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摘要： 贝母为常用贵重中药材，药用历史悠久，我国贝母属植物已超过50种(变种)，全国各地用作贝母的原植物种类繁多，此外商品贝母中还常混有土贝母、唐菖蒲等伪品，严重影响了药品的安全性和有效性，由于贝母类药材的形态学上的差异较小，但是化学成分差异大，因此准确地鉴定贝母类药材的基源种类是一项极为重要的工作，为了探索贝母类药材的快速、准确的鉴别方法，运用分子标记技术鉴定川贝母的真伪，以克服目前仅依据形态、显微特征及理化进行鉴别的不足。
关键词： 川贝母；DNA；PCR 【中图分类号】R284 【文献标识码】B 【文章编号】1672-8602(2014)03-0196-01
川贝母系百合科植物川贝母Fritillaria cirrhosa D.Don、暗紫贝母Fritillaria unibracteata Hsiao et K.C.Hsia、甘肃贝母Fritillaria przewalskii Maxim.、梭砂贝母Fritillaria delavayi Franch.、太白贝母Fritillaria taipaiensis P.Y.Li或瓦布贝母Fritillaria unibracteata Hsiao et K.C.Hsia var.wabuensis（S.Y.Tang et S.C.Yue）Z.D.Liu.S.Wang et S.C.Chen的干燥鳞茎。按性状不同分别习称"松贝"、"青贝"、"炉贝"和"栽培品"。川贝母性微寒而味甘苦，入心肺经，能润肺、止咳、化痰，是一味珍贵的中药材。"中国药典"规定药用川贝母为以上6个品种，但我国贝母属植物已超过50种，造成贝母基源极为复杂，并且随着需求量的增加，基源混乱的现象呈现不断增加的趋势，直接影响川贝母临床用药的安全、疗效。运用分子标记技术鉴定川贝母的真伪，以克服目前仅依据形态、显微特征及理化进行鉴别的不足。使中药鉴定的手段从传统的形态表征扩展到了遗传物质DNA。特别是近年来微量DNA的PCR技术的应用发展，使分子生物学技术与方法以特异性强，稳定性好，微量、准确等特点，被广泛应用于近缘种、珍稀种、破碎药材等的鉴定。本实验应用分子生物学技术对川贝母进行了研究，建立了川贝母DNA分子标记鉴定方法，为川贝母与其伪品的鉴定提供了科学依据。
1 材料与仪器
1.1 药材:(1)伊贝母对照药材、平贝母对照药材、湖北贝母对照药材、浙贝母对照药材、川贝母对照药材（中国药品生物制品检定所）。(2)青贝、炉贝、浓蜜贝母（广西锦莹药业有限公司）。
1.2 试药: 新型植物基因组DNA快速提取试剂盒（北京艾德莱生物科技有限公司）；10×PCR緩冲液、二氯化镁（25mmol/L）、dNTP（10mmol/L）、鉴别引物：5ˊCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAA 3ˊ和5ˊGCTACGTTCTTCATCGAT 3ˊ、无菌超纯水、琼脂糖、50×TAE电泳缓冲液、DNA分子量标记物GM331（上海生工）；GelRed核酸凝胶染色剂（BIOTIUM）；高保真Taq DAN聚合酶（5U/μl）、10×酶切缓冲液、Sma I（10U/μl）（Fermentas）。
1.3 仪器:H1850型台式高速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；K960型热循环仪（杭州晶格仪器有限公司）；DYCP-31DN型电泳仪（北京六一仪器厂）；GSG-2000核酸/蛋白质凝胶成像仪（珠海黑马医学仪器有限公司）。
2 方法
2.1 模板DNA提取:取本品0.1g，依次用75%乙醇1ml、灭菌超纯水1ml清洗，吸干表面水分，置乳钵中研磨成极细粉。取20mg ，置1.5ml离心管中，用新型广谱植物基因组DNA快速提取试剂盒提取DNA[加入缓冲液AP1 400μl和RNA酶溶液（10mg/ml）4μl，涡漩振荡，65℃水浴加热10分钟，加入缓冲液AP2 130μl，充分混匀，冰浴冷却5分钟，离心（转速为每分钟14000转）10分钟；吸取上清液转移入另一离心管中，加入1.5倍体积的缓冲液AP3/E，混匀，加到吸附柱上，离心（转速为每分钟13000转）1分钟，弃去过滤液，加入漂洗液700μl，离心（转速为每分钟12000转）30秒，弃去过滤液；再加入漂洗液500μl，离心（转速为每分钟12000转）30秒，弃去过滤液；再离心（转速为每分钟13000转）2分钟，取出吸附柱，放入另一离心管中，加入50μl洗脱缓冲液，室温放置3～5分钟，离心（转速为每分钟12000转）1分钟,将洗脱液再加入吸附柱中，室温放置2分钟，离心（转速为每分钟12000转）1分钟]，取洗脱液，作为供试品溶液，置4℃冰箱中备用。另取川贝母对照药材0.1g，同法制成对照药材模板DNA溶液。
2.2 PCR-RFLP反应:鉴别引物：5ˊCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAA 3ˊ和5ˊGCTACGTTCTTCATCGAT 3ˊ。PCR反应体系：在200μl离心管中进行，反应总体积为30μl，反应体系包括10×PCR缓冲液3μl，二氯化镁（25mmol/L）2.4μl，dNTP（10mmol/L）0.6μl，鉴别引物（30μmol/L）各0.5μl，高保真Taq DAN聚合酶（5U/μl）0.2μl，模板1μl，无菌超纯水21.8μl。将离心管置PCR仪，PCR反应参数：95℃预变性4分钟，循环反应30次（95℃ 30秒，55～58℃ 30秒，72℃ 30秒），72℃延伸5分钟。取PCR反应液，置500μl离心管中，进行酶切反应，反应总体积为20μl，反应体系包括10×酶切缓冲液2μl，PCR反应液6μl，Sma I（10U/μl）0.5μl，无菌超纯水11.5μl，酶切反应在30℃水浴反应2小时。另取无菌超纯水，同法上述PCR-RFLP反应操作，作为空白对照。
2.3 电泳检测: 胶浓度为1.5%，胶中加入核酸凝胶染色剂GelRed；供试品与对照药材酶切反应溶液的上样量分别为8μl，DNA分子量标记上样量为1μl（0.5μg/μl）。电泳结束后，取凝胶片在凝胶成像仪上检视。
3 结果
注：1伊贝母对照药材、2平贝母对照药材、3湖北贝母对照药材、4浙贝母对照药材、5川贝母对照药材、6青贝、7炉贝、8浓蜜贝母、9空白、M分子量标记物（100～600bp）。经PCR扩增反应后，青贝、炉贝与川贝母对照药材凝胶电泳图谱相应的位置上，在100～250bp有两条DNA条带。伊贝母对照药材、平贝母对照药材、湖北贝母对照药材、浙贝母对照药材、浓蜜贝母与川贝母对照药材凝胶电泳图谱相应的位置上，在100～250bp无DNA条带。
4 讨论
由于本实验采用DNA吸附柱和新型独特的溶液系统，适合于从含酚类、多糖类和酶抑制物的制物样品中快速简单地提取基因组DNA。在此基础上采用聚合酶链式反应（PCR）技术对伊贝母、平贝母、湖北贝母、浙贝母、川贝母、青贝、炉贝、浓蜜贝母8种贝母进行扩增检测，结果表明，只有青贝、炉贝与引物有特异性的结合位点，不同产地的平贝母、、浙贝母、湖北贝母、伊贝母、浓蜜贝母与引物无特异性的结合位点。因此通过对8种贝母进行PCR分析，川贝母与其他贝母的DNA分子差异，实验结果重现性较好，为进一步发掘和充分利用贝母资源提供理论依据。
关键词： 川贝母；DNA；PCR 【中图分类号】R284 【文献标识码】B 【文章编号】1672-8602(2014)03-0196-01
川贝母系百合科植物川贝母Fritillaria cirrhosa D.Don、暗紫贝母Fritillaria unibracteata Hsiao et K.C.Hsia、甘肃贝母Fritillaria przewalskii Maxim.、梭砂贝母Fritillaria delavayi Franch.、太白贝母Fritillaria taipaiensis P.Y.Li或瓦布贝母Fritillaria unibracteata Hsiao et K.C.Hsia var.wabuensis（S.Y.Tang et S.C.Yue）Z.D.Liu.S.Wang et S.C.Chen的干燥鳞茎。按性状不同分别习称"松贝"、"青贝"、"炉贝"和"栽培品"。川贝母性微寒而味甘苦，入心肺经，能润肺、止咳、化痰，是一味珍贵的中药材。"中国药典"规定药用川贝母为以上6个品种，但我国贝母属植物已超过50种，造成贝母基源极为复杂，并且随着需求量的增加，基源混乱的现象呈现不断增加的趋势，直接影响川贝母临床用药的安全、疗效。运用分子标记技术鉴定川贝母的真伪，以克服目前仅依据形态、显微特征及理化进行鉴别的不足。使中药鉴定的手段从传统的形态表征扩展到了遗传物质DNA。特别是近年来微量DNA的PCR技术的应用发展，使分子生物学技术与方法以特异性强，稳定性好，微量、准确等特点，被广泛应用于近缘种、珍稀种、破碎药材等的鉴定。本实验应用分子生物学技术对川贝母进行了研究，建立了川贝母DNA分子标记鉴定方法，为川贝母与其伪品的鉴定提供了科学依据。
1 材料与仪器
1.1 药材:(1)伊贝母对照药材、平贝母对照药材、湖北贝母对照药材、浙贝母对照药材、川贝母对照药材（中国药品生物制品检定所）。(2)青贝、炉贝、浓蜜贝母（广西锦莹药业有限公司）。
1.2 试药: 新型植物基因组DNA快速提取试剂盒（北京艾德莱生物科技有限公司）；10×PCR緩冲液、二氯化镁（25mmol/L）、dNTP（10mmol/L）、鉴别引物：5ˊCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAA 3ˊ和5ˊGCTACGTTCTTCATCGAT 3ˊ、无菌超纯水、琼脂糖、50×TAE电泳缓冲液、DNA分子量标记物GM331（上海生工）；GelRed核酸凝胶染色剂（BIOTIUM）；高保真Taq DAN聚合酶（5U/μl）、10×酶切缓冲液、Sma I（10U/μl）（Fermentas）。
1.3 仪器:H1850型台式高速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；K960型热循环仪（杭州晶格仪器有限公司）；DYCP-31DN型电泳仪（北京六一仪器厂）；GSG-2000核酸/蛋白质凝胶成像仪（珠海黑马医学仪器有限公司）。
2 方法
2.1 模板DNA提取:取本品0.1g，依次用75%乙醇1ml、灭菌超纯水1ml清洗，吸干表面水分，置乳钵中研磨成极细粉。取20mg ，置1.5ml离心管中，用新型广谱植物基因组DNA快速提取试剂盒提取DNA[加入缓冲液AP1 400μl和RNA酶溶液（10mg/ml）4μl，涡漩振荡，65℃水浴加热10分钟，加入缓冲液AP2 130μl，充分混匀，冰浴冷却5分钟，离心（转速为每分钟14000转）10分钟；吸取上清液转移入另一离心管中，加入1.5倍体积的缓冲液AP3/E，混匀，加到吸附柱上，离心（转速为每分钟13000转）1分钟，弃去过滤液，加入漂洗液700μl，离心（转速为每分钟12000转）30秒，弃去过滤液；再加入漂洗液500μl，离心（转速为每分钟12000转）30秒，弃去过滤液；再离心（转速为每分钟13000转）2分钟，取出吸附柱，放入另一离心管中，加入50μl洗脱缓冲液，室温放置3～5分钟，离心（转速为每分钟12000转）1分钟,将洗脱液再加入吸附柱中，室温放置2分钟，离心（转速为每分钟12000转）1分钟]，取洗脱液，作为供试品溶液，置4℃冰箱中备用。另取川贝母对照药材0.1g，同法制成对照药材模板DNA溶液。
2.2 PCR-RFLP反应:鉴别引物：5ˊCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAA 3ˊ和5ˊGCTACGTTCTTCATCGAT 3ˊ。PCR反应体系：在200μl离心管中进行，反应总体积为30μl，反应体系包括10×PCR缓冲液3μl，二氯化镁（25mmol/L）2.4μl，dNTP（10mmol/L）0.6μl，鉴别引物（30μmol/L）各0.5μl，高保真Taq DAN聚合酶（5U/μl）0.2μl，模板1μl，无菌超纯水21.8μl。将离心管置PCR仪，PCR反应参数：95℃预变性4分钟，循环反应30次（95℃ 30秒，55～58℃ 30秒，72℃ 30秒），72℃延伸5分钟。取PCR反应液，置500μl离心管中，进行酶切反应，反应总体积为20μl，反应体系包括10×酶切缓冲液2μl，PCR反应液6μl，Sma I（10U/μl）0.5μl，无菌超纯水11.5μl，酶切反应在30℃水浴反应2小时。另取无菌超纯水，同法上述PCR-RFLP反应操作，作为空白对照。
2.3 电泳检测: 胶浓度为1.5%，胶中加入核酸凝胶染色剂GelRed；供试品与对照药材酶切反应溶液的上样量分别为8μl，DNA分子量标记上样量为1μl（0.5μg/μl）。电泳结束后，取凝胶片在凝胶成像仪上检视。
3 结果
注：1伊贝母对照药材、2平贝母对照药材、3湖北贝母对照药材、4浙贝母对照药材、5川贝母对照药材、6青贝、7炉贝、8浓蜜贝母、9空白、M分子量标记物（100～600bp）。经PCR扩增反应后，青贝、炉贝与川贝母对照药材凝胶电泳图谱相应的位置上，在100～250bp有两条DNA条带。伊贝母对照药材、平贝母对照药材、湖北贝母对照药材、浙贝母对照药材、浓蜜贝母与川贝母对照药材凝胶电泳图谱相应的位置上，在100～250bp无DNA条带。
4 讨论
由于本实验采用DNA吸附柱和新型独特的溶液系统，适合于从含酚类、多糖类和酶抑制物的制物样品中快速简单地提取基因组DNA。在此基础上采用聚合酶链式反应（PCR）技术对伊贝母、平贝母、湖北贝母、浙贝母、川贝母、青贝、炉贝、浓蜜贝母8种贝母进行扩增检测，结果表明，只有青贝、炉贝与引物有特异性的结合位点，不同产地的平贝母、、浙贝母、湖北贝母、伊贝母、浓蜜贝母与引物无特异性的结合位点。因此通过对8种贝母进行PCR分析，川贝母与其他贝母的DNA分子差异，实验结果重现性较好，为进一步发掘和充分利用贝母资源提供理论依据。