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摘要：目的：探讨甘草黄酮对大强度耐力运动大鼠肾脏组织细胞凋亡及Bax(促凋亡基因，B apoptosis cell、Bcl-2(B细胞淋巴瘤基因-2，B cell lymphoma gene-2)蛋白表达的影响。方法选取SD雄性健康大鼠24只，随机分为安静组、太强度运动组和运动加药组；采用跑台训练6周后取材，应用免疫组织化学法测检测各组大鼠肾脏组织细胞凋亡及Bax和Bcl-2蛋白表达的变化。结果：与安静对照组相比，大强度耐力运动组和运动加药组大鼠细胞凋亡指数AI均有不同程度增加；大强度运动组Bax、Bcl－2蛋白表达(MOD)均呈非常显著差异性(P<0.01)，运动加药组Bax蛋白表达(MOD)均呈非常显著差异性(P<0.01)；运动加药组Bd-2蛋白表达(MOD)与大强度运动组具有非常显著差异性(P<0.01)；大强度运动组和运动加药组Bax／Bcl-2比值分布呈不同程度的显著差异性(P<0.05，P<0.01)。结论：甘草黄酮能够提高大强度运动大鼠抗氧化能力，降低肾脏组织自由基的产生，抑制肾脏组织细胞的凋亡。
关键词：甘草黄酮；大强度耐力训练；肾脏；细胞凋亡；Bax；Bcl-2
中图分类号：G804.7
文献标识码：A
文章编号：1007-3612(2011)02-0061-04
随着竞技体育的迅猛发展，运动训练强度和量以及竞赛周期的增多，探索和利用运动营养补剂，减轻或消除运动疲劳、增强运动技能一直是运动训练学和营养学领域研究的热点之一。甘草黄酮是从甘草提取物中得到的一类生物活性较强的成分，现代中药学研究表明，甘草黄酮具有抗肿瘤，抗氧化，抗病原微生物作用、解毒、抗炎、抗病毒、增强免疫机能等作用。众多研究表明，急性、大强度运动及过度训练将引起肾脏缺血再灌注，诱导肾脏细胞凋亡增加，也可能是造成运动性疲劳和运动性蛋白尿发生的原因之一。目前关于中药补剂对大强度耐力运动肾脏组织的影响报道尚无，本实验通过建立大强度耐力运动大鼠模型和补充甘草黄酮的实验手段，采用透射电镜和生化检测等手段观察和分析了甘草黄酮对大鼠肾脏组织细胞凋亡及Bax、Bal-2蛋白表达的影响，为进一步研究运动营养补剂对机体肾脏的保护机制提供理论依据。
1 材料与方法
1.1实验动物及其分组Sprague－Dawley(SD)雄性健康大鼠36只，体重180～220g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。国家标准啮齿类动物干燥饲料喂养，自由饮食，动物室湿度23％±5℃，相对湿度40％～70％，分笼饲养备用。
1.2实验模型建立实验动物适应性饲养7d后，以以15m／min、5min／d运动量对动物进行为期3d的筛选，淘汰个别不适应跑台训练者。选取其中大鼠24只随机分为安静对照组、大强度运动对照组和运动加药组，每组8只。甘草黄酮购自西安天一生物制品公司，棕黄色粉末，其中总黄酮糖苷含量为75％。加药组采用甘草黄酮溶于蒸馏水溶液中，灌胃加药，用量为300mg／kg／d，其它组采用灌服同等量的蒸馏水作为对照。每天训练前以15m／min的速度做适应运动5min后正式训练，训练模型基于Bedford模型结合实际略加调整，共为期6周(表1)。
1.3动物的处死、取材及样品制备方法
1.3.1动物处死与取材第6周训练最后一天，用乙醚麻醉后，断头处死，取肾脏组织置于预冷的生理盐水中洗净血污后，迅速切取2mm×2mm×2mm的组织块立即置于预先备好的2.5％戊二醛固定液中4℃固定，2.4h后进行常规石蜡包埋，每个蜡块每隔20μm连续切片5张，每张厚5μm，用于免疫组织化学和TUNEL检测。剩余蜡块组织投入液氮中保存待用。
组织匀浆的制备：称取适量组织(0.2-1g)按w(g)组织块重量／V(mL)匀浆介质为1／9的比例加取预冷的匀浆介质(0.8％的NaCL溶液)于烧杯中，用眼科小剪刀尽快剪碎组织块(以上操作均在冰水裕中进行)。手工制备匀浆后，3000转／min低温离心15min，分离提取上清液4℃冰箱冷藏。
1.3.2HE染色组织切片常规脱蜡水化后进行HE染色，胞核染成蓝色，胞质染成红色，光镜下观察肾细胞的整体结构。染色操作过程如下：常规脱蜡水化，双蒸水浸洗5min－苏木素染色10～15min，双蒸水浸洗5min×3次－盐酸酒精分色10～20min，双蒸水浸洗5min－伊红染色3min－梯度酒精脱水、二甲苯透明、树胶封片、镜检。
1.3.3相关指标的检测肾脏组织细胞凋亡采用TUNEL检测法，试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，严格按照说明书操作；所有切片均采用OLYMPUS显微照相图像采集系统拍片，以Simple PCI 6显微图像分析软件进行分析，以Sireple PCI显微图像分析软件测试每100个细胞中的阳性细胞数，即凋亡指数(apoptosis index，AI)。蛋白Bax、Bcl－2表达应用免疫组织化学法检测，检测试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供，操作完全按试剂盒附带说明进行。Bax和Bcl－2蛋白的表达产物呈棕黄色或棕褐色颗粒，位于胞浆，偶见于胞膜或核膜，细胞核被苏木素复染成蓝色。在光学显微镜(×400)下每张切片随机观察6个视野，每个视野至少500个细胞，应用北航MIAS医学图像分析系统测定Bax、Bcl-2蛋白表达的平均光密度(MOD)，反映阳性产物颜色深浅的平均状况。
1.4统计学处理所测数据运用SPSS13.0统计软件进行统计分析，结果以均数标准差(s)表示，组间采用t检验，显著性水平选择P<0.05水平。
2 结果与分析
2.1甘草黄酮对大强度运动大鼠肾脏组织细胞凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表达的影响由表2可知，与安静对照组相比，大强度耐力运动组和运动加药组大鼠细胞凋亡指数AI均有不同程度增加；与安静对照组相比，大强度运动组Bax、Bcl－2蛋白表达的阳性细胞平均光密度值(MOD)均呈非常显著差异性(P<0.01)，运动加药组Bax蛋白表达的阳性细胞平均光密度值(MOD)均呈非常显著差异性(P<0.01)；运动加药组Bcl-2蛋白表达MOD与大强度运动组具有非常显著差异性(P<0.01)；与安静对照组相比，大强度运动组和运动加药组Bax／Bcl－2比值分别呈不同程度的显著差异性(P<0.05，P<0.01)。
2.2甘草黄酮对各组大鼠肾脏组织Bax、Bcl－2蛋白表达的影响应用光学显微镜观察知，HE染色后阳性凋亡细胞表现为细胞核呈棕黄色或棕褐色着染，部分胞浆也可因胞核DNA碎片溢出而呈阳性着染。由图1显示，Bax在胞浆中表达明显，阳性细胞胞浆呈棕黄色或棕褐色，在正常对照组未见表达，运动组加药组可见黄染的阳性物质，主要分布胞浆；大强度运动组可见深染黄色的阳性物质丰富，主要分布 胞浆(图1a、b、c)；由图2可见，Bal－2表达在安静对照组仅有少数的棕黄色阳性细胞核；大强度耐力运动组和运动加药组细胞凋亡较安静对照组显著，其中大强度耐力运动组细胞呈散形分布，形态学特征为胞体缩小、染色质浓集、核周新月体样浓集染色质，深染黄色的阳性细胞核较为丰富，细胞间隙大，染色强度与背景呈鲜明对比；运动组加药组可见部分黄染的阳性物质。
3 讨论
3.1运动引起肾脏组织细胞凋亡的生理机制运动时由于血液重新分配，肾血流量急骤下降，并随运动过程的持续和强度的递增表现得更加明显，肾脏的这种不完全缺血状况形成了“运动性肾缺血”。运动停止后，肾血供应恢复形成运动缺血的“再灌注”。细胞凋亡是一种非炎症性细胞死亡，它是细胞在一定的生理或病理条件下受一系列基因控制的程序化细胞死亡方式，大强度运动中能源物质耗竭、代谢产物堆积及氧化应激所造成的自由基损伤等多种因素，均可引起肾细胞凋亡。目前研究表明，运动负荷达到一定程度后将导致肾脏超微结构的损伤。运动导致细胞凋亡的机制目前有以下几个观点：1)运动促进机体组织中氧自由基增加，抗氧化物质的减少，促进对线粒体的作用，从而作用于质膜引起脂质过氧化、使蛋白质和酶分子失活、线粒体DNA突变、调节凋亡相关基因的表达，诱导细胞凋亡；2)运动促进钙离子浓度的增加，钙离子作为重要的第二信使参与了细胞凋亡的启动，细胞内钙超载可使线粒体通透性转运通道打开，启动细胞凋亡程序。另外钙也是凋亡的重要执行者，可激活Ga2+／Mg2+依赖性核酸内切酶，促进凋亡；ca2+通过激活钙调蛋白分解酶(calpain)、钙调神经磷酸酶(caocineurin)及介导或促进DNA损伤以及通过影响线粒体膜电位来的方式触发细胞凋亡；3)运动导致组织糖皮质激素浓度升高，糖皮质激素通过两种机制诱发细胞凋亡，即基因组机制和非基因效应。前者表现为糖皮质激素和其受体结合后，造成DNA的构象改变，同时以空间位阻方式抑制其它和凋亡相关的基因的转录；后者表现GC能直接降低线粒体内ATPase活性，从而影响不同系统的氧化磷酸化过程，而运动应激可能主要以非基因效应发挥促凋亡作用；4)运动导致血管紧张素水平的改变，其血管紧张素可通过激活NF－kB；促进P53蛋白的表达；增加胞内Ga2+浓度及Ga2+依赖的DNA内切酶活性等促进细胞凋亡；5)细胞凋亡与线粒体结构、功能有着密切的关系。有氧力竭运动时内源性活性氧增加，而清除自由基的酶，如谷胱苷肽等的活性降低，同时磷脂酶A2的活性增加，造成膜蛋白巯基的氧化及线粒体钙含量增加，导致线粒体通透性转运通道的打开，线粒体跨膜电位耗散，细胞色素c等物质得以释放；而细胞色素c进入胞浆后可以激活凋亡蛋白酶激活因子(Apaf1)，活化Caspases蛋白酶，进而使细胞出现程序性死亡；6)运动可改变机体内Fas基因蛋白的表达增加，Fas与Fas－1结合后可发生三聚体化，其胞内段的DD(死亡域)与FaDD(含死亡结构域的Fas相关蛋白)的DD结合，进而活化Caspas－8，触发细胞死亡级联反应。
3.2中药甘草黄酮对肾脏组织细胞凋亡及Bax、Bcl－2蛋白表达的影响现代研究表明甘草黄酮是甘草提取甘草酸后残渣的主要有效成分，甘草类黄酮属查耳酮和二氢黄酮，均为含有酚羟基的化合物，其对脂质过氧化终产物丙二醛(MDA)的生成具有明显抑制作用，对超氧阴离子自由基和羟自由基有明显的清除作用；甘草中黄酮类成分对能引起生物组织膜因产生过氧化作用而导致结构和功能损伤的超氧阴离子(O-2)和羟自由基(OH-)等自由基有明显的清除作用，从而起到对生物组织的保护作用。研究表明，细胞凋亡是受基因调控的，Bcl-2蛋白是细胞凋亡的重要分子机制，Bcl-2和Bax蛋白分别是Bcl－2家族中具有代表性的抑制细胞凋亡和促进细胞凋亡因子，两者主要分布于线粒体膜、核膜和内质网上。bcl-2是目前最受关注的且被确认的对抗细胞凋亡的基因，它具有维持线粒体膜稳定性、阻止线粒体释放Caspase和凋亡诱导因子及细胞色素C，抑制细胞凋亡的生理功能。Bax是促凋亡基因，Bax直接降低线粒体外膜稳定性或与Bcl－2结合形成异源二聚体结构，阻断Bcl-2的功用，使Caspase、细胞C等释放，促进细胞凋亡。Bcl-2与Bax的相互作用是凋亡调控的中心环节，其比值大小决定抑制或促进细胞凋亡的走向。当Bax过度表达时，形成Bax同源二聚体，细胞趋向凋亡；当Bcl－2过度表达时，形成Bcl-2同源二聚体和Bcl－2／Bax异源二聚体，减少Bax同源二聚体的形成，从而抑制Bax／Bax的促凋亡作用。田振军等在对大鼠的睾丸和肾脏组织影响研究中发现，大强度训练可引起相关组织细胞凋亡明显增多，Bcl-2表达高于Bax表达；张桂兰等同样研究报道，太强度急性力竭运动引起心、肝、肾组织细胞凋亡调控基因Bax与Bcl－2比例增高，促进凋亡发生增加。从本研究结果知，经6周后，大强度耐力运动组和运动补充甘草黄酮组平均细胞凋亡指数(AI)为2.84和2.49均显著高于安静对照组2.29，补充甘草黄酮组又低于大强度运动组。运动组和运动补药组肾脏组织Bcl-2和Bax蛋白表达(MOD)及Bax／Bcl－2比值较安静对照组呈不同显著差异性增高(P<0.01，P<0.05)。由此可见，大强度耐力运动造成肾细胞凋亡基因Bcl－2和Bax高度表达，其中补充甘草黄酮组细胞凋亡指数和相关Bcl-2和Bax蛋白表达显著低于大强度运动组，中药甘草黄酮对肾脏组织细胞凋亡具有一定的抑制作用。分析认为，长时间大强度耐力运动改变机体内环境，促进机体内能源物质耗竭、代谢产物堆积，随着运动后乳酸生成增多，使机体内环境酸化，产生大量的自由基，引起胞内钙超载，进而引起线粒体膜上PT孔打开，使线粒体内的细胞色素c释放入胞浆，使凋亡的抑制因子和或促进因子在高水平失平衡，进而引发细胞凋亡。补充甘草黄酮组大鼠细胞凋亡指数和相关Bcl－2和Bax蛋白表达(MOD)及Bax／Bcl－2比值均较运动组有所降低，由此可见甘草黄酮对肾脏细胞具有保护作用，其机体机制可能与甘草黄酮能够降低组织中氧自由基的含量，减少自由基对神细胞的损伤及甘草黄酮在机体内经代谢可释放能量供细胞利用，改善肾细胞的能力代谢，减轻ca2+的运转障碍，从而抑制基因蛋白的表达，达到对生物组织的保护作用。
4 小结
本研究结果显示，补充甘草黄酮可降低运动训练大鼠肾脏组织促凋亡蛋白Bax的表达，增加抗凋亡蛋白Bcl－2的表达，降低Bax／Bcl－2比值，对大强度运动所引起的肾脏组织细胞凋亡具有一定程度的抑制作用。
关键词：甘草黄酮；大强度耐力训练；肾脏；细胞凋亡；Bax；Bcl-2
中图分类号：G804.7
文献标识码：A
文章编号：1007-3612(2011)02-0061-04
随着竞技体育的迅猛发展，运动训练强度和量以及竞赛周期的增多，探索和利用运动营养补剂，减轻或消除运动疲劳、增强运动技能一直是运动训练学和营养学领域研究的热点之一。甘草黄酮是从甘草提取物中得到的一类生物活性较强的成分，现代中药学研究表明，甘草黄酮具有抗肿瘤，抗氧化，抗病原微生物作用、解毒、抗炎、抗病毒、增强免疫机能等作用。众多研究表明，急性、大强度运动及过度训练将引起肾脏缺血再灌注，诱导肾脏细胞凋亡增加，也可能是造成运动性疲劳和运动性蛋白尿发生的原因之一。目前关于中药补剂对大强度耐力运动肾脏组织的影响报道尚无，本实验通过建立大强度耐力运动大鼠模型和补充甘草黄酮的实验手段，采用透射电镜和生化检测等手段观察和分析了甘草黄酮对大鼠肾脏组织细胞凋亡及Bax、Bal-2蛋白表达的影响，为进一步研究运动营养补剂对机体肾脏的保护机制提供理论依据。
1 材料与方法
1.1实验动物及其分组Sprague－Dawley(SD)雄性健康大鼠36只，体重180～220g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。国家标准啮齿类动物干燥饲料喂养，自由饮食，动物室湿度23％±5℃，相对湿度40％～70％，分笼饲养备用。
1.2实验模型建立实验动物适应性饲养7d后，以以15m／min、5min／d运动量对动物进行为期3d的筛选，淘汰个别不适应跑台训练者。选取其中大鼠24只随机分为安静对照组、大强度运动对照组和运动加药组，每组8只。甘草黄酮购自西安天一生物制品公司，棕黄色粉末，其中总黄酮糖苷含量为75％。加药组采用甘草黄酮溶于蒸馏水溶液中，灌胃加药，用量为300mg／kg／d，其它组采用灌服同等量的蒸馏水作为对照。每天训练前以15m／min的速度做适应运动5min后正式训练，训练模型基于Bedford模型结合实际略加调整，共为期6周(表1)。
1.3动物的处死、取材及样品制备方法
1.3.1动物处死与取材第6周训练最后一天，用乙醚麻醉后，断头处死，取肾脏组织置于预冷的生理盐水中洗净血污后，迅速切取2mm×2mm×2mm的组织块立即置于预先备好的2.5％戊二醛固定液中4℃固定，2.4h后进行常规石蜡包埋，每个蜡块每隔20μm连续切片5张，每张厚5μm，用于免疫组织化学和TUNEL检测。剩余蜡块组织投入液氮中保存待用。
组织匀浆的制备：称取适量组织(0.2-1g)按w(g)组织块重量／V(mL)匀浆介质为1／9的比例加取预冷的匀浆介质(0.8％的NaCL溶液)于烧杯中，用眼科小剪刀尽快剪碎组织块(以上操作均在冰水裕中进行)。手工制备匀浆后，3000转／min低温离心15min，分离提取上清液4℃冰箱冷藏。
1.3.2HE染色组织切片常规脱蜡水化后进行HE染色，胞核染成蓝色，胞质染成红色，光镜下观察肾细胞的整体结构。染色操作过程如下：常规脱蜡水化，双蒸水浸洗5min－苏木素染色10～15min，双蒸水浸洗5min×3次－盐酸酒精分色10～20min，双蒸水浸洗5min－伊红染色3min－梯度酒精脱水、二甲苯透明、树胶封片、镜检。
1.3.3相关指标的检测肾脏组织细胞凋亡采用TUNEL检测法，试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，严格按照说明书操作；所有切片均采用OLYMPUS显微照相图像采集系统拍片，以Simple PCI 6显微图像分析软件进行分析，以Sireple PCI显微图像分析软件测试每100个细胞中的阳性细胞数，即凋亡指数(apoptosis index，AI)。蛋白Bax、Bcl－2表达应用免疫组织化学法检测，检测试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供，操作完全按试剂盒附带说明进行。Bax和Bcl－2蛋白的表达产物呈棕黄色或棕褐色颗粒，位于胞浆，偶见于胞膜或核膜，细胞核被苏木素复染成蓝色。在光学显微镜(×400)下每张切片随机观察6个视野，每个视野至少500个细胞，应用北航MIAS医学图像分析系统测定Bax、Bcl-2蛋白表达的平均光密度(MOD)，反映阳性产物颜色深浅的平均状况。
1.4统计学处理所测数据运用SPSS13.0统计软件进行统计分析，结果以均数标准差(s)表示，组间采用t检验，显著性水平选择P<0.05水平。
2 结果与分析
2.1甘草黄酮对大强度运动大鼠肾脏组织细胞凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表达的影响由表2可知，与安静对照组相比，大强度耐力运动组和运动加药组大鼠细胞凋亡指数AI均有不同程度增加；与安静对照组相比，大强度运动组Bax、Bcl－2蛋白表达的阳性细胞平均光密度值(MOD)均呈非常显著差异性(P<0.01)，运动加药组Bax蛋白表达的阳性细胞平均光密度值(MOD)均呈非常显著差异性(P<0.01)；运动加药组Bcl-2蛋白表达MOD与大强度运动组具有非常显著差异性(P<0.01)；与安静对照组相比，大强度运动组和运动加药组Bax／Bcl－2比值分别呈不同程度的显著差异性(P<0.05，P<0.01)。
2.2甘草黄酮对各组大鼠肾脏组织Bax、Bcl－2蛋白表达的影响应用光学显微镜观察知，HE染色后阳性凋亡细胞表现为细胞核呈棕黄色或棕褐色着染，部分胞浆也可因胞核DNA碎片溢出而呈阳性着染。由图1显示，Bax在胞浆中表达明显，阳性细胞胞浆呈棕黄色或棕褐色，在正常对照组未见表达，运动组加药组可见黄染的阳性物质，主要分布胞浆；大强度运动组可见深染黄色的阳性物质丰富，主要分布 胞浆(图1a、b、c)；由图2可见，Bal－2表达在安静对照组仅有少数的棕黄色阳性细胞核；大强度耐力运动组和运动加药组细胞凋亡较安静对照组显著，其中大强度耐力运动组细胞呈散形分布，形态学特征为胞体缩小、染色质浓集、核周新月体样浓集染色质，深染黄色的阳性细胞核较为丰富，细胞间隙大，染色强度与背景呈鲜明对比；运动组加药组可见部分黄染的阳性物质。
3 讨论
3.1运动引起肾脏组织细胞凋亡的生理机制运动时由于血液重新分配，肾血流量急骤下降，并随运动过程的持续和强度的递增表现得更加明显，肾脏的这种不完全缺血状况形成了“运动性肾缺血”。运动停止后，肾血供应恢复形成运动缺血的“再灌注”。细胞凋亡是一种非炎症性细胞死亡，它是细胞在一定的生理或病理条件下受一系列基因控制的程序化细胞死亡方式，大强度运动中能源物质耗竭、代谢产物堆积及氧化应激所造成的自由基损伤等多种因素，均可引起肾细胞凋亡。目前研究表明，运动负荷达到一定程度后将导致肾脏超微结构的损伤。运动导致细胞凋亡的机制目前有以下几个观点：1)运动促进机体组织中氧自由基增加，抗氧化物质的减少，促进对线粒体的作用，从而作用于质膜引起脂质过氧化、使蛋白质和酶分子失活、线粒体DNA突变、调节凋亡相关基因的表达，诱导细胞凋亡；2)运动促进钙离子浓度的增加，钙离子作为重要的第二信使参与了细胞凋亡的启动，细胞内钙超载可使线粒体通透性转运通道打开，启动细胞凋亡程序。另外钙也是凋亡的重要执行者，可激活Ga2+／Mg2+依赖性核酸内切酶，促进凋亡；ca2+通过激活钙调蛋白分解酶(calpain)、钙调神经磷酸酶(caocineurin)及介导或促进DNA损伤以及通过影响线粒体膜电位来的方式触发细胞凋亡；3)运动导致组织糖皮质激素浓度升高，糖皮质激素通过两种机制诱发细胞凋亡，即基因组机制和非基因效应。前者表现为糖皮质激素和其受体结合后，造成DNA的构象改变，同时以空间位阻方式抑制其它和凋亡相关的基因的转录；后者表现GC能直接降低线粒体内ATPase活性，从而影响不同系统的氧化磷酸化过程，而运动应激可能主要以非基因效应发挥促凋亡作用；4)运动导致血管紧张素水平的改变，其血管紧张素可通过激活NF－kB；促进P53蛋白的表达；增加胞内Ga2+浓度及Ga2+依赖的DNA内切酶活性等促进细胞凋亡；5)细胞凋亡与线粒体结构、功能有着密切的关系。有氧力竭运动时内源性活性氧增加，而清除自由基的酶，如谷胱苷肽等的活性降低，同时磷脂酶A2的活性增加，造成膜蛋白巯基的氧化及线粒体钙含量增加，导致线粒体通透性转运通道的打开，线粒体跨膜电位耗散，细胞色素c等物质得以释放；而细胞色素c进入胞浆后可以激活凋亡蛋白酶激活因子(Apaf1)，活化Caspases蛋白酶，进而使细胞出现程序性死亡；6)运动可改变机体内Fas基因蛋白的表达增加，Fas与Fas－1结合后可发生三聚体化，其胞内段的DD(死亡域)与FaDD(含死亡结构域的Fas相关蛋白)的DD结合，进而活化Caspas－8，触发细胞死亡级联反应。
3.2中药甘草黄酮对肾脏组织细胞凋亡及Bax、Bcl－2蛋白表达的影响现代研究表明甘草黄酮是甘草提取甘草酸后残渣的主要有效成分，甘草类黄酮属查耳酮和二氢黄酮，均为含有酚羟基的化合物，其对脂质过氧化终产物丙二醛(MDA)的生成具有明显抑制作用，对超氧阴离子自由基和羟自由基有明显的清除作用；甘草中黄酮类成分对能引起生物组织膜因产生过氧化作用而导致结构和功能损伤的超氧阴离子(O-2)和羟自由基(OH-)等自由基有明显的清除作用，从而起到对生物组织的保护作用。研究表明，细胞凋亡是受基因调控的，Bcl-2蛋白是细胞凋亡的重要分子机制，Bcl-2和Bax蛋白分别是Bcl－2家族中具有代表性的抑制细胞凋亡和促进细胞凋亡因子，两者主要分布于线粒体膜、核膜和内质网上。bcl-2是目前最受关注的且被确认的对抗细胞凋亡的基因，它具有维持线粒体膜稳定性、阻止线粒体释放Caspase和凋亡诱导因子及细胞色素C，抑制细胞凋亡的生理功能。Bax是促凋亡基因，Bax直接降低线粒体外膜稳定性或与Bcl－2结合形成异源二聚体结构，阻断Bcl-2的功用，使Caspase、细胞C等释放，促进细胞凋亡。Bcl-2与Bax的相互作用是凋亡调控的中心环节，其比值大小决定抑制或促进细胞凋亡的走向。当Bax过度表达时，形成Bax同源二聚体，细胞趋向凋亡；当Bcl－2过度表达时，形成Bcl-2同源二聚体和Bcl－2／Bax异源二聚体，减少Bax同源二聚体的形成，从而抑制Bax／Bax的促凋亡作用。田振军等在对大鼠的睾丸和肾脏组织影响研究中发现，大强度训练可引起相关组织细胞凋亡明显增多，Bcl-2表达高于Bax表达；张桂兰等同样研究报道，太强度急性力竭运动引起心、肝、肾组织细胞凋亡调控基因Bax与Bcl－2比例增高，促进凋亡发生增加。从本研究结果知，经6周后，大强度耐力运动组和运动补充甘草黄酮组平均细胞凋亡指数(AI)为2.84和2.49均显著高于安静对照组2.29，补充甘草黄酮组又低于大强度运动组。运动组和运动补药组肾脏组织Bcl-2和Bax蛋白表达(MOD)及Bax／Bcl－2比值较安静对照组呈不同显著差异性增高(P<0.01，P<0.05)。由此可见，大强度耐力运动造成肾细胞凋亡基因Bcl－2和Bax高度表达，其中补充甘草黄酮组细胞凋亡指数和相关Bcl-2和Bax蛋白表达显著低于大强度运动组，中药甘草黄酮对肾脏组织细胞凋亡具有一定的抑制作用。分析认为，长时间大强度耐力运动改变机体内环境，促进机体内能源物质耗竭、代谢产物堆积，随着运动后乳酸生成增多，使机体内环境酸化，产生大量的自由基，引起胞内钙超载，进而引起线粒体膜上PT孔打开，使线粒体内的细胞色素c释放入胞浆，使凋亡的抑制因子和或促进因子在高水平失平衡，进而引发细胞凋亡。补充甘草黄酮组大鼠细胞凋亡指数和相关Bcl－2和Bax蛋白表达(MOD)及Bax／Bcl－2比值均较运动组有所降低，由此可见甘草黄酮对肾脏细胞具有保护作用，其机体机制可能与甘草黄酮能够降低组织中氧自由基的含量，减少自由基对神细胞的损伤及甘草黄酮在机体内经代谢可释放能量供细胞利用，改善肾细胞的能力代谢，减轻ca2+的运转障碍，从而抑制基因蛋白的表达，达到对生物组织的保护作用。
4 小结
本研究结果显示，补充甘草黄酮可降低运动训练大鼠肾脏组织促凋亡蛋白Bax的表达，增加抗凋亡蛋白Bcl－2的表达，降低Bax／Bcl－2比值，对大强度运动所引起的肾脏组织细胞凋亡具有一定程度的抑制作用。