【摘 要】
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目的检测人胰岛样生长因子Ⅰ基因转染骨髓基质细胞的效果及目的基因的表达情况,寻找一种改良组织工程种子细胞的新方法.方法抽取成年雄性山羊髂嵴骨髓,贴壁分离法接种培养骨
【机 构】
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上海第二医科大学附属第九人民医院骨科,山东大学药学院
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目的检测人胰岛样生长因子Ⅰ基因转染骨髓基质细胞的效果及目的基因的表达情况,寻找一种改良组织工程种子细胞的新方法.方法抽取成年雄性山羊髂嵴骨髓,贴壁分离法接种培养骨髓基质细胞,检测细胞生长特性.取第2代细胞,按3∶ 1比例用FuGene6转染试剂介导,将重组真核表达质粒pIRES2-EGFP-hIGF-Ⅰ(EGFP为增强绿色荧光蛋白,hIGF-Ⅰ为人胰岛素样生长因子Ⅰ)转染骨髓基质细胞,转染后4～72h和传代后分别用倒置荧光显微镜观察标志基因增强绿荧光蛋白的表达情况,计算转染效率.酶联免疫吸附试验检测培养上清液中hIGF-Ⅰ的浓度变化.转染细胞爬片行hIGF-Ⅰ免疫组化染色检测hIGF-Ⅰ的表达.提取转染后48h的细胞总RNA,RT-PCR检测hIGF-Ⅰ和内核糖体进入位点(IRES)的表达. 收集转染前及转染后48h的细胞行流式细胞仪检测细胞周期分布及荧光表达情况.结果成年山羊骨髓基质细胞在接种后24h开始贴壁,伸展成长梭形,原代细胞呈集簇状分布.在转染后4 h即有细胞表达绿色荧光蛋白,荧光强度和表达细胞总数在48 h达高峰,72h时见部分细胞荧光强度下降,传代后仍可观察到EGFP的表达.转染后4～72 h转染上清液中分泌hIGF-Ⅰ的浓度呈逐渐上升趋势,在72h最高可达34.75 ng/ml.转染后部分细胞形态发生变化.hIGF-Ⅰ免疫组化染色证实在胞浆中有大量棕黄色颗粒.RT-PCR证实有与hIGF-ⅠcDNA和IRES大小相符条带出现.流式细胞仪检测表明转染后骨髓基质细胞S期比例增加,荧光检测转染效率约22%.结论使用FuGene6转染试剂可有效地转染体外培养的成年山羊骨髓基质细胞.在较长时间内有较高浓度的hIGF-Ⅰ蛋白质分泌入培养上清.hIGF-Ⅰ基因转染可促进骨髓基质细胞的增殖、分化.
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