【摘 要】
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目的:通过获取核心蛋白聚糖(decorin,DCN)基因,构建DCN真核表达载体和DCN逆转病毒载体,以探索今后肾脏疾病基因治疗的途径.方法:从大鼠肾脏组织中抽取RNA,经逆转录-PCR方法,
【机 构】
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上海第二医科大学附属瑞金医院肾脏科,上海,200025;上海第二医科大学人类基因治疗研究中心;
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目的:通过获取核心蛋白聚糖(decorin,DCN)基因,构建DCN真核表达载体和DCN逆转病毒载体,以探索今后肾脏疾病基因治疗的途径.方法:从大鼠肾脏组织中抽取RNA,经逆转录-PCR方法,扩增核心蛋白聚糖cDNA,并经序列测定正确后,将DCN插入真核表达载体pcDNA3,应用Lipofectamine介导将pcDNA3-DCN转染真核细胞COS-7细胞,并于转染后48、72和96h用ELISA方法测定细胞上清液DCN的表达量;进一步将DCN插入逆转录病毒载体pLXSN,抽提质粒,应用EcoRI和XhoI双酶切,选出阳性克隆,经大量质粒抽提、纯化后进一步鉴定插入DNA片段的正确性.结果:测序载体pBluescriptⅡ与DCN连接后检测DCN序列结果正确,从而获得DCN基因序列;经Lipofectamine介导转染COS-7细胞,于转染后72h细胞上清液DCN的蛋白量明显增加.pLXSN-DCN酶切后,电泳可见1.1kb的条带,提示DCN插入pLXSN成功.结论:本研究所构建的真核表达载体pcDNA3-DCN在体外COS-7细胞可短暂表达DCN,并成功地采用逆转录病毒载体pLXSN(克隆位点在5-病毒长末端区(5-LTR)的下游,插入的目的基因受5-LTR启动子调控),通过EcoRI和XhoI酶切位点插入而获得核心蛋白聚糖逆转录病毒载体pLXSN-DCN.
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