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摘要： 为提高支气管败血波氏菌保护性抗原BcfA重组蛋白的表达量和可溶性，对编码BcfA N端373位氨基酸残基之后的BcfA基因碱基序列进行了克隆和表达，截短后的BcfA表达量提高了10倍，且主要为可溶性表达。Western blot结果显示，截短BcfA表达后的重组蛋白与支气管败血波氏菌感染康复血清反应依然明显。免疫保护力试验结果表明截短BcfA表达的重组蛋白依然对支气管败血波氏菌表现出良好的免疫保护作用。
关键词： 支气管败血波氏菌;波氏菌黏附因子A（BcfA）;截短表达;保护性抗原
中图分类号： S858.291.63 文献标识码： A 文章编号： 1000-4440（2021）03-0699-05
Recombinant protein expressed from BcfA in Bordetella bronchiseptica and its immune activity analysis
ZHU Wei-feng1，2，3， TAN Kai1，2，3， WANG Fang1，2，3， CHENG Xu1，2，3， QIU Ru-long1，2，3， FAN Zhi-yu1，2，3，CHEN Lu1，2，3
（1.Institute of Veterinary Medicine， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China;2.Key Laboratory of Veterinary Biological Engineering and Technology， Ministry of Agriculture and Rural affairs， Nanjing 210014， China;3.National Center for Engineering Research of Veterinary Bio-products， Nanjing 210014， China）
Abstract： To improve the expression and solubility of BcfA recombinant protein of a protective antigen against Bordetella bronchiseptica， the base sequence of BcfA gene encoding amino acid residues of the N-terminal after the 373rd position was cloned and expressed. The expression of shortened BcfA was increased by ten times， and the expression form was mainly soluble. Western blot results showed that the truncated protein encoded by BcfA still exhibited obvious reaction with convalescent serum infected by Bordetella bronchiseptica. The results of immunoprotection test showed that recombinant protein expressed from truncated BcfA still showed good immunoprotection against Bordetella bronchiseptica.
Key words： Bordetella bronchiseptica;Bordetella adhesion factor A （BcfA）;truncated expression;protective antigen
支氣管败血波氏菌（Bordetella bronchiseptica）是一种能感染多种哺乳动物、引起动物发生鼻炎和肺炎的革兰氏阴性细小杆菌。此菌以犬、猪及兔的感染最为普遍，常导致犬传染性支气管炎、猪传染性萎缩性鼻炎和兔支气管败血波氏菌病。此外，支气管败血波氏菌和其他病原体之间存在协同作用，从而增加其他原发性和继发性病原体引起的呼吸道疾病的严重程度，对养殖业造成较大经济损失[1]。此外，人类也可以发生支气管败血波氏菌感染[2-3]。
目前已经研制或有报道的支气管败血波氏菌病疫苗主要包括灭活疫苗、弱毒疫苗和亚单位疫苗3种。与灭活疫苗和弱毒疫苗相比，亚单位疫苗具有安全、稳定和可以借助基因工程手段大量生产的优点，正成为兽用疫苗研究的重要方向[4-5]。支气管败血波氏菌的波氏菌黏附因子A（Bordetella colonization factor A， BcfA）蛋白是一种和细菌定殖有关的外膜蛋白，具有良好的免疫保护力，是支气管败血波氏菌亚单位疫苗研制的重要候选抗原[6-7]。但是BcfA重组蛋白的表达量不高，而且主要以包涵体形式表达，这不利于其临床应用。本研究的目的是通过对BcfA进行截短表达，从而获得一种表达量高、可溶性好、且较好地保留了原BcfA全长蛋白免疫活性的重组蛋白。
1 材料和方法
1.1 质粒、菌种及培养
质粒载体pET28a（ ）、基因工程宿主菌BL21 （DE3）、支气管败血波氏菌BJL0504（分离于患鼻炎的家兔）由江苏省农业科学院兔病团队保存并提供。胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）（添加10%小牛血清）、胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）（添加4.0%小牛血清、0.2%羊血）购自青岛海博生物有限公司，用于波氏菌培养。LB液体或固体培养基购自青岛海博生物有限公司，用于培养大肠基因工程宿主菌。 1.2 蛋白质氨基酸序列分析
以GenBank公布的支气管败血波氏菌NCTC8344 株全基因组序列中的BcfA基因序列为参考序列进行分析。使用SignalP5.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）确定信号肽序列。使用Bepipred-2.0（http：//tools.immuneepitope.org/bcell/）确定BcfA的B细胞表位分布情况。多序列比对使用在线软件Clustal Omega（http：//www.clustal.org/omega/）完成，比较本试验所用的BcfA蛋白氨基酸序列和NCTC8344 株参考序列之间的相似性。
1.3 BcfA基因的克隆
以支气管败血波氏菌NCTC8344 株的BcfA基因序列为参考序列，设计引物373T-F（CAGCAAATGGGTCGCGGATCCACGATCGCGCGCGTCGATAC，字母下有横线的为与载体相同的同源臂，下同）和373T-R（GCAAGCTTGTCGACGGAGCTCTCCCA￣G￣C￣A￣G￣G￣C￣C￣GCCCTC）扩增截短的BcfA碱基序列，45Q-F（ CAGCAAATGGGTCGCGGATCCCAGGGG￣G￣C￣G￣C￣C￣G￣T￣C￣T￣T￣T￣C）和45Q-R（GCAAGCTTGTCGA￣C￣G￣G￣A￣G￣C￣T￣C￣T￣C￣C￣C￣A￣G￣CAGGCCGCCCTC）扩增成熟的全长BcfA碱基序列。使用试剂盒[8]提取支气管败血波氏菌BJL0504菌株全基因组DNA模板。然后对目的基因片段进行PCR扩增。使用Ban H I和Hind III限制性内切酶酶切质粒后按照试剂盒（南京诺唯赞公司产品）说明书的要求进行同源重组连接，将BcfA的PCR扩增DNA片段连接到质粒载体PET28a（ ）上。待重组质粒转入BL21（DE3）宿主工程菌以后，将PCR鉴定的阳性克隆送至南京擎科公司测序，进一步验证连接的正确性及所克隆基因的完整性。
1.4 表达、纯化及鉴定
对BcfA工程菌进行异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达并优化诱导条件，包括比较不同IPTG浓度（0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L）的诱导效果和比较不同温度（16 ℃、28 ℃、37 ℃）下的诱导表达效果。对过夜诱导表达后的工程菌使用超声波裂解破碎，然后高速离心并分别收集裂解液上清液和包涵体沉淀，进行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。电泳结束后使用考马斯亮蓝对凝胶染色以检测表达效果。按照Ni磁珠（南京金斯瑞公司产品）说明书的要求操作，使用250 mmol/L咪唑洗脱纯化目的重组蛋白。通过Bradford法测定纯化后的蛋白质浓度进而估测重组蛋白表达量。
1.5 BcfA重组蛋白与支气管败血波氏菌感染康复血清反应的检测
将BcfA重组蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳后再转到NC膜上。使用5%的脱脂乳过夜封闭后，加入由实验室提前制备并保存的BJL0504株兔感染康复血清（1/500），于37 ℃下孵育1 h。经过磷酸盐吐温缓冲液（PBST）彻底漂洗后，在37 ℃下孵育HRP偶联羊抗兔IgG（1/10 000）1 h。最后经过PBST彻底洗涤以后，进行电化学发光（ECL）显色。
1.6 小鼠免疫与血清抗体检测
取30 只4～6 周龄 C57BL/6雌鼠，随机分成3组，1组对照，2组试验，每组 10 只。试验组分别免疫BcfA截短重组蛋白（BcfA-373T）和BcfA全长重组蛋白（BcfA-45Q）。试验组首次免疫使用弗氏完全佐剂，加强免疫使用弗氏不完全佐剂，2次免疫间隔21 d。抗原剂量为每只100 μg。对照组使用PBS代替重组蛋白，其他处理与试验组相同。所有小鼠于第2次免疫10 d后采集制备小鼠血清，测定抗体产生情况。以纯化的BcfA重组蛋白包被ELISA板（每孔1 μg），37 ℃孵育2 h，彻底洗涤3次以后，使用5%的脱脂乳于37 ℃下封闭1 h，然后37 ℃下孵育待检血清（1/200）1 h，以PBST彻底洗涤后37 ℃下孵育HRP偶联的羊抗鼠二抗30 min，经过5遍洗涤以后加入100 μl TMB单组分显色液（湖州英创公司产品）显色并读数。
1.7 攻毒试验
ELISA检测确认特异性抗体产生后进行攻毒试验。参照文献[6]的方法开展试验，仅做少量必要的修改。取处于对数生长末期的支气管败血波氏菌菌液按照每只1.5×107CFU（35 μl）的剂量对小鼠滴鼻攻毒，攻毒7 d后的小鼠脱颈椎处死，无菌解剖取出肺脏，使用组织研磨仪充分研磨肺脏组织后，对样品进行连续稀释计数，计算每只小鼠的肺脏组织载菌量。并对肺脏内的细菌进行菌落形态学观察和PCR鉴定[8]。
1.8 数据处理与统计学检验
试验数据均使用平均值±标准差来表示。用t检验检测试验组和对照组的统计学差异，差异显著判定标准为P
关键词： 支气管败血波氏菌;波氏菌黏附因子A（BcfA）;截短表达;保护性抗原
中图分类号： S858.291.63 文献标识码： A 文章编号： 1000-4440（2021）03-0699-05
Recombinant protein expressed from BcfA in Bordetella bronchiseptica and its immune activity analysis
ZHU Wei-feng1，2，3， TAN Kai1，2，3， WANG Fang1，2，3， CHENG Xu1，2，3， QIU Ru-long1，2，3， FAN Zhi-yu1，2，3，CHEN Lu1，2，3
（1.Institute of Veterinary Medicine， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China;2.Key Laboratory of Veterinary Biological Engineering and Technology， Ministry of Agriculture and Rural affairs， Nanjing 210014， China;3.National Center for Engineering Research of Veterinary Bio-products， Nanjing 210014， China）
Abstract： To improve the expression and solubility of BcfA recombinant protein of a protective antigen against Bordetella bronchiseptica， the base sequence of BcfA gene encoding amino acid residues of the N-terminal after the 373rd position was cloned and expressed. The expression of shortened BcfA was increased by ten times， and the expression form was mainly soluble. Western blot results showed that the truncated protein encoded by BcfA still exhibited obvious reaction with convalescent serum infected by Bordetella bronchiseptica. The results of immunoprotection test showed that recombinant protein expressed from truncated BcfA still showed good immunoprotection against Bordetella bronchiseptica.
Key words： Bordetella bronchiseptica;Bordetella adhesion factor A （BcfA）;truncated expression;protective antigen
支氣管败血波氏菌（Bordetella bronchiseptica）是一种能感染多种哺乳动物、引起动物发生鼻炎和肺炎的革兰氏阴性细小杆菌。此菌以犬、猪及兔的感染最为普遍，常导致犬传染性支气管炎、猪传染性萎缩性鼻炎和兔支气管败血波氏菌病。此外，支气管败血波氏菌和其他病原体之间存在协同作用，从而增加其他原发性和继发性病原体引起的呼吸道疾病的严重程度，对养殖业造成较大经济损失[1]。此外，人类也可以发生支气管败血波氏菌感染[2-3]。
目前已经研制或有报道的支气管败血波氏菌病疫苗主要包括灭活疫苗、弱毒疫苗和亚单位疫苗3种。与灭活疫苗和弱毒疫苗相比，亚单位疫苗具有安全、稳定和可以借助基因工程手段大量生产的优点，正成为兽用疫苗研究的重要方向[4-5]。支气管败血波氏菌的波氏菌黏附因子A（Bordetella colonization factor A， BcfA）蛋白是一种和细菌定殖有关的外膜蛋白，具有良好的免疫保护力，是支气管败血波氏菌亚单位疫苗研制的重要候选抗原[6-7]。但是BcfA重组蛋白的表达量不高，而且主要以包涵体形式表达，这不利于其临床应用。本研究的目的是通过对BcfA进行截短表达，从而获得一种表达量高、可溶性好、且较好地保留了原BcfA全长蛋白免疫活性的重组蛋白。
1 材料和方法
1.1 质粒、菌种及培养
质粒载体pET28a（ ）、基因工程宿主菌BL21 （DE3）、支气管败血波氏菌BJL0504（分离于患鼻炎的家兔）由江苏省农业科学院兔病团队保存并提供。胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）（添加10%小牛血清）、胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）（添加4.0%小牛血清、0.2%羊血）购自青岛海博生物有限公司，用于波氏菌培养。LB液体或固体培养基购自青岛海博生物有限公司，用于培养大肠基因工程宿主菌。 1.2 蛋白质氨基酸序列分析
以GenBank公布的支气管败血波氏菌NCTC8344 株全基因组序列中的BcfA基因序列为参考序列进行分析。使用SignalP5.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）确定信号肽序列。使用Bepipred-2.0（http：//tools.immuneepitope.org/bcell/）确定BcfA的B细胞表位分布情况。多序列比对使用在线软件Clustal Omega（http：//www.clustal.org/omega/）完成，比较本试验所用的BcfA蛋白氨基酸序列和NCTC8344 株参考序列之间的相似性。
1.3 BcfA基因的克隆
以支气管败血波氏菌NCTC8344 株的BcfA基因序列为参考序列，设计引物373T-F（CAGCAAATGGGTCGCGGATCCACGATCGCGCGCGTCGATAC，字母下有横线的为与载体相同的同源臂，下同）和373T-R（GCAAGCTTGTCGACGGAGCTCTCCCA￣G￣C￣A￣G￣G￣C￣C￣GCCCTC）扩增截短的BcfA碱基序列，45Q-F（ CAGCAAATGGGTCGCGGATCCCAGGGG￣G￣C￣G￣C￣C￣G￣T￣C￣T￣T￣T￣C）和45Q-R（GCAAGCTTGTCGA￣C￣G￣G￣A￣G￣C￣T￣C￣T￣C￣C￣C￣A￣G￣CAGGCCGCCCTC）扩增成熟的全长BcfA碱基序列。使用试剂盒[8]提取支气管败血波氏菌BJL0504菌株全基因组DNA模板。然后对目的基因片段进行PCR扩增。使用Ban H I和Hind III限制性内切酶酶切质粒后按照试剂盒（南京诺唯赞公司产品）说明书的要求进行同源重组连接，将BcfA的PCR扩增DNA片段连接到质粒载体PET28a（ ）上。待重组质粒转入BL21（DE3）宿主工程菌以后，将PCR鉴定的阳性克隆送至南京擎科公司测序，进一步验证连接的正确性及所克隆基因的完整性。
1.4 表达、纯化及鉴定
对BcfA工程菌进行异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达并优化诱导条件，包括比较不同IPTG浓度（0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L）的诱导效果和比较不同温度（16 ℃、28 ℃、37 ℃）下的诱导表达效果。对过夜诱导表达后的工程菌使用超声波裂解破碎，然后高速离心并分别收集裂解液上清液和包涵体沉淀，进行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。电泳结束后使用考马斯亮蓝对凝胶染色以检测表达效果。按照Ni磁珠（南京金斯瑞公司产品）说明书的要求操作，使用250 mmol/L咪唑洗脱纯化目的重组蛋白。通过Bradford法测定纯化后的蛋白质浓度进而估测重组蛋白表达量。
1.5 BcfA重组蛋白与支气管败血波氏菌感染康复血清反应的检测
将BcfA重组蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳后再转到NC膜上。使用5%的脱脂乳过夜封闭后，加入由实验室提前制备并保存的BJL0504株兔感染康复血清（1/500），于37 ℃下孵育1 h。经过磷酸盐吐温缓冲液（PBST）彻底漂洗后，在37 ℃下孵育HRP偶联羊抗兔IgG（1/10 000）1 h。最后经过PBST彻底洗涤以后，进行电化学发光（ECL）显色。
1.6 小鼠免疫与血清抗体检测
取30 只4～6 周龄 C57BL/6雌鼠，随机分成3组，1组对照，2组试验，每组 10 只。试验组分别免疫BcfA截短重组蛋白（BcfA-373T）和BcfA全长重组蛋白（BcfA-45Q）。试验组首次免疫使用弗氏完全佐剂，加强免疫使用弗氏不完全佐剂，2次免疫间隔21 d。抗原剂量为每只100 μg。对照组使用PBS代替重组蛋白，其他处理与试验组相同。所有小鼠于第2次免疫10 d后采集制备小鼠血清，测定抗体产生情况。以纯化的BcfA重组蛋白包被ELISA板（每孔1 μg），37 ℃孵育2 h，彻底洗涤3次以后，使用5%的脱脂乳于37 ℃下封闭1 h，然后37 ℃下孵育待检血清（1/200）1 h，以PBST彻底洗涤后37 ℃下孵育HRP偶联的羊抗鼠二抗30 min，经过5遍洗涤以后加入100 μl TMB单组分显色液（湖州英创公司产品）显色并读数。
1.7 攻毒试验
ELISA检测确认特异性抗体产生后进行攻毒试验。参照文献[6]的方法开展试验，仅做少量必要的修改。取处于对数生长末期的支气管败血波氏菌菌液按照每只1.5×107CFU（35 μl）的剂量对小鼠滴鼻攻毒，攻毒7 d后的小鼠脱颈椎处死，无菌解剖取出肺脏，使用组织研磨仪充分研磨肺脏组织后，对样品进行连续稀释计数，计算每只小鼠的肺脏组织载菌量。并对肺脏内的细菌进行菌落形态学观察和PCR鉴定[8]。
1.8 数据处理与统计学检验
试验数据均使用平均值±标准差来表示。用t检验检测试验组和对照组的统计学差异，差异显著判定标准为P