高，分别为5.02、4.61 mg/g，相差不大;企业E、B、D的平均总含量分别为3.48、3.02、1.87 mg/g，存在较大差异。从单个成分含量方面看，贝母辛为0.17～1.02 mg/g，贝母素甲为0.52～2.26 mg/g，贝母素乙为0.70～3.50 mg/g。同一成分含量在不同生产企业样品中的变化规律不同，如在企业A、C的样品中，贝母素乙含量最高，可达3.20 mg/g以上;其次是贝母辛，含量不低于0.81 mg/g;最低为贝母素甲，平均含量不足0.60 mg/g。在企业B、D、E的样品中，含量由高到低均为贝母素甲>贝母素乙>贝母辛，且这3家生产企业样品中的贝母素甲和贝母素乙含量略有差异，但贝母辛含量相当。引起差异的原因可能是不同生产企业的工艺不一致，所用浙贝母药材质量本身存在差异[19]。此外，笔者还发现，在浙贝母药材（配方颗粒）中易被忽略的生物碱成分贝母辛含量较高（因药典和相关文献[17-18]均未纳入该指标），特别是S1～S3、S7～S9样品中贝母辛的平均含量高达0.92 mg/g，约是同批贝母素甲的1.6倍，因此笔者认为可将其作为浙贝母配方颗粒的质量考察指标。
综上所述，所建指纹图谱和含量测定方法简便、可行，重复性好，可用于浙贝母配方颗粒的质量评价。
参考文献
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（收稿日期：2021-05-27 修回日期：2021-08-24）
（编辑：陈 宏）
DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.20.07
摘 要 目的：建立浙贝母配方颗粒的指纹图谱，并测定其中3种成分的含量。方法：采用高效液相色谱（HPLC）法。以贝母素乙为参照，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》绘制13批浙贝母配方颗粒的HPLC指纹图谱，并进行相似度评价，确定共有峰;采用相同的HPLC法测定浙贝母配方颗粒中贝母辛、贝母素甲和贝母素乙的含量，并比较不同生产企业样品的质量差异。结果：13批浙贝母配方颗粒中共有5个共有峰，相似度为0.669～0.971;指认了贝母辛、贝母素甲和贝母素乙等3个共有峰。贝母辛、贝母素甲和贝母素乙检测质量浓度的线性范围分别为30.00～180.00 μg/mL（r=0.999 9）、79.58～477.50 μg/mL（r=0.999 6）、97.33～584.00 μg/mL（r=0.999 4）;精密度、稳定性（24 h）、重复性试验的RSD均小于3%;平均加样回收率分别为95.82%（RSD=1.17%，n=6）、99.00%（RSD=1.96%，n=6）、95.39%（RSD=2.00%，n=6）。13批样品中，贝母辛、贝母素甲、貝母素乙的含量分别为0.17～1.02、0.52～2.26、0.70～3.50 mg/g，平均总含量为3.62 mg/g。其中，企业C、A样品中上述成分的平均总含量较高，分别为5.02、4.61 mg/g，其次是企业E、B样品，分别为3.48、3.02 mg/g;最低为企业D样品，仅为1.87 mg/g。结论：所建指纹图谱和含量测定方法简便、可行，重复性好，可用于浙贝母配方颗粒的质量评价;不同生产企业样品的含量存在一定差异。
关键词 浙贝母;配方颗粒;指纹图谱;高效液相色谱法;含量测定
Fingerprint Establishment and Content Determination of 3 Components in Fritillaria thunbergii Formula Granules
HUANG Xiaolan1，2，HE Xufeng1，ZHOU Nong2，YANG Wenwu1，QIAN Linqun2（1. Chongqing Wanzhou Food and Drug Inspection Institute， Chongqing 404100， China; 2. College of Food and Biological Engineering/Chongqing Engineering Laboratory for Green Cultivation and Deep Processing of the Three Gorges Reservoir Area’s Medicinal Herbs， Chongqing Three Gorges University， Chongqing 404100， China）
ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the fingerprint of Fritillariae thunbergii formula granules and determine the contents of 3 components. METHODS： HPLC method was used. Using peiminine as reference， HPLC fingerprints of 13 batches of F. thunbergii formula granules were drawn with Similarity Evaluation System of TCM Chromatogram Fingerprint（2012 edition）. Similarity evaluation and common peak identification were conducted. The contents of peimisine， peimine and peiminine in F. thunbergii formula granules were determined by the same HPLC method. The quality difference of samples were compared among different manufacturers. RESULTS： There were 5 common peaks in 13 batches of F. thunbergii formula granules， and the similarity was 0.669-0.971. Three common peaks of peimisine， peimine and peiminine were identified. The linear ranges of peimisine， peimine and peiminine were 30.00-180.00 μg/mL （r=0.999 9）， 79.58-477.50 μg/mL （r=0.999 6） and 97.33-584.00 μg/mL （r=0.999 4）， respectively. RSDs of precision， stability （24 h） and reproducibility tests were all lower than 3%. The average recoveries were 95.82% （RSD=1.17%，n=6）， 99.00%（RSD=1.96%，n=6） and 95.39%（RSD=2.00%，n=6）， respectively. In the 13 batches of samples， the content of peimisine， peimine and peiminine were 0.17-1.02 mg/g， 0.52-2.26 mg/g， and 0.70-3.50 mg/g， respectively. Their average total content was 3.62 mg/g. The average total content of manufacturer C and A was higher （5.02 mg/g and 4.61 mg/g）， followed by manufacturer E and B （3.48 mg/g and 3.02 mg/g）; the lowest was manufacturer D （only 1.87 mg/g）. CONCLUSIONS： Established fingerprint and content determination method is simple， feasible and reproducible， which can be used for the quality evaluation of F. thunbergii formula granules. There are some differences in content among different manu- facturers. KEYWORDS Fritillaria thunbergii; Formula granules; Fingerprint; HPLC; Content determination
浙貝母为百合科植物浙贝母Fritillaria thunbergii Miq.的干燥鳞茎，其味苦、性寒，归肺、心经，具有清热化痰止咳，解毒散结消痈之功效，常用于治疗风热或痰热咳嗽、肺痈吐脓、疮痈肿毒等症[1]。该药是传统的“浙八味”药材之一，也是常用的大宗中药材[2]。现代研究表明，浙贝母含有生物碱、多糖、总皂苷和核苷类等成分[2-5]，具有镇咳、祛痰、松弛平滑肌、镇痛抗炎、降压活血、抗肿瘤等药理活性[6-7]，其中生物碱类成分贝母辛、贝母素甲和贝母素乙是浙贝母的主要活性成分[8]。
中药配方颗粒作为一种新型的配方用药，与传统的中药饮片相比，具有剂量准确、质量稳定、便于贮存、携带服用方便等特点[8-9]。目前，中药配方颗粒尚缺乏统一的国家质量标准，加之药材/饮片质量存有差异、生产工艺各有不同，使得不同企业生产的配方颗粒的质量和药效参差不齐，无法保证其质量的一致性[10]。为此，国家药典委员会组织审定了部分中药配方颗粒的国家药品标准，形成了含有160种中药配方颗粒的国家药品标准草案[11]，旨在为中药配方颗粒的质量评价提供参考。浙贝母配方颗粒是以浙贝母饮片为原料，经水煎煮提取、浓缩、干燥、制粒等现代化生产工艺制成，具有止咳化痰、清热解毒的作用，对风热感冒引起的咳嗽疗效较好。但浙贝母配方颗粒不在上述标准草案中，且市售配方颗粒使用的是各生产企业的内部质量标准，故亟需建立控制其质量的统一标准。
由于中药配方颗粒经水煎煮后，失去了药材原有的特点，无法进行传统的性状鉴别，而中药指纹图谱分析技术是建立在中药化学成分研究基础上的一种综合的、可量化的鉴定方法，具有整体性和模糊性的特点，现已被广泛应用于中药材及其制剂的质量评价领域[12]。有研究指出，以指纹图谱作为检验手段可强化中药配方颗粒真伪鉴别及优劣评价的专属性[13]。目前，指纹图谱在浙贝母药材的质量评价和控制方面应用广泛[14-17]，而有关浙贝母配方颗粒的研究则主要集中在其处方、工艺优化以及贝母素甲、贝母素乙的含量测定等方面[8，16]。基于此，本研究建立了浙贝母配方颗粒的高效液相色谱（HPLC）指纹图谱，并同法测定了其中贝母辛、贝母素甲和贝母素乙等3种主要活性成分的含量，旨在为完善浙贝母配方颗粒质量评价和相关国家标准提供参考。
1 材料
1.1 主要仪器
本研究所用主要仪器有1260型HPLC仪及配套的在线脱气机、柱温箱、自动进样器、四元泵、蒸发光散射检测器（ELSD）和ChemStation Edition for LC（C.01.06版）数据处理工作站（美国Agilent公司），QUINTIX313-1CN型万分之一电子天平、MSE125S型十万分之一电子天平（德国Sartorius 公司），DZKW-S-6型电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器有限公司），Sigma 4-16S型高速离心机（德国Sigma公司）等。
1.2 主要药品与试剂
贝母辛对照品（批号PS200722-02，纯度≥98.0%）、贝母素甲对照品（批号PS000150，纯度≥98.0%）、贝母素乙对照品（批号PS011156，纯度≥98.0%）均购自成都普思生物科技股份有限公司;乙腈、甲醇为质谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯净水。
13批浙贝母配方颗粒（编号S1～S13）的来源信息如表1所示。将浙贝母配方颗粒研磨成粉，用自封袋密封，置于干燥器中保存，备用。
2 方法与结果
2.1 HPLC指纹图谱的建立
2.1.1 色谱条件 以Durashell C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm）为色谱柱，以乙腈（A）-0.03%二乙胺溶液（B）为流动相进行梯度洗脱（0～15 min，20%A→40%A;15～28 min，40%A;28～30 min，40%A→70%A;30～32 min，70%A→100%A;32～35 min，100%A;35～35.1 min，100%A→20%A）;流速为1.0 mL/min;柱温为35 ℃;进样量为20 ?L。检测器为ELSD，检测器增益为200;喷雾器模式为加热模式;动力级别为40%;漂移管温度为45 ℃;样品室温度为20 ℃;载气流速为2.0 L/min。
2.1.2 对照品贮备液的制备 精密称取贝母辛、贝母素甲、贝母素乙对照品各适量，分别置于5 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释，制成质量浓度分别为1.441、3.820、4.673 mg/mL的单一对照品贮备液。
2.1.3 供试品溶液的制备 取样品粉末约1.0 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加浓氨水5.0 mL使样品分散均匀，浸润1 h后，加入氯仿-甲醇混合溶液（4 ∶ 1，V/V）30 mL，混匀，置于90 ℃水浴中，加热回流2 h，冷却至室温后，将提取液转移至离心管中，以4 000 r/min离心5 min，取有机相，置于蒸发皿中蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至5 mL量瓶中，再用甲醇定容，摇匀，经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.1.4 精密度试验 取“2.1.3”项下供试品溶液（编号S1），按“2.1.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录色谱图。以贝母素乙为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，5个共有峰相对保留时间的RSD不高于1.05%（n=6），相对峰面积的RSD不高于1.76%（n=6），表明方法精密度良好。
2.1.5 重复性试验 取样品（编号S1）约1.0 g，共6份，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。以贝母素乙为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，5个共有峰相对保留时间的RSD不高于1.48%（n=6），相对峰面积的RSD不高于1.80%（n=6），表明方法重复性良好。 2.1.6 稳定性试验 取“2.1.3”项下供试品溶液（编号S1），分别于室温下放置0、2、4、8、16、24 h时按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。以贝母素乙为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，5个共有峰相对保留时间的RSD不高于1.62%（n=6），相对峰面积的RSD不高于1.94%（n=6），表明供试品溶液于室温下放置24 h内稳定性良好。
2.1.7 HPLC指纹图谱的建立 取13批样品，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》对13批样品的HPLC图谱进行分析，设定5个响应较高的色谱峰，选择MARK峰匹配法生成浙贝母配方颗粒的叠加指纹图谱和对照指纹图谱（R）。结果，13批浙贝母配方颗粒共有5个共有峰。结果见图1。
2.1.8 相似度的评价 采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》，以HPLC图谱共有模式为对照，计算13批样品的相似度。结果显示，13批样品与共有模式的相似度为0.669～0.971，表明不同生产企业样品的质量差异较大;但相同企业不同批次样品的相似度接近，表明同一企业的原料和生产工艺相对稳定。结果见表2。
2.1.9 共有峰的指认以及相对保留时间、相对峰面积的计算 通过与单一对照品（图略）比对，共指认了3个共有峰，分别为贝母辛（峰1）、贝母素甲（峰4）、贝母素乙（峰5）。由于贝母素乙的峰面积较大且周围基线平稳，干扰峰较少，故选择贝母素乙为参照，计算其余共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，各共有峰的出峰时间相对稳定，但峰面积差异较大，表明含量差异较大。结果见表3、表4。
2.2 贝母辛等3种成分的含量测定
2.2.1 色谱条件 同“2.1.1”项。
2.2.2 混合对照品溶液的制备 分别精密吸取“2.1.2”项下各单一对照品贮备液2.50 mL，置于10 mL量瓶中，用甲醇稀释，制成质量浓度分别为0.360、0.955、1.168 mg/mL的混合对照品溶液。
2.2.3 供试品溶液的制备 同“2.1.3”项。
2.2.4 空白对照溶液的制备 不加样品，按“2.1.3”项下“加浓氨水5.0 mL……取续滤液，即得”操作，制得空白对照溶液。
2.2.5 系统适用性试验 取上述混合对照品溶液、供试品溶液、空白对照溶液各适量，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图（图2）。结果显示，各成分色谱峰峰形尖锐且对称，以贝母素甲峰计理论板数均大于5 000，分离度均大于1.5，且空白对照无干扰。
2.2.6 线性关系考察 取“2.2.2”项下混合对照品溶液适量，用甲醇逐级稀释，制成贝母辛质量浓度分别为30.00、60.00、90.00、120.00、150.00、180.00 μg/mL，贝母素甲79.58、159.17、238.75、318.33、397.92、477.50 μg/mL，贝母素乙97.33、194.67、292.00、389.33、486.67、584.00 μg/mL的系列工作溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以各待测成分质量浓度的自然对数（X）为横坐标、峰面积的自然对数（Y）为纵坐标进行线性回归。结果见表5。
2.2.7 精密度试验 取“2.2.6”项下系列工作溶液（贝母辛、贝母素甲、贝母素乙质量浓度分别为60.00、159.17、194.67 μg/mL）适量，按“2.2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果显示，贝母辛、贝母素甲、贝母素乙峰面积的RSD分别为2.42%、1.01%、1.92%（n=6），表明仪器精密度良好。
2.2.8 重复性试验 取样品（编号S4）约1.0 g，共6份，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并按标准曲线法计算样品中各待测成分的含量。结果显示，贝母辛、贝母素甲、贝母素乙含量的RSD分别为2.61%、1.86%、2.88%（n=6），表明方法重复性良好。
2.2.9 稳定性试验 取“2.2.3”项下供试品溶液（编号S4），分别于室温下放置0、2、4、8、16、24 h时按“2.2.1”項下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果显示，贝母辛、贝母素甲、贝母素乙峰面积的RSD分别为1.70%、0.44%、0.81%（n=6），表明供试品溶液于室温下放置24 h内稳定性良好。
2.2.10 加样回收率试验 精密称取已知含量的样品（编号S4）0.5 g，共6份，分别加入“2.1.2”项下各单一对照品贮备液适量，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率。结果显示，贝母辛、贝母素甲、贝母素乙的平均加样回收率分别为95.82%、99.00%、95.39%，RSD分别为1.22%、1.98%、2.10%（n=6），表明方法准确度良好。结果见表6。
2.2.11 样品含量测定 取13批浙贝母配方颗粒样品，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并按标准曲线法计算样品中各待测成分的含量。每样品平行测定3次，结果见表7。
3 讨论
3.1 提取条件优化
本课题组参考相关文献[16]对浙贝母配方颗粒的提取方法进行考察。结果发现，当加入浓氨水2.0 mL水解浙贝母配方颗粒时出现了结块现象，导致水解不充分、提取不完全，故通过增加浓氨水量至5.0 mL以保证样品粉末充分浸润，提取率明显提高。样品回流结束后，本课题组分别采用滤纸过滤和离心两种方式对所得溶液进行处理，结果发现，滤纸过滤时的重复性较差，而采用离心时的准确度和重复性均较好。 3.2 指纹图谱分析
13批样品中共有5个共有峰，比秦建平等[17]、朱广磊等[18]关于浙贝母药材的指纹图谱研究结果少2～4个共有峰，其原因可能为浙贝母配方颗粒在制备过程中采用水提方式，导致某些脂溶性成分不能被充分提取[13]。13批浙贝母配方颗粒样品与共有模式的相似度为0.669～0.971，表明不同生产企业的配方颗粒质量差距较大，这可能跟浙贝母配方颗粒的生产工艺特别是样品相当于饮片量的不一致有关;相同企业不同批次浙贝母配方颗粒样品的相似度接近，提示相同生产企业的原料和生产工艺相对稳定。
3.3 样品含量结果分析
含量测定结果显示，13批不同生产企业浙贝母配方颗粒样品间的含量存在一定差异，而相同企业不同批次样品的含量基本一致。从总含量方面看，企业C、A的平均总含量最高，分别为5.02、4.61 mg/g，相差不大;企业E、B、D的平均总含量分别为3.48、3.02、1.87 mg/g，存在较大差异。从单个成分含量方面看，贝母辛为0.17～1.02 mg/g，贝母素甲为0.52～2.26 mg/g，贝母素乙为0.70～3.50 mg/g。同一成分含量在不同生产企业样品中的变化规律不同，如在企业A、C的样品中，贝母素乙含量最高，可达3.20 mg/g以上;其次是贝母辛，含量不低于0.81 mg/g;最低为贝母素甲，平均含量不足0.60 mg/g。在企业B、D、E的样品中，含量由高到低均为贝母素甲>贝母素乙>贝母辛，且这3家生产企业样品中的贝母素甲和贝母素乙含量略有差异，但贝母辛含量相当。引起差异的原因可能是不同生产企业的工艺不一致，所用浙贝母药材质量本身存在差异[19]。此外，笔者还发现，在浙贝母药材（配方颗粒）中易被忽略的生物碱成分贝母辛含量较高（因药典和相关文献[17-18]均未纳入该指标），特别是S1～S3、S7～S9样品中贝母辛的平均含量高达0.92 mg/g，约是同批贝母素甲的1.6倍，因此笔者认为可将其作为浙贝母配方颗粒的质量考察指标。
综上所述，所建指纹图谱和含量测定方法简便、可行，重复性好，可用于浙贝母配方颗粒的质量评价。
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（收稿日期：2021-05-27 修回日期：2021-08-24）
（编辑：陈 宏）