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摘要：以信阳稻区水稻育种的主要亲本为试验材料，利用RAPD分子标记技术对其遗传多样性进行分析。结果表明，筛选出的17条多态性引物在43份水稻材料中共有126個位点条带，其中多态性条带有118条，其多态性比率为93.6%；每个引物可扩增出3～8条多态性条带，平均产生多态性条带5.5条。43个品种（品系）间遗传相似系数变化范围为0.402～0.937。基于RAPD标记，利用NTSYS.pc2.11构建了聚类树状图谱，遗传距离为0.68，将43 份水稻资源聚成4大类群。该研究为信阳水稻种质资源的鉴定及水稻新品种的选育等方面提供重要依据。
关键词：水稻；种质资源；RAPD；遗传多样性；聚类分析
中图分类号： S511.032 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0113-03
水稻是人类最重要的粮食作物之一，世界上超过一半的人口以其为主食[1]。 河南省信阳稻区常年种植水稻面积在 43.3万hm2 以上，约占全省水稻种植面积的70%，是河南水稻的主产区。目前，对信阳地区水稻的研究主要集中在高产栽培及病虫害防治方面[2-4]，而对水稻种质资源分子遗传多样性的研究非常薄弱。水稻种质资源是水稻育种的基础，充分了解和掌握当地资源的丰度、差异性、亲缘关系等是培育水稻品种的必要条件。随机扩增多态性DNA （RAPD） 技术于1990年由美国Williams首先报道[5]，该技术是建立在PCR基础上的一种可对整个未知序列的基因进行多态性分析的分子技术。由于具有DNA用量少、灵敏度高、快捷、检测容易和标记的数量多等优点，已被广泛应用于评价水稻种质的遗传多样性和亲缘关系[6-9]。
对现有材料进行遗传多样性研究，可有效减少相似遗传背景的组合，减少育种的工作量，对于亲本的杂交组合配置具有重要的指导意义[10]。本研究拟以信阳稻区保存的43份水稻亲本为试验材料，选用40条RAPD 随机引物对供试材料扩增，旨在从DNA分子水平上探讨这些材料之间的遗传多样性程度，从而为信阳地区水稻育种实践提供理论指导。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试的水稻种质43份，包括42份常规粳稻和1份常规籼稻；有7份审定品种，其他36份为中间育种材料。材料编号、名称及来源见表1。材料均由信阳农林学院水稻研究所提供。
1.2 试验方法
1.2.1 水稻基因组DNA的提取 将收集的水稻种子在实验室中发苗，然后取幼嫩的新鲜叶片，采用CTAB （十六烷基三甲基溴化铵）法提取叶片基因组 DNA，-20 ℃保存备用。
1.2.2 RAPD引物的筛选 选出40条10个碱基长度的寡核苷酸随机引物[6-7]，委托江苏南京金斯瑞生物科技公司合成。对上述提取后的样本基因组DNA进行RAPD 预扩增，从中筛选出多态性高、条带清晰和重复性好的引物。
1.2.3 RAPD反应体系及扩增程序 反应体系包括10 μL 2×Power Taq PCR Master Mix（北京百泰克生物技术有限公司，内含Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2以及反应缓冲液等），20～50 ng DNA模板，1 μL（10 mmol/L）引物，补双蒸水至总体积20 μL。扩增程序如下：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，36 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，45个循环；72 ℃延伸5 min。采用1.5%的琼脂糖凝胶（加入Gold View I型核酸染色剂）电泳检测PCR扩增产物。
1.2.4 数据的统计与分析 DNA图谱中，在同一迁移位置，有DNA扩增带的量化为1，无扩增带的量化为0，列出二元数据矩阵。应用NTSYSpc2.10e统计分析软件计算品种间的遗传相似系数（genetic similarity，GS），根据遗传相似系数的数据集，采用UPGMA（非加权配对算术平均法）构建遗传关系树状图。
2 结果与分析
2.1 RAPD标记结果分析
从50条引物当中筛选出了17条扩增稳定、多态性丰富的引物（表2）。所有的材料共扩增出126条带，其中多态性条带118条，占总扩增片段的93.6%。每个引物可扩增出 3～11条多态性条带，平均产生多态性条带6.9条（图1）。由表2可知，扩增位点最少的引物是Rp16，仅有3个扩增位点。图1显示17条引物在43个水稻品种中的多态性比率均高于80%，可用于水稻种质资源的品种鉴定及亲缘关系分析。如图1是利用引物Rp15 得到的部分材料的RAPD标记图谱。
2.2 不同材料间的遗传相似性分析
根据17条引物在43份供试材料中所获得的126条扩增条带，应用NTSYSpc2.10软件包计算供试品种间的遗传相似系数。所有供试品种间的遗传相似系数变化范围为0.402～0.937，材料间表现出显著的遗传变异。淮稻12与长香粳之间的遗传相似系数（GS=0.402）最小，反应出两者的遗传异质性较大；P078和黄金晴之间的遗传系数高达0.937，表明这2个材料间的遗传相似性较大；香宝3号（表1中编号为5）籼稻与大部分供试品种具有很大的差异性，遗传相似系数在04～0.7之间。
2.3 聚类分析
由图2可知，当以遗传相似系数0.68为阈值时，43份常规稻材料可以分为四大类。第Ⅰ类包含24份材料。以遗传相似系数0.73为阈值，24份材料可分为2个亚组，分别以Ⅰ-1、Ⅰ-2表示。Ⅰ-1组包括香粳33等23个品种，由表1可知，这23个品种均为粳稻，且来源地大多为河南信阳。Ⅰ-2组类仅包括1份材料：黑香糯192（编号为25），米粒黑色，为常规粳稻。第Ⅱ类中只有香宝3号（编号为5）1份材料，为常规籼稻。第Ⅲ类包括武香粳等16个品种。第Ⅳ类包括2份材料：伊拉泰104（编号为28）和津稻293（编号为29）。 3 讨论
3.1 水稻材料间遗传多样性
本研究对43份水稻材料的遗传多样性分析中，17个引物共扩增出126条带，其中多态性条带118条，多态性程度达到约93.6%，远高于49份旱稻（81.6%）[6]和贵州19份水稻（84%）[7]的遗传多样性。如此高的遗传多态性，一方面与本研究材料的来源地广泛有关：不仅有国内，还有国外材料，40份常规稻来自于国内4个省（河南、江苏、天津和安徽），其余3份常规稻分别来源于法国、美国和日本；另一方面和材料的性状类型丰富有关：试验材料除了普通常规稻外，还有旱稻、
香稻和黑稻等材料。从多态性比例看，本研究的43份材料存在着较大的遗传差异和丰富的遗传多样性，这正是进行杂交育种可利用的遗传资源。
3.2 43份水稻材料的聚类分析
本试验的聚类结果基本反应了材料间的系谱关系。当以遗传相似系数0.69为阈值，43份常规稻亲本材料可以分为4大类，其中香宝3号（5号）单独聚为一类，原因是42份材料均为粳稻，而5号为籼稻。这与王英等利用RAPD对49份旱稻种质的的聚类结果[6]相一致。同一单位的育成品种遗传差异较小，容易归为一类[11]；来自信阳农林学院的10份水稻聚到第Ⅰ类，4份材料聚到了第Ⅲ类。本研究材料中共有17份香稻，其中16份聚到第一大类，表明这些香稻具有一致的遗传背景和起源。然而，白现广等对云南的 10个香稻品种、45个非香稻地方栽培品种利用SSR进行聚类，发现10个香稻品种并没有聚在一起[12]，这与云南现有的香稻栽培品种并非为单一的遗传来源，而是从多个祖先分别起源有关。
RAPD标记是从分子水平上揭示种质间的遗传差异，比传统的遗传标记准确度要高，因此本研究采用RAPD技术分析43份水稻材料的遗传多样性。近年来，随着水稻基因组测序的完成，另一种分子标记技术简单重复序列SSR正被广泛应用于水稻遗传多样性的研究中[13-15]。分类收集更多的信阳水稻种质，结合不同的分子标记方法和农艺性状对其进行多样性分析将是下一步研究的内容。
参考文献：
[1]Tian Z X，Qian Q，Liu Q Q，et al.Allelic diversities in rice starch biosynthesis lead to a diverse array of rice eating and cooking qualities[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2009，106（51）：21760-21765.
[2]陳俊华，熊建伟，史洪中，等. 频振式杀虫灯对信阳稻区水稻害虫的控制作用[J]. 河南农业科学，2015，44（3）：93-96.
[3]宁万光，谢 瑛，史洪中，等. 信阳水稻稻瘟病发生规律及基于灰色预测模型的预测预报[J]. 江苏农业科学，2014，42（6）：89-90.
[4]雷振山，肖荣英，卫云飞，等. 豫南丘陵区施氮与密度对水稻产量及氮肥利用率的影响[J]. 湖北农业科学，2014，53（14）：3247-3250.
[5]Williams J G K，Kubelik A R，Liark K J，et al.DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic marker[J]. Nucleic Acid Res，1990，18（2）：6531-6535.
[6]王 英，叶 通，邱海燕，等. 49份旱稻种质RAPD标记遗传多样性分析[J]. 中国农学通报，2011，27（24）：21-28.
[7]陶 刚，刘作易，朱 英，等. 贵州优质水稻的遗传多样性RAPD分析[J]. 贵州农业科学，2005，33（1）：10-12.
[8]Skaria R，Sen S，Muneer P M A.Analysis of genetic variability in rice varieties （Oryza sativa L.） of Kerala using RAPD markers[J]. Genetic Engineering and Biotechnology Journal，2011（1）：1-9.
[9]Sadia T，Zahida H P，Ashiq R.Molecular characterization of traditional and improved rice cultivars based on random amplified polymorphic DNAs （RAPDs） markers[J]. African Journal of Biotechnology，2012，11（45）：10297-10304.
[10]赖 勇，王鹏喜，范贵强，等. 大麦SSR标记遗传多样性及其与农艺性状关联分析[J]. 中国农业科学，2013，46（2）：233-242.
[11]鈕玉伟，杨志刚，罗 兵，等. 太湖稻区 32 个水稻品种 DNA 指纹图谱的构建及遗传多样性分析[J]. 安徽农业科学，2014，42（36）：12833-12835.
[12]白现广，程在全，蔺忠龙，等. 云南地方香稻与非香稻遗传多样性比较[J]. 安徽农业科学，2009，37（6）：2404-2406.
[13]邓宏中，王彩红，徐 群，等. 中国水稻地方品种与选育品种的遗传多样性比较分析[J]. 植物遗传资源学报，2015，16（3）：433-442.
[14]刘承晨，赵富伟，吴晓霞，等. 云南哈尼梯田当前栽培水稻遗传多样性及群体结构分析[J]. 中国水稻科学，2015，29（1）：28-34.
[15]陈惠清，黄荣裕，王天生，等. 水稻种质资源的籼粳分类及遗传多样性分析[J]. 杂交水稻，2014，29（6）：62-67.
关键词：水稻；种质资源；RAPD；遗传多样性；聚类分析
中图分类号： S511.032 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0113-03
水稻是人类最重要的粮食作物之一，世界上超过一半的人口以其为主食[1]。 河南省信阳稻区常年种植水稻面积在 43.3万hm2 以上，约占全省水稻种植面积的70%，是河南水稻的主产区。目前，对信阳地区水稻的研究主要集中在高产栽培及病虫害防治方面[2-4]，而对水稻种质资源分子遗传多样性的研究非常薄弱。水稻种质资源是水稻育种的基础，充分了解和掌握当地资源的丰度、差异性、亲缘关系等是培育水稻品种的必要条件。随机扩增多态性DNA （RAPD） 技术于1990年由美国Williams首先报道[5]，该技术是建立在PCR基础上的一种可对整个未知序列的基因进行多态性分析的分子技术。由于具有DNA用量少、灵敏度高、快捷、检测容易和标记的数量多等优点，已被广泛应用于评价水稻种质的遗传多样性和亲缘关系[6-9]。
对现有材料进行遗传多样性研究，可有效减少相似遗传背景的组合，减少育种的工作量，对于亲本的杂交组合配置具有重要的指导意义[10]。本研究拟以信阳稻区保存的43份水稻亲本为试验材料，选用40条RAPD 随机引物对供试材料扩增，旨在从DNA分子水平上探讨这些材料之间的遗传多样性程度，从而为信阳地区水稻育种实践提供理论指导。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试的水稻种质43份，包括42份常规粳稻和1份常规籼稻；有7份审定品种，其他36份为中间育种材料。材料编号、名称及来源见表1。材料均由信阳农林学院水稻研究所提供。
1.2 试验方法
1.2.1 水稻基因组DNA的提取 将收集的水稻种子在实验室中发苗，然后取幼嫩的新鲜叶片，采用CTAB （十六烷基三甲基溴化铵）法提取叶片基因组 DNA，-20 ℃保存备用。
1.2.2 RAPD引物的筛选 选出40条10个碱基长度的寡核苷酸随机引物[6-7]，委托江苏南京金斯瑞生物科技公司合成。对上述提取后的样本基因组DNA进行RAPD 预扩增，从中筛选出多态性高、条带清晰和重复性好的引物。
1.2.3 RAPD反应体系及扩增程序 反应体系包括10 μL 2×Power Taq PCR Master Mix（北京百泰克生物技术有限公司，内含Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2以及反应缓冲液等），20～50 ng DNA模板，1 μL（10 mmol/L）引物，补双蒸水至总体积20 μL。扩增程序如下：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，36 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，45个循环；72 ℃延伸5 min。采用1.5%的琼脂糖凝胶（加入Gold View I型核酸染色剂）电泳检测PCR扩增产物。
1.2.4 数据的统计与分析 DNA图谱中，在同一迁移位置，有DNA扩增带的量化为1，无扩增带的量化为0，列出二元数据矩阵。应用NTSYSpc2.10e统计分析软件计算品种间的遗传相似系数（genetic similarity，GS），根据遗传相似系数的数据集，采用UPGMA（非加权配对算术平均法）构建遗传关系树状图。
2 结果与分析
2.1 RAPD标记结果分析
从50条引物当中筛选出了17条扩增稳定、多态性丰富的引物（表2）。所有的材料共扩增出126条带，其中多态性条带118条，占总扩增片段的93.6%。每个引物可扩增出 3～11条多态性条带，平均产生多态性条带6.9条（图1）。由表2可知，扩增位点最少的引物是Rp16，仅有3个扩增位点。图1显示17条引物在43个水稻品种中的多态性比率均高于80%，可用于水稻种质资源的品种鉴定及亲缘关系分析。如图1是利用引物Rp15 得到的部分材料的RAPD标记图谱。
2.2 不同材料间的遗传相似性分析
根据17条引物在43份供试材料中所获得的126条扩增条带，应用NTSYSpc2.10软件包计算供试品种间的遗传相似系数。所有供试品种间的遗传相似系数变化范围为0.402～0.937，材料间表现出显著的遗传变异。淮稻12与长香粳之间的遗传相似系数（GS=0.402）最小，反应出两者的遗传异质性较大；P078和黄金晴之间的遗传系数高达0.937，表明这2个材料间的遗传相似性较大；香宝3号（表1中编号为5）籼稻与大部分供试品种具有很大的差异性，遗传相似系数在04～0.7之间。
2.3 聚类分析
由图2可知，当以遗传相似系数0.68为阈值时，43份常规稻材料可以分为四大类。第Ⅰ类包含24份材料。以遗传相似系数0.73为阈值，24份材料可分为2个亚组，分别以Ⅰ-1、Ⅰ-2表示。Ⅰ-1组包括香粳33等23个品种，由表1可知，这23个品种均为粳稻，且来源地大多为河南信阳。Ⅰ-2组类仅包括1份材料：黑香糯192（编号为25），米粒黑色，为常规粳稻。第Ⅱ类中只有香宝3号（编号为5）1份材料，为常规籼稻。第Ⅲ类包括武香粳等16个品种。第Ⅳ类包括2份材料：伊拉泰104（编号为28）和津稻293（编号为29）。 3 讨论
3.1 水稻材料间遗传多样性
本研究对43份水稻材料的遗传多样性分析中，17个引物共扩增出126条带，其中多态性条带118条，多态性程度达到约93.6%，远高于49份旱稻（81.6%）[6]和贵州19份水稻（84%）[7]的遗传多样性。如此高的遗传多态性，一方面与本研究材料的来源地广泛有关：不仅有国内，还有国外材料，40份常规稻来自于国内4个省（河南、江苏、天津和安徽），其余3份常规稻分别来源于法国、美国和日本；另一方面和材料的性状类型丰富有关：试验材料除了普通常规稻外，还有旱稻、
香稻和黑稻等材料。从多态性比例看，本研究的43份材料存在着较大的遗传差异和丰富的遗传多样性，这正是进行杂交育种可利用的遗传资源。
3.2 43份水稻材料的聚类分析
本试验的聚类结果基本反应了材料间的系谱关系。当以遗传相似系数0.69为阈值，43份常规稻亲本材料可以分为4大类，其中香宝3号（5号）单独聚为一类，原因是42份材料均为粳稻，而5号为籼稻。这与王英等利用RAPD对49份旱稻种质的的聚类结果[6]相一致。同一单位的育成品种遗传差异较小，容易归为一类[11]；来自信阳农林学院的10份水稻聚到第Ⅰ类，4份材料聚到了第Ⅲ类。本研究材料中共有17份香稻，其中16份聚到第一大类，表明这些香稻具有一致的遗传背景和起源。然而，白现广等对云南的 10个香稻品种、45个非香稻地方栽培品种利用SSR进行聚类，发现10个香稻品种并没有聚在一起[12]，这与云南现有的香稻栽培品种并非为单一的遗传来源，而是从多个祖先分别起源有关。
RAPD标记是从分子水平上揭示种质间的遗传差异，比传统的遗传标记准确度要高，因此本研究采用RAPD技术分析43份水稻材料的遗传多样性。近年来，随着水稻基因组测序的完成，另一种分子标记技术简单重复序列SSR正被广泛应用于水稻遗传多样性的研究中[13-15]。分类收集更多的信阳水稻种质，结合不同的分子标记方法和农艺性状对其进行多样性分析将是下一步研究的内容。
参考文献：
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[11]鈕玉伟，杨志刚，罗 兵，等. 太湖稻区 32 个水稻品种 DNA 指纹图谱的构建及遗传多样性分析[J]. 安徽农业科学，2014，42（36）：12833-12835.
[12]白现广，程在全，蔺忠龙，等. 云南地方香稻与非香稻遗传多样性比较[J]. 安徽农业科学，2009，37（6）：2404-2406.
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