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摘要 [目的]以长白山区鸡爪苓菌丝为材料，通过SMART技术构建全长cDNA文库。[方法]采用Trizol reagent试剂盒提取菌丝体总RNA，通过LD-PCR反转录合成双链cDNA，连接至载体λTriplEx2，构建鸡爪苓菌丝体全长cDNA文库。[结果]经测定，原始文库的滴度为1.66×106 pfu/ml，重组率为96.97%，扩增文库的滴度为1.504×1010 pfu/ml，插入片段主要分布于500～2 000 bp。[结论]成功构建了鸡爪苓菌丝cDNA，为鸡爪苓生长分化的分子机制研究提供理论基础。
关键词 鸡爪苓；菌丝体；cDNA文库；构建
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）35-12418-03
鸡爪苓是我国长白山区特有的野生猪苓（Polyponus umbellatus （Pers.） Fr）种属，其菌核体形细长，分枝较多，表面多褶皱，形如鸡爪[1-4]。XING等[5]通过对产自不同地区猪苓菌核的 nrDNA ITS 和 28S rRNA（LSU）序列进行比对分析后，提出鸡爪苓与陕西等地所产猪苓的种内遗传背景不同，应列为单独类群。猪苓菌核是由大量菌丝体相互缠绕组成的休眠体，也是其药用部位，具有利尿渗湿、免疫调节、抗肿瘤的作用[6-9]。目前，国内针对猪苓的研究主要集中于化学活性物质的分离纯化、药理活性的测定和遗传分类等方面，有关猪苓分子生物学方面的研究较少，刘开辉等[10]通过rDNA，ITS（1，2）序列分析研究了不同地区猪苓的亲缘关系，宋超等[11]克隆猪苓拟核cDNA，得到溶血素全长cDNA。
cDNA文库即生物在某个发育时期内所转录的全部mRNA经反转录形成的cDNA片段与载体连接而形成的包含全部mRNA信息的cDNA克隆集合[12]，主要包括全长cDNA文库、均一化cDNA文库和消减cDNA文库。全长cDNA文库的构建、测序和功能注释是了解生物体结构和功能的重要方法[13]。笔者采用SMART技术，MMLV-RT反转录酶作用微量总RNA，快速构建了鸡爪苓菌丝体全长cDNA文库，为研究鸡爪苓生长分化的分子机制提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
鸡爪苓菌丝体由采自长白山区野生鸡爪苓菌核经组织分离后得到，菌株经纯化后保存于延边大学微生物学与免疫学教学实验中心。
Trizol reagent 购于Invitrogen公司，SMARTTM cDNA Library Construction Kit User Manual，Advantage 2 PCR Kit购于clontech公司，MaxPlaxTM Lambda Packaging Extracts购于Epicentre公司。
1.2 方法
1.2.1
鸡爪苓菌丝体总RNA的提取。取经纯培养7、14、21、28 d的鸡爪苓菌丝体，用液氮研磨成粉末（3次），加入1 ml Trizol，按照Trizol reagent说明书提取鸡爪苓菌丝体的总RNA，-80 ℃保存备用。
1.2.2
SMART法合成cDNA。加入总RNA、SMART Ⅳ Oligonucleotide、CDS Ⅲ/3’PCR Primer，轻轻混匀后72 ℃水浴2 min，冰浴2 min。再加入5×First-Strand Buffer、DTT、dNTP Mix、SMARTScribe MMLV RT，42 ℃水浴1 h，合成First-Strand cDNA。取2 μl First-Strand cDNA至PCR管，加入去离子水、10×Advantage 2 PCR buffer、50×dNTP Mix、5′PCR Primer、CDS Ⅲ/3′PCR Primer和50×Advantage 2 Polymerase Mix。轻轻混匀后进行LD-PCR，反应条件：95 ℃ 1 min、95 ℃ 15 s、68 ℃ 6 min，22个循环，合成ds cDNA，4 ℃保存备用。
1.2.3
cDNA的纯化与酶切。将PCR产物用Proteinase K消化，酚仿抽提浓缩，用SfiⅠ酶切。采用CHROMA SPIN-400柱进行分级分离，收集单滴组分于16个离心管中，1%琼脂糖凝胶电泳检测分级分离结果，收集大于500 bp的基因片段组分，用醋酸钠、糖原和95%乙醇浓缩，溶解于7 μl去离子水中，-20 ℃保存备用。
1.2.4
λTripIEx2载体的连接。分别取0.5、1.0 μl cDNA与1 μl λTripIEx混合，加入T4连接酶，16 ℃过夜。混合2管连接产物，包装蛋白MaxPlaxTM Lambda Packaging Extracts包装连接产物，加入600 μl噬菌体稀释缓冲液，25 μl氯仿，振荡混匀，去沉淀，即为原始文库。
1.2.5
原始文库的检测。将原始文库稀释10倍后，取1、10 μl与200 μl XL1-Blue的菌悬液混合，37 ℃孵育15 min，再加入IPTG和X-Gal各50 μl，移至3 ml顶层琼脂培养基，均匀倾倒于LB/MgSO4平板，37 ℃培养，检测噬菌斑蓝白斑数。
1.2.6
文库的扩增及检测。取10 μl原始文库与500 μl XL1-Blue的菌悬液混匀，37 ℃孵育15 min，移至3 ml顶层琼脂培养基，均匀倾倒于LB/MgSO4平板，37 ℃培养10 h，每个平板加10 ml噬菌体稀释缓冲液，4 ℃过夜，室温振荡1 h后收集缓冲液，分装至50 ml离心管，加入10 ml氯仿，7 000 r/min离心10 min，取上清，即为已扩增鸡爪苓菌丝体cDNA文库，保存备用。参照“1.2.5”滴定扩增的文库（不加IPTG和X-Gal）。随机选取23个噬菌斑，加入400 μl噬菌体稀释缓冲液，4 ℃过夜。取1 μl模板进行PCR鉴定。PCR反应条件：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，72 ℃ 10 min；30个循环。 1.2.7
EST分析。取5 μl鸡爪苓菌丝体全长cDNA文库，转入质粒pTriplEx2载体。随机选取20个单个菌落，采用菌落PCR检测转入成功率。根据PCR结果，选择6个片段较长的cDNA进行EST分析。
2 结果与分析
2.1 鸡爪苓菌丝体总RNA的提取
参照Trizol reagent试剂盒说明书，提取鸡爪苓菌丝体总RNA（图1）。结果显示，菌丝体培养时间不同，总RNA的产率不同。7、14 d鸡爪苓菌丝体总RNA的产量较高，分别为144.156、220.104 μg，28S与18S条带清晰，比例约为1.5∶1.0。鸡爪苓菌丝体培养21和28 d产量较低，分别为71.638、3.580 μg，28S与18S条带清晰，比例约为1.5∶1.0。
2.2 鸡爪苓菌丝体的cDNA合成
用MMLV Reverse Transcriptase将鸡爪苓菌丝体总RNA反转录合成cDNA第一链，通过LD-PCR合成双链cDNA。电泳检测，cDNA弥散于500～2 500 bp（图2），符合cDNA文库建库标准。
2.3 cDNA片段的分级分离
鸡爪苓菌丝体cDNA经SfiI酶切后，用CHROMA SPIN-400柱进行分级分离，结果显示在第7管开始出现cDNA（图3），收集第7～10个离心管内cDNA，纯化浓缩。
2.4 文库的滴度与插入片段的PCR检测
原始文库的滴度为1.66×106 pfu/ml，蓝白斑筛选重组率为96.97%，扩增文库的滴度为3.88×109 pfu/ml，达到文库构建标准。随机选取23个噬菌斑的PCR检测，PCR产物主要位于500～1 000 bp（图4），符合EST测序的需要。
2.5 EST序列的分析
挑选5个单克隆，命名为cbsjzl1-5，（GenBank accession number：KM406240-KM406244），进行测序。5个单克隆均含有ORF和UTR，其中4个ESTs存在高相似度的序列，并有相对应的蛋白质超家族，参与跨膜转运、信号转导、细胞的发育及分化等功能。
3 结论与讨论
cDNA文库是生物体某一时刻表达基因的集合，是获取新基因的重要手段，已广泛应用于不同生长阶段基因表达变化的研究、某特定发育期基因表达情况及获取组织特异性基因等方面[14-15]。影响cDNA文库质量的因素较多，mRNA的完整性、cDNA小片段及合适的载体都会对cDNA文库的代表性造成影响。该试验中，采取Trizol法可高效快速提取鸡爪苓菌丝体总RNA，降低mRNA的降解。通过CHROMA SPIN-400层析柱将cDNA分级分离，并选择合适的cDNA片段。选择λTripIEx作为载体，可提高某些低丰度基因的筛选率[16]。该试验成功构建了鸡爪苓菌丝体全长cDNA文库，可进行大规模的EST序列分析，为研究长白山区鸡爪苓的遗传特异性、探索鸡爪苓生长分化的分子机制提供理论基础。
参考文献
[1]
许广波，李艳茹，李太元，等.两个猪苓菌株生长速度及酯酶同工酶比较研究[J].微生物学通报，2006，33（3）： 57-59.
[2] 许广波，李太元，李艳茹.药用真菌猪苓研究热点的进展[J].延边大学农学学报，2012，34（3）：262-265.
[3] 许广波，金敏，梁运江，等.长白山鸡爪苓子实体的组织分离培养及其酯酶同工酶分析[J].延边大学农学学报，2013，35（4）：284-288.
[4] 李艳茹，王健，于海茹，等.不同氮源对长白山鸡爪苓菌丝体生长及几种胞外酶活性的影响[J].延边大学农学学报，2011，33（1）：1-5.
[5] XING X K，MA X T，HART M M，et al.Genetic Diversity and Evolution of Chinese Traditional Medicinal Fungus Polyporus umbellatus （Polyporales， Basidiomycota）[J].PLOS ONE，2013，8（3）：1-10.
[6] 戚淑威，赵琪，程远辉，等 .猪苓的研究进展[J].云南农业科技，2011（5）：5-7.
[7] ZHOU W W， GUO S X.Studies on the chemical constituents of the Sclerotia of Polyporus umbellatus[J].Acta Pharmaceutica Sinica， 2007， 42： 249-253.
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[9] WI YOUNG LEE， YOUNGKI PARK， JIN-KWON AHN.Cytotoxic activity of ergosta-4， 6， 8（14）， 22- tetraen-3-one from the Sclerotia of Polyporus umbellarus[J].Bull Korean Chem Soc，2005，26：1464-1466.
[10] 刘开辉，邓百万，陈文强，等.比较DNA序列分析不同猪苓菌种的亲缘关系[J].食用菌学报，2009，16（3）：11-13.
[11] 宋超，郭顺星.药用真菌猪苓溶血素基因克隆和序列分析[J].菌物学报，2013，32（4）： 690-697.
[12] 朱利军，长孙东亭，罗素兰.cDNA文库在药用海洋生物研究中的应用[J].中国海洋杂志，2009，28（1）：53-58.
[13] 晏惹君，黄兴奇，程在全.cDNA文库构建策略及其分析研究进展[J].云南农业大学学报，2006，21（1）：1-6.
[14] PONGSOMBOON S， WONGPANYA R， TANG S， et al.Abundantly expressed transcripts in the lymphoid organ of the black tiger shrimp， Penaeus monodon， and their implication in immune function[J].Fish Shellfish Immunol，2008，25：485-493.
[15] 叶波平， 管悦， 许媛媛， 等.木榄幼苗叶片cDNA 文库的构建及其表达序列标签分析[J].热带亚热带植物学报，2010，18（2）：140-150.
[16] 姚冬生，管敏，赵龙，等.产黄曲霉毒素解毒酶真菌（E-20）cDNA文库的构建[J].广东药学院学报，2004，20（1）：45-48.
关键词 鸡爪苓；菌丝体；cDNA文库；构建
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）35-12418-03
鸡爪苓是我国长白山区特有的野生猪苓（Polyponus umbellatus （Pers.） Fr）种属，其菌核体形细长，分枝较多，表面多褶皱，形如鸡爪[1-4]。XING等[5]通过对产自不同地区猪苓菌核的 nrDNA ITS 和 28S rRNA（LSU）序列进行比对分析后，提出鸡爪苓与陕西等地所产猪苓的种内遗传背景不同，应列为单独类群。猪苓菌核是由大量菌丝体相互缠绕组成的休眠体，也是其药用部位，具有利尿渗湿、免疫调节、抗肿瘤的作用[6-9]。目前，国内针对猪苓的研究主要集中于化学活性物质的分离纯化、药理活性的测定和遗传分类等方面，有关猪苓分子生物学方面的研究较少，刘开辉等[10]通过rDNA，ITS（1，2）序列分析研究了不同地区猪苓的亲缘关系，宋超等[11]克隆猪苓拟核cDNA，得到溶血素全长cDNA。
cDNA文库即生物在某个发育时期内所转录的全部mRNA经反转录形成的cDNA片段与载体连接而形成的包含全部mRNA信息的cDNA克隆集合[12]，主要包括全长cDNA文库、均一化cDNA文库和消减cDNA文库。全长cDNA文库的构建、测序和功能注释是了解生物体结构和功能的重要方法[13]。笔者采用SMART技术，MMLV-RT反转录酶作用微量总RNA，快速构建了鸡爪苓菌丝体全长cDNA文库，为研究鸡爪苓生长分化的分子机制提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
鸡爪苓菌丝体由采自长白山区野生鸡爪苓菌核经组织分离后得到，菌株经纯化后保存于延边大学微生物学与免疫学教学实验中心。
Trizol reagent 购于Invitrogen公司，SMARTTM cDNA Library Construction Kit User Manual，Advantage 2 PCR Kit购于clontech公司，MaxPlaxTM Lambda Packaging Extracts购于Epicentre公司。
1.2 方法
1.2.1
鸡爪苓菌丝体总RNA的提取。取经纯培养7、14、21、28 d的鸡爪苓菌丝体，用液氮研磨成粉末（3次），加入1 ml Trizol，按照Trizol reagent说明书提取鸡爪苓菌丝体的总RNA，-80 ℃保存备用。
1.2.2
SMART法合成cDNA。加入总RNA、SMART Ⅳ Oligonucleotide、CDS Ⅲ/3’PCR Primer，轻轻混匀后72 ℃水浴2 min，冰浴2 min。再加入5×First-Strand Buffer、DTT、dNTP Mix、SMARTScribe MMLV RT，42 ℃水浴1 h，合成First-Strand cDNA。取2 μl First-Strand cDNA至PCR管，加入去离子水、10×Advantage 2 PCR buffer、50×dNTP Mix、5′PCR Primer、CDS Ⅲ/3′PCR Primer和50×Advantage 2 Polymerase Mix。轻轻混匀后进行LD-PCR，反应条件：95 ℃ 1 min、95 ℃ 15 s、68 ℃ 6 min，22个循环，合成ds cDNA，4 ℃保存备用。
1.2.3
cDNA的纯化与酶切。将PCR产物用Proteinase K消化，酚仿抽提浓缩，用SfiⅠ酶切。采用CHROMA SPIN-400柱进行分级分离，收集单滴组分于16个离心管中，1%琼脂糖凝胶电泳检测分级分离结果，收集大于500 bp的基因片段组分，用醋酸钠、糖原和95%乙醇浓缩，溶解于7 μl去离子水中，-20 ℃保存备用。
1.2.4
λTripIEx2载体的连接。分别取0.5、1.0 μl cDNA与1 μl λTripIEx混合，加入T4连接酶，16 ℃过夜。混合2管连接产物，包装蛋白MaxPlaxTM Lambda Packaging Extracts包装连接产物，加入600 μl噬菌体稀释缓冲液，25 μl氯仿，振荡混匀，去沉淀，即为原始文库。
1.2.5
原始文库的检测。将原始文库稀释10倍后，取1、10 μl与200 μl XL1-Blue的菌悬液混合，37 ℃孵育15 min，再加入IPTG和X-Gal各50 μl，移至3 ml顶层琼脂培养基，均匀倾倒于LB/MgSO4平板，37 ℃培养，检测噬菌斑蓝白斑数。
1.2.6
文库的扩增及检测。取10 μl原始文库与500 μl XL1-Blue的菌悬液混匀，37 ℃孵育15 min，移至3 ml顶层琼脂培养基，均匀倾倒于LB/MgSO4平板，37 ℃培养10 h，每个平板加10 ml噬菌体稀释缓冲液，4 ℃过夜，室温振荡1 h后收集缓冲液，分装至50 ml离心管，加入10 ml氯仿，7 000 r/min离心10 min，取上清，即为已扩增鸡爪苓菌丝体cDNA文库，保存备用。参照“1.2.5”滴定扩增的文库（不加IPTG和X-Gal）。随机选取23个噬菌斑，加入400 μl噬菌体稀释缓冲液，4 ℃过夜。取1 μl模板进行PCR鉴定。PCR反应条件：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，72 ℃ 10 min；30个循环。 1.2.7
EST分析。取5 μl鸡爪苓菌丝体全长cDNA文库，转入质粒pTriplEx2载体。随机选取20个单个菌落，采用菌落PCR检测转入成功率。根据PCR结果，选择6个片段较长的cDNA进行EST分析。
2 结果与分析
2.1 鸡爪苓菌丝体总RNA的提取
参照Trizol reagent试剂盒说明书，提取鸡爪苓菌丝体总RNA（图1）。结果显示，菌丝体培养时间不同，总RNA的产率不同。7、14 d鸡爪苓菌丝体总RNA的产量较高，分别为144.156、220.104 μg，28S与18S条带清晰，比例约为1.5∶1.0。鸡爪苓菌丝体培养21和28 d产量较低，分别为71.638、3.580 μg，28S与18S条带清晰，比例约为1.5∶1.0。
2.2 鸡爪苓菌丝体的cDNA合成
用MMLV Reverse Transcriptase将鸡爪苓菌丝体总RNA反转录合成cDNA第一链，通过LD-PCR合成双链cDNA。电泳检测，cDNA弥散于500～2 500 bp（图2），符合cDNA文库建库标准。
2.3 cDNA片段的分级分离
鸡爪苓菌丝体cDNA经SfiI酶切后，用CHROMA SPIN-400柱进行分级分离，结果显示在第7管开始出现cDNA（图3），收集第7～10个离心管内cDNA，纯化浓缩。
2.4 文库的滴度与插入片段的PCR检测
原始文库的滴度为1.66×106 pfu/ml，蓝白斑筛选重组率为96.97%，扩增文库的滴度为3.88×109 pfu/ml，达到文库构建标准。随机选取23个噬菌斑的PCR检测，PCR产物主要位于500～1 000 bp（图4），符合EST测序的需要。
2.5 EST序列的分析
挑选5个单克隆，命名为cbsjzl1-5，（GenBank accession number：KM406240-KM406244），进行测序。5个单克隆均含有ORF和UTR，其中4个ESTs存在高相似度的序列，并有相对应的蛋白质超家族，参与跨膜转运、信号转导、细胞的发育及分化等功能。
3 结论与讨论
cDNA文库是生物体某一时刻表达基因的集合，是获取新基因的重要手段，已广泛应用于不同生长阶段基因表达变化的研究、某特定发育期基因表达情况及获取组织特异性基因等方面[14-15]。影响cDNA文库质量的因素较多，mRNA的完整性、cDNA小片段及合适的载体都会对cDNA文库的代表性造成影响。该试验中，采取Trizol法可高效快速提取鸡爪苓菌丝体总RNA，降低mRNA的降解。通过CHROMA SPIN-400层析柱将cDNA分级分离，并选择合适的cDNA片段。选择λTripIEx作为载体，可提高某些低丰度基因的筛选率[16]。该试验成功构建了鸡爪苓菌丝体全长cDNA文库，可进行大规模的EST序列分析，为研究长白山区鸡爪苓的遗传特异性、探索鸡爪苓生长分化的分子机制提供理论基础。
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