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摘要：【目的】探究鉛（Pb）、锌（Zn）、镉（Cd）单一及复合污染对多年生黑麦草生长和生理特性的影响，为检验多年生黑麦草对土壤重金属污染的抗性能力提供科学依据。【方法】采用沙培法，研究CK（不加任何重金属盐）、Pb、Zn、Cd单一及复合胁迫对多年生黑麦草株高、叶宽、根长、生物量及光合色素含量、脯氨酸（Pro）、过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、可溶性糖（SS）和丙二醛（MDA）等生理指标的影响，利用隶属函数对生长和生理指标进行综合评价。【结果】Pb-Zn-Cd处理对多年生黑麦草株高、叶宽、根长、分蘖数、地上生物量、地下生物量、根冠比、POD活性和SOD活性影响最大，其中株高、叶宽、根长、分蘖数、地上生物量、地下生物量和根冠比较CK分别下降61.9%、35.9%、66.5%、72.1%、92.8%、94.2%和20.1%，POD和SOD活性较CK分别增加64.6%和3.8倍。Zn处理对多年生黑麦草的叶绿素a含量、类胡萝卜素含量、叶绿素总量和光合色素总量的影响最大，较CK分别显著下降28.6%、31.9%、20.6%和22.9%（P<0.05，下同），而对叶绿素b含量抑制最大的是Cd处理，其次是Pb-Zn-Cd处理，较CK分别下降20.3%和20.0%;所有重金属处理均使多年生黑麦草Pro含量显著增加;SS和MDA含量受Zn-Cd处理抑制最明显，较CK分别显著增加56.4%和7.0倍;复合胁迫对多年生黑麦草各指标的影响存在交互作用。通过隶属函数综合评价可知多年生黑麦草对各处理的耐受性为：Zn>CK>Cd>Zn-Cd>Pb-Zn>Pb>Pb-Cd>Pb-Zn-Cd。【结论】多年生黑麦草对Zn胁迫存在一定的耐受性，而对Pb-Zn-Cd复合胁迫的耐受性最差。
关键词： 多年生黑麦草;重金属;复合胁迫;交互作用
中图分类号： S543.6 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）04-1030-10
Effects of single and combined stresses of lead，zinc and cadmium on growth and physiological characteristics of perennial ryegrass
SHI Hui-fang， XI Yi*， ZHANG Mao， PEI Ying-jie， HUANG Ben-yong，
LI Jin-meng， YANG Ke-chao
（College of Animal Science， Guizhou University， Guiyang 550025， China）
Abstract：【Objective】To explore the effects of single and combined pollution of lead（Pb）， zinc（Zn）， cadmium（Cd） on the growth and physiological characteristics of perennial ryegrass， and to improve the scientific basis for testing the resistance ability of perennial ryegrass to soil heavy metal pollution. 【Method】Used sand culture method，the effects of single and combined stress of CK（no heavy metal）， Pb， Zn and Cd on plant height， leaf width， root length， biomass， chlorophyll content， proline（Pro）， peroxidase（POD）， superoxide dismutase（SOD）， soluble sugar（SS） and malondialdehyde（MDA） of perennial ryegrass were studied by pot experiment， and growth and physiological characteristics indexes were comprehensively evaluated by subordinate function method. 【Result】Pb-Zn-Cd treatment had the greatest effect on plant height， leaf width， root length， tiller number， aboveground biomass， underground biomass， root-shoot ratio， POD activity and SOD activity of perennial ryegrass，plant height， leaf width， root length， tiller number， above ground biomass， underground biomass， root-shoot ratio decreased by 61.9%， 35.9%， 66.5%， 72.1%， 92.8%， 94.2% and 20.1% compared to CK， respectively. POD activity and SOD activity increased by 64.6% and 3.8 times compared with CK. Compared with CK treatment， Zn treatment had the greatest effect on chlorophyll a content， carotenoids content， total chlorophyll content and total photosynthetic pigment content， and they significantly decreased by 28.6%， 31.9%， 20.6% and 22.9% compared with CK（P<0.05， the same below）. Cd treatment had the largest inhibition effect on chlorophyll b content， followed by Pb-Zn-Cd treatment， and they were decreased by 20.3% and 20.0% compared with CK. All heavy metal treatments resulted in significant increase in Pro content in perennial ryegrass. The contents of SS and MDA were most affected by Zn-Cd treatment，increased by 56.4% and 7.0 times compared with CK. The effects of combined stress on the indexes of perennial ryegrass were interactive. According to the comprehensive evaluation of membership function， the tolerance of perennial ryegrass was Zn>CK>Cd>Zn-Cd>Pb-Zn>Pb>Pb-Cd>Pb-Zn-Cd. 【Conclusion】Perennial ryegrass has some tolerance to Zn stress，but it has the worst tolerance to Pb-Zn-Cd compound stress. Key words： perennial ryegrass; heavy metal; combined stress; interaction
Foundation item： Basic Research Plan Project of Guizhou（QKHJC〔2020〕1Y126）; Science and Technology Support Project of Guizhou（QKHZC〔2018〕2258）; Guizhou Talent Work Leading Group Project（RCJD2018-13）; Support Plan for Top Scientific and Technological Talents in Colleges and Universities of Guizhou（Qianjiaohe KY〔2017〕059）
0 引言
【研究意義】多年生黑麦草（Lolium perenne）隶属禾本科黑麦草属，是常用的冷季型草坪草，生长快、生物量大，根系发达、适应性强，对重金属有一定的耐受性和富集能力（马博英，2010;刘俊祥等，2015），具备修复重金属污染的潜在特性。镉（Cd）、铅（Pb）和锌（Zn）是污染土壤的常见重金属元素（刘刊等，2012）。重金属对植物的毒害深远，从种子萌发、幼苗生长到植株开花结实等（Sun et al.， 2010）。研究表明，重金属会降低叶绿素含量和叶绿体数量，破坏叶绿体结构，引发失绿症（梁尧等，2014;张传玲等，2018）;对细胞膜造成伤害，细胞透性增大，造成植物新陈代谢紊乱（刘璐等，2014;Elftheriou et al.，2015）;且复合污染对植物的伤害大于单一污染（张嘉桐等，2018）。目前，国内外对植物单一重金属胁迫研究已较完善，但自然界的重金属污染通常不是单独存在的，土壤重金属污染虽以某一种重金属元素污染为主，但因释放到环境中的重金属途径和种类较多，因此复合形式较为常见（曹心德等，2011），元素间能相互促进或抑制对生物体的毒性，从而表现出协同、加和或拮抗等作用。土壤重金属污染破坏生态系统，进而威胁人类的身体健康，已成为亟待解决的热点问题。目前利用植物进行土壤重金属修复侧重于单一污染，因此，研究Pb、Zn、Cd单一及复合胁迫对多年生黑麦草生长及生理特性的影响，探讨多年生黑麦草对单一及复合重金属胁迫的耐受性和修复土壤重金属污染的潜力，对生态治理具有重要意义。【前人研究进展】在自然界中，污染物很少单独存在于某一环境中，通常是多种污染物共存，且对植物的影响存在交互作用。有研究表明Cd2+和Zn2+复合污染对蚕豆（Vicia faba）、大麦（Hordeum vulgare）等表现出拮抗作用（Tammam et al.，2016;Versieren et al.，2017），而对小麦（Triticum aestivum）、玉米（Zea mays）、番茄（Solanum lycopersicum）和油菜（Brassica napus）等表现出协同作用（Nan et al.，2002;Cherif et al.，2011;Cojocaru et al.，2016）。Pb2+和Zn2+高浓度对蜈蚣草（Pteris vittata）表现出拮抗作用，低浓度则表现出协同作用（夏红霞和朱启红，2013）。此外，植物对不同重金属离子的吸收能力及耐受性也各不相同。徐佩贤等（2014）发现多年生黑麦草对Cd有较强的耐受性和积累能力。冯鹏等（2016）研究发现多年生黑麦草对Cd离子吸收富集效应较Pb离子更为显著，对轻度Pb和Cd污染土壤修复效果更为明显。朱剑飞等（2018）发现黑麦草对重金属Pb具有较强的耐性，在Pb单一污染土壤的植物修复及尾矿废弃地的植被重建中，可优先作为选择材料。重金属污染对植物的危害包括生长、发育和繁殖等多方面，植物在应对重金属污染时会产生一定的应激机制，如抗氧化防御系统、渗透调节系统等，以减轻细胞氧化损伤，维持细胞内渗透平衡，降低重金属毒性等，对植物的生长具有保护作用。抗氧化系统[包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）等]的主要作用是对逆境进行反应，清除活性氧自由基，消除或降低植物所受到的氧化伤害（廖柏寒等，2010）。植物体内还会通过渗透调节物质[包括可溶性糖（SS）、可溶蛋白和脯氨酸（Pro）等]的积累降低细胞渗透势，保持细胞内渗透平衡（李洋等，2015;胡春霞和汤洁，2008），这些活性间接反映植物对重金属污染物的抗性。【本研究切入点】以往研究主要集中在单一重金属污染对多年生黑麦草生长和生理方面的影响，而对多种重金属元素复合污染的报道较少。【拟解决的关键问题】通过研究Pb、Zn、Cd单一污染及Pb-Zn、Pb-Cd、Zn-Cd、Pb-Zn-Cd复合污染对多年生黑麦草生长及生理特性的影响，探讨重金属复合污染对多年生黑麦草生理毒害机制，并结合隶属函数综合评价多年生黑麦草对各处理的耐受性，以期获得最大的生态效应，为检验多年生黑麦草对土壤重金属污染的抗性能力提供科学依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
多年生黑麦草种子（雅晴）购自北京正道生态科技有限公司。Pb（NO3）2、Zn（NO3）2·6H2O和Cd（NO3）2·4H2O购自成都金山化学试剂有限公司。主要仪器设备：酶标仪（赛默飞世尔科技公司）、游标卡尺（重庆新拓仪器有限公司）和电子天平[奥豪斯仪器（常州）有限公司]。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 试验设计 选取饱满、健康的多年生黑麦草种子，用2%双氧水溶液浸泡30 min消毒，经蒸馏水冲洗后置于恒温箱中发芽，待幼苗长出2～3片真叶、高10 cm左右时，将其移栽到装有石英砂的花盆中，每盆移栽5株。在贵州大学西校区崇学楼楼顶温室内进行常规养护管理，定期浇水和霍格兰营养液。 依据GB 15618—1995《土壤环境质量标准》三级污染和贵州Pb、Zn、Cd土壤污染较重地区的重金属含量情况（李海英等，2009），设Pb、Zn、Cd离子浓度分别为500、500和10 mg/kg。试验共设8组处理，每组3个重复，以不添加任何重金属盐为对照组（CK），各处理组设计见表1。
1. 2. 2 形态指标测定 移栽后7 d开始用游标卡尺测量并记录黑麦草的垂直株高和最宽叶宽，之后每周测一次，后期3周測一次。收获前记录每株分蘖数;收获后用游标卡尺测量植株的根长，用电子天平称量地上鲜重和地下鲜重，并记录。
1. 2. 3 生理指标测定 移栽127 d后收获植株，测定生理指标。Pro含量采用酸性茚三酮法测定（张立军和樊金娟，2007），SS含量采用蒽酮法测定（王晶英，2003），SOD活性、POD活性、丙二醛（MDA）含量和光合色素含量参照高俊凤（2006）的方法测定。
1. 2. 4 隶属函数方法 利用隶属函数法对Pb2+、Zn2+、Cd2+单一及复合胁迫下多年生黑麦草的耐受性进行综合评价（张宇君等，2018）。多年生黑麦草各项指标的具体函数值计算公式为：
Xu=（X-Xmin）/（Xmax-Xmin） （1）
Xu=1-（X-Xmin）/（Xmax-Xmin） （2）
式中，Xu为各处理第u个指标的隶属函数值，X为参试样品某一抗性指标的测定值，Xmax和Xmin分别为所有试样中该指标的最大值和最小值，若所测指标与黑麦草的耐受性呈正相关，则使用公式（1）计算隶属值，负相关则用公式（2）。最后把每个试样的各项指标隶属函数值进行累加，取其平均值。平均值越大，抗性越强，反之越弱。
1. 3 统计分析
采用SPSS 20.0对试验数据进行单因素方差分析、多重比较和三因素方差分析，利用Excel 2010和SigmaPlot 10.0进行数据统计和图表绘制。
2 结果与分析
2. 1 Pb2+、Zn2+、Cd2+单一及复合胁迫对多年生黑麦草生长的影响
由表2可知，重金属胁迫下，多年生黑麦草株高和叶宽受到抑制，除Cd处理组的部分叶宽外，其他处理的株高和叶宽均显著低于CK（P<0.05，下同）。其中移栽后126 d，Pb-Zn-Cd处理组多年生黑麦草株高和叶宽降幅最大，分别较CK显著下降61.9%和35.9%，其次是Zn处理组，多年生黑麦草株高和叶宽分别较CK显著下降47.6%和33.2%。
由表3可知，重金属胁迫下，多年生黑麦草根长、分蘖数和地下生物量与CK相比均有不同程度下降。地上生物量除Pb处理组显著高于CK（增加78.2%）外，其余处理组均低于CK。Pb-Cd处理组根长、分蘖数、地上生物量和地下生物量较CK分别下降27.5%、30.9%、52.1%和41.3%，根冠比较CK增加22.8%，但差异不显著（P>0.05，下同）。Pb-Zn-Cd处理组的根长、分蘖数、地上生物量和地下生物量均低于其他处理组，分别较CK显著降低66.5%、72.1%、92.8%和94.2%，根冠比较CK显著降低20.1%。
2. 2 Pb2+、Zn2+、Cd2+单一及复合胁迫对多年生黑麦草光合色素的影响
由图1可知，重金属胁迫下，多年生黑麦草叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量及叶绿素总量、光合色素总量较CK均存在明显差异。Zn处理组，除叶绿素b含量外，叶绿素a含量、类胡萝卜素含量、叶绿素总量和光合色素总量均最低，分别较CK显著下降28.6%、31.9%、20.6%和22.9%。Zn作为植物必需的营养元素，在一定浓度下能促进植物的生长发育，但达到较高浓度时反而影响叶绿素合成。Pb-Cd处理组叶绿素a含量、叶绿素总量和光合色素总量最高，较CK分别提高9.5%、10.8%和10.0%。对于叶绿素b含量，Pb处理组最高，较CK提高28.0%;Cd、Pb-Zn和Pb-Zn-Cd处理组分别较CK下降20.3%、12.0%和20.0%（图1-B）。对于类胡萝卜素含量，Zn-Cd处理组较CK显著提高12.6%，Pb、Cd处理组分别较CK下降12.2%和7.9%（图1-C）。
2. 3 Pb2+、Zn2+、Cd2+单一及复合胁迫对多年生黑麦草抗氧化酶活性的影响
由图2-A可知，重金属胁迫下，多年生黑麦草POD活性高于CK，其中Pb-Zn-Cd处理组POD活性最高，Cd处理组POD活性最低，分别较CK增加64.6%和29.9%。Pb-Zn-Cd处理组SOD活性最高，其次是Zn处理组，分别较CK显著提高3.8和3.3倍;Pb处理组SOD活性最低，较CK降低33.7%（图2-B）。
2. 4 Pb2+、Zn2+、Cd2+单一及复合胁迫对多年生黑麦草渗透调节物质的影响
由图3-A可知，多年生黑麦草重金属处理组Pro含量较CK均有不同程度的增加;其中Zn、Pb-Zn和Zn-Cd处理组Pro含量较高，分别为1278.3、1278.2和1291.7 μg/g，分别较CK显著增加67.7%、67.6%和69.4%;Cd处理组Pro含量最低，也较CK显著增加48.5%。Zn、Pb-Cd和Zn-Cd处理组SS含量分别较CK显著增加25.5%、35.6%和56.4%;Pb、Cd、Pb-Zn和Pb-Zn-Cd处理组分别较CK显著下降71.8%、81.1%、16.5%和61.9%;Zn-Cd处理组对多年生黑麦草SS含量影响最大，Cd处理组影响最小（图3-B）。
2. 5 Pb2+、Zn2+、Cd2+单一及复合胁迫对多年生黑麦草MDA含量的影响
由图4可知，与CK相比，除Pb处理组MDA含量显著减少外，其他处理组MDA含量均显著增加;Zn-Cd处理组MDA含量最高，较CK提高7.0倍;Pb处理组MDA含量最低，与CK相比下降30.3%。 2. 6 Pb2+、Zn2+、Cd2+对多年生黑麦草形态指标和生理指标的影响
Pb2+、Zn2+、Cd2+对多年生黑麦草形态指标和生理指标影响的三因素方差分析结果见表4。Pb2+对株高、根长、POD活性、SS含量、Pro含量和MDA含量影响极显著（P<0.01，下同），对分蘖数影响显著;Zn2+对叶绿素b和类胡萝卜素含量影响不显著，对分蘖数影响显著，对其他指标均有极显著影响;Cd2+对株高、根长、地上生物量、地下生物量、叶绿素a含量、类胡萝卜素含量、SOD活性、Pro含量和MDA含量影响极显著，对分蘖数、光合色素总量和SS含量影响显著。
Pb2+和Zn2+对株高、根长、叶绿素b含量、叶绿素总量及Pro、SS和MDA含量的影响有交互作用;Pb2+和Cd2+对SOD活性及Pro、SS和MDA含量的影响有交互作用;Zn2+和Cd2+对地上生物量、地下生物量及叶绿素a、类胡萝卜素、Pro、SS和MDA含量的影响有交互作用;除地上生物量、地下生物量和叶绿素b含量外，Pb2+、Zn2+、Cd2+对其他指标的影响均有交互作用。
根据各形态和生理指标的隶属函数值（表5），评价出多年生黑麦草对各个处理的耐受性为：Zn>CK>Cd>Zn-Cd>Pb-Zn>Pb>Pb-Cd>Pb-Zn-Cd。
3 讨论
生长情况和生物量的改变是植物对重金属胁迫响应的总体反映（文晓慧，2012），重金属污染对植物最明显的毒害在于使其生长发育迟缓、植株较矮等。本研究结果表明，不同重金属处理组对多年生黑麦草的株高、叶宽、根长、分蘖数、地上生物量、地下生物量和根冠比均具有抑制作用。Pb2+、Zn2+和Cd2+三因素复合胁迫的抑制作用大于双因素及单因素胁迫，Pb-Zn-Cd对多年生黑麦草的生长影响最大。
叶绿素是植物光合作用的物质基础，其含量高低直接影响植物光合作用的强度及物质合成速率。当植物受到重金属胁迫时，叶绿素含量显著降低，叶绿体膜结构受到损伤，叶绿体内的光合酶含量降低，叶片气孔关闭，光合作用强度降低（朱成豪等，2019）。在重金属胁迫下，叶绿素含量的变化可较直接反映重金属对植物的损害程度。本研究中，Zn处理组对多年生黑麦草叶绿素a含量、类胡萝卜素含量、叶绿素总量和光合色素总量影响明显，但与Pb2+和Cd2+复合后，其对叶绿素的影响降低，Cd处理组对多年生黑麦草叶绿素b含量影响最大。Zn2+既为植物生长发育所必需的营养元素，同时也是一个有害的重金属元素。低浓度Zn2+能促进植物生长，高浓度Zn2+则抑制植物生长。有研究表明，Pb2+、Cd2+、Zn2+污染明显降低黑麦草叶绿素含量（赵玉红等，2014），究其原因可能是Zn以离子的形式进入细胞内部，与植物体内叶绿素合成的几种酶分子的-SH相结合或取代其中Fe2+、Mg2+（任永霞等，2005），改变酶分子构象，从而降低酶活性，导致细胞中叶绿素的合成受阻，降低叶绿素含量。在胁迫过程中，Zn2+还会破坏叶绿体结构，致使存在于叶绿体和有色体膜上的类胡萝卜素含量也呈下降趋势。重金属的存在提高了叶绿素酶的活性，使叶绿素分解（刘柿良等，2015）。
重金属污染对植物抗氧化酶的影响已有报道。CAT、POD和SOD抗氧化酶是植物适应外部污染胁迫的保护性酶，在外部重金属胁迫下可协同清除由其产生的活性氧基团，从而保护植物细胞不受到破坏（赵玉红等，2014）。本研究中，除Pb和Pb-Zn处理组外，其他重金属处理组的SOD活性较CK均有所提高，其中Zn和Pb-Zn-Cd 2个处理组多年生黑麦草的SOD活性增加最明显，说明这2个处理对多年生黑麦草伤害最大。SOD广泛存在于植物体内不同组织中，作为活性较高的适应性酶，能反映植物生长发育的特点、体内代谢状况以及对外界环境的适应性（Yilmaz et al.，2017）。POD也是植物体内抗氧化酶系统的重要组成部分，能催化有毒物质的分解，将H2O2转化成O2和H2O，其活性的高低能反映植物受毒害的程度以及植物对逆境的适应能力（杨国远等，2014）。本研究中，各重金属处理组POD活性较CK均有明显提高，尤其是Pb、Zn和Pb-Zn-Cd处理组。由此可知，在重金属离子的逆境胁迫下，生物体自身有抗氧化能力。
渗透调节是植物适应盐渍、低温、干旱和重金属等胁迫的重要生理机制之一，在逆境條件下，植物通过积累一些小分子化合物，以增加细胞质浓度，降低渗透势，保持体内正常生理活动的进行，从而增强植物的抗逆性（刘慧芹等，2012）。Pro和SS是植物体内重要的渗透调节物质，在植物渗透调节中起着举足轻重的作用。重金属处理下植物SS含量增加的原因可能是叶片内不溶性糖降解及光合产物运输受阻的结果（沙翠芸等，2011）。本研究中，Pb、Zn、Cd单一处理，仅有Zn处理SS含量高于CK。在Pb-Zn复合处理中，Pb的进入减弱了Zn对SS的刺激作用，显示Pb对Zn有一定的拮抗效应，相反Cd对Zn、Pb有一定的协同效应，Pb、Zn、Cd的交互较复杂，需进一步研究。植物体内游离Pro含量的增加是植物对逆境胁迫的一种生理生化反应（张呈祥和陈为峰，2013）。植株细胞内Pro的增量可表征植株受到重金属的毒害程度，Pro增量越大植株受到的伤害就越深，反之则伤害越轻。在本研究中，各重金属处理组Pro含量较CK均显著升高，Zn-Cd处理较单一Cd、Zn处理含量高，表现为协同作用，与郭晓音等（2009）的研究结果一致。这可能由于重金属胁迫改变了植物体内Pro的代谢途径，影响蛋白质合成，使得Pro氧化受阻，蛋白质合成速度减慢，Pro含量升高（温瑀和穆立蔷，2013）。
MDA含量是植物受逆境胁迫时发生膜脂过氧化的最终产物，其含量直接反映植物细胞发生膜脂过氧化的程度（张宇君等，2018）。本研究中，Pb-Zn、Pb-Cd和Cd-Zn复合胁迫的MDA含量较Pb、Zn、Cd单一胁迫高，说明Pb与Zn、Pb与Cd、Cd与Zn在对多年生黑麦草MDA的影响上表现为协同，Pb-Zn-Cd交互较复杂有待进一步研究。 自然界中重金属污染物通常不是单独存在的，而是相互伴生。相同的复合污染对不同的效应和指标可能会表现出不同的效果（郭俊娒等，2019）。本研究发现Pb-Zn、Pb-Cd、Zn-Cd和Pb-Zn-Cd交互作用对多年生黑麦草生长和生理指标的影响各不相同。Pb-Zn交互胁迫对多年生黑麦草株高、根长、叶绿素总量、Pro含量和MDA含量的交互效应是拮抗作用，对叶绿素b和SS含量则是协同作用;Pb-Cd交互胁迫对Pro、SS和MDA含量是拮抗作用，对SOD活性是协同作用;Zn-Cd交互胁迫对地上生物量、地下生物量及叶绿素a、类胡萝卜素、Pro、SS和MDA含量是拮抗作用;Pb-Zn-Cd交互胁迫对株高、叶宽、根长、分蘖数、根冠比、POD活性、Pro含量和MDA含量是拮抗作用，对叶绿素a含量、类胡萝卜素含量、叶绿素总量、光合色素总量、SOD活性和SS含量是协同作用。通过隶属函数综合评价得知，Zn处理隶属函数值最大，有利于多年生黑麦草的生长，较其他胁迫处理更具优势;Pb-Zn-Cd胁迫处理隶属函数值最小，对多年生黑麦草的伤害最大。
4 结论
本研究得出多年生黑麦草对各处理的耐受性为：Zn>CK>Cd>Zn-Cd>Pb-Zn>Pb>Pb-Cd>Pb-Zn-Cd。其中Zn对多年生黑麦草的抗性有促进作用，多年生黑麦草在Pb-Zn-Cd复合胁迫中耐受性最差，可为多年生黑麦草修复Pb/Zn/Cd污染提供一定的理论依据。
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（責任编辑 罗 丽）
关键词： 多年生黑麦草;重金属;复合胁迫;交互作用
中图分类号： S543.6 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）04-1030-10
Effects of single and combined stresses of lead，zinc and cadmium on growth and physiological characteristics of perennial ryegrass
SHI Hui-fang， XI Yi*， ZHANG Mao， PEI Ying-jie， HUANG Ben-yong，
LI Jin-meng， YANG Ke-chao
（College of Animal Science， Guizhou University， Guiyang 550025， China）
Abstract：【Objective】To explore the effects of single and combined pollution of lead（Pb）， zinc（Zn）， cadmium（Cd） on the growth and physiological characteristics of perennial ryegrass， and to improve the scientific basis for testing the resistance ability of perennial ryegrass to soil heavy metal pollution. 【Method】Used sand culture method，the effects of single and combined stress of CK（no heavy metal）， Pb， Zn and Cd on plant height， leaf width， root length， biomass， chlorophyll content， proline（Pro）， peroxidase（POD）， superoxide dismutase（SOD）， soluble sugar（SS） and malondialdehyde（MDA） of perennial ryegrass were studied by pot experiment， and growth and physiological characteristics indexes were comprehensively evaluated by subordinate function method. 【Result】Pb-Zn-Cd treatment had the greatest effect on plant height， leaf width， root length， tiller number， aboveground biomass， underground biomass， root-shoot ratio， POD activity and SOD activity of perennial ryegrass，plant height， leaf width， root length， tiller number， above ground biomass， underground biomass， root-shoot ratio decreased by 61.9%， 35.9%， 66.5%， 72.1%， 92.8%， 94.2% and 20.1% compared to CK， respectively. POD activity and SOD activity increased by 64.6% and 3.8 times compared with CK. Compared with CK treatment， Zn treatment had the greatest effect on chlorophyll a content， carotenoids content， total chlorophyll content and total photosynthetic pigment content， and they significantly decreased by 28.6%， 31.9%， 20.6% and 22.9% compared with CK（P<0.05， the same below）. Cd treatment had the largest inhibition effect on chlorophyll b content， followed by Pb-Zn-Cd treatment， and they were decreased by 20.3% and 20.0% compared with CK. All heavy metal treatments resulted in significant increase in Pro content in perennial ryegrass. The contents of SS and MDA were most affected by Zn-Cd treatment，increased by 56.4% and 7.0 times compared with CK. The effects of combined stress on the indexes of perennial ryegrass were interactive. According to the comprehensive evaluation of membership function， the tolerance of perennial ryegrass was Zn>CK>Cd>Zn-Cd>Pb-Zn>Pb>Pb-Cd>Pb-Zn-Cd. 【Conclusion】Perennial ryegrass has some tolerance to Zn stress，but it has the worst tolerance to Pb-Zn-Cd compound stress. Key words： perennial ryegrass; heavy metal; combined stress; interaction
Foundation item： Basic Research Plan Project of Guizhou（QKHJC〔2020〕1Y126）; Science and Technology Support Project of Guizhou（QKHZC〔2018〕2258）; Guizhou Talent Work Leading Group Project（RCJD2018-13）; Support Plan for Top Scientific and Technological Talents in Colleges and Universities of Guizhou（Qianjiaohe KY〔2017〕059）
0 引言
【研究意義】多年生黑麦草（Lolium perenne）隶属禾本科黑麦草属，是常用的冷季型草坪草，生长快、生物量大，根系发达、适应性强，对重金属有一定的耐受性和富集能力（马博英，2010;刘俊祥等，2015），具备修复重金属污染的潜在特性。镉（Cd）、铅（Pb）和锌（Zn）是污染土壤的常见重金属元素（刘刊等，2012）。重金属对植物的毒害深远，从种子萌发、幼苗生长到植株开花结实等（Sun et al.， 2010）。研究表明，重金属会降低叶绿素含量和叶绿体数量，破坏叶绿体结构，引发失绿症（梁尧等，2014;张传玲等，2018）;对细胞膜造成伤害，细胞透性增大，造成植物新陈代谢紊乱（刘璐等，2014;Elftheriou et al.，2015）;且复合污染对植物的伤害大于单一污染（张嘉桐等，2018）。目前，国内外对植物单一重金属胁迫研究已较完善，但自然界的重金属污染通常不是单独存在的，土壤重金属污染虽以某一种重金属元素污染为主，但因释放到环境中的重金属途径和种类较多，因此复合形式较为常见（曹心德等，2011），元素间能相互促进或抑制对生物体的毒性，从而表现出协同、加和或拮抗等作用。土壤重金属污染破坏生态系统，进而威胁人类的身体健康，已成为亟待解决的热点问题。目前利用植物进行土壤重金属修复侧重于单一污染，因此，研究Pb、Zn、Cd单一及复合胁迫对多年生黑麦草生长及生理特性的影响，探讨多年生黑麦草对单一及复合重金属胁迫的耐受性和修复土壤重金属污染的潜力，对生态治理具有重要意义。【前人研究进展】在自然界中，污染物很少单独存在于某一环境中，通常是多种污染物共存，且对植物的影响存在交互作用。有研究表明Cd2+和Zn2+复合污染对蚕豆（Vicia faba）、大麦（Hordeum vulgare）等表现出拮抗作用（Tammam et al.，2016;Versieren et al.，2017），而对小麦（Triticum aestivum）、玉米（Zea mays）、番茄（Solanum lycopersicum）和油菜（Brassica napus）等表现出协同作用（Nan et al.，2002;Cherif et al.，2011;Cojocaru et al.，2016）。Pb2+和Zn2+高浓度对蜈蚣草（Pteris vittata）表现出拮抗作用，低浓度则表现出协同作用（夏红霞和朱启红，2013）。此外，植物对不同重金属离子的吸收能力及耐受性也各不相同。徐佩贤等（2014）发现多年生黑麦草对Cd有较强的耐受性和积累能力。冯鹏等（2016）研究发现多年生黑麦草对Cd离子吸收富集效应较Pb离子更为显著，对轻度Pb和Cd污染土壤修复效果更为明显。朱剑飞等（2018）发现黑麦草对重金属Pb具有较强的耐性，在Pb单一污染土壤的植物修复及尾矿废弃地的植被重建中，可优先作为选择材料。重金属污染对植物的危害包括生长、发育和繁殖等多方面，植物在应对重金属污染时会产生一定的应激机制，如抗氧化防御系统、渗透调节系统等，以减轻细胞氧化损伤，维持细胞内渗透平衡，降低重金属毒性等，对植物的生长具有保护作用。抗氧化系统[包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）等]的主要作用是对逆境进行反应，清除活性氧自由基，消除或降低植物所受到的氧化伤害（廖柏寒等，2010）。植物体内还会通过渗透调节物质[包括可溶性糖（SS）、可溶蛋白和脯氨酸（Pro）等]的积累降低细胞渗透势，保持细胞内渗透平衡（李洋等，2015;胡春霞和汤洁，2008），这些活性间接反映植物对重金属污染物的抗性。【本研究切入点】以往研究主要集中在单一重金属污染对多年生黑麦草生长和生理方面的影响，而对多种重金属元素复合污染的报道较少。【拟解决的关键问题】通过研究Pb、Zn、Cd单一污染及Pb-Zn、Pb-Cd、Zn-Cd、Pb-Zn-Cd复合污染对多年生黑麦草生长及生理特性的影响，探讨重金属复合污染对多年生黑麦草生理毒害机制，并结合隶属函数综合评价多年生黑麦草对各处理的耐受性，以期获得最大的生态效应，为检验多年生黑麦草对土壤重金属污染的抗性能力提供科学依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
多年生黑麦草种子（雅晴）购自北京正道生态科技有限公司。Pb（NO3）2、Zn（NO3）2·6H2O和Cd（NO3）2·4H2O购自成都金山化学试剂有限公司。主要仪器设备：酶标仪（赛默飞世尔科技公司）、游标卡尺（重庆新拓仪器有限公司）和电子天平[奥豪斯仪器（常州）有限公司]。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 试验设计 选取饱满、健康的多年生黑麦草种子，用2%双氧水溶液浸泡30 min消毒，经蒸馏水冲洗后置于恒温箱中发芽，待幼苗长出2～3片真叶、高10 cm左右时，将其移栽到装有石英砂的花盆中，每盆移栽5株。在贵州大学西校区崇学楼楼顶温室内进行常规养护管理，定期浇水和霍格兰营养液。 依据GB 15618—1995《土壤环境质量标准》三级污染和贵州Pb、Zn、Cd土壤污染较重地区的重金属含量情况（李海英等，2009），设Pb、Zn、Cd离子浓度分别为500、500和10 mg/kg。试验共设8组处理，每组3个重复，以不添加任何重金属盐为对照组（CK），各处理组设计见表1。
1. 2. 2 形态指标测定 移栽后7 d开始用游标卡尺测量并记录黑麦草的垂直株高和最宽叶宽，之后每周测一次，后期3周測一次。收获前记录每株分蘖数;收获后用游标卡尺测量植株的根长，用电子天平称量地上鲜重和地下鲜重，并记录。
1. 2. 3 生理指标测定 移栽127 d后收获植株，测定生理指标。Pro含量采用酸性茚三酮法测定（张立军和樊金娟，2007），SS含量采用蒽酮法测定（王晶英，2003），SOD活性、POD活性、丙二醛（MDA）含量和光合色素含量参照高俊凤（2006）的方法测定。
1. 2. 4 隶属函数方法 利用隶属函数法对Pb2+、Zn2+、Cd2+单一及复合胁迫下多年生黑麦草的耐受性进行综合评价（张宇君等，2018）。多年生黑麦草各项指标的具体函数值计算公式为：
Xu=（X-Xmin）/（Xmax-Xmin） （1）
Xu=1-（X-Xmin）/（Xmax-Xmin） （2）
式中，Xu为各处理第u个指标的隶属函数值，X为参试样品某一抗性指标的测定值，Xmax和Xmin分别为所有试样中该指标的最大值和最小值，若所测指标与黑麦草的耐受性呈正相关，则使用公式（1）计算隶属值，负相关则用公式（2）。最后把每个试样的各项指标隶属函数值进行累加，取其平均值。平均值越大，抗性越强，反之越弱。
1. 3 统计分析
采用SPSS 20.0对试验数据进行单因素方差分析、多重比较和三因素方差分析，利用Excel 2010和SigmaPlot 10.0进行数据统计和图表绘制。
2 结果与分析
2. 1 Pb2+、Zn2+、Cd2+单一及复合胁迫对多年生黑麦草生长的影响
由表2可知，重金属胁迫下，多年生黑麦草株高和叶宽受到抑制，除Cd处理组的部分叶宽外，其他处理的株高和叶宽均显著低于CK（P<0.05，下同）。其中移栽后126 d，Pb-Zn-Cd处理组多年生黑麦草株高和叶宽降幅最大，分别较CK显著下降61.9%和35.9%，其次是Zn处理组，多年生黑麦草株高和叶宽分别较CK显著下降47.6%和33.2%。
由表3可知，重金属胁迫下，多年生黑麦草根长、分蘖数和地下生物量与CK相比均有不同程度下降。地上生物量除Pb处理组显著高于CK（增加78.2%）外，其余处理组均低于CK。Pb-Cd处理组根长、分蘖数、地上生物量和地下生物量较CK分别下降27.5%、30.9%、52.1%和41.3%，根冠比较CK增加22.8%，但差异不显著（P>0.05，下同）。Pb-Zn-Cd处理组的根长、分蘖数、地上生物量和地下生物量均低于其他处理组，分别较CK显著降低66.5%、72.1%、92.8%和94.2%，根冠比较CK显著降低20.1%。
2. 2 Pb2+、Zn2+、Cd2+单一及复合胁迫对多年生黑麦草光合色素的影响
由图1可知，重金属胁迫下，多年生黑麦草叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量及叶绿素总量、光合色素总量较CK均存在明显差异。Zn处理组，除叶绿素b含量外，叶绿素a含量、类胡萝卜素含量、叶绿素总量和光合色素总量均最低，分别较CK显著下降28.6%、31.9%、20.6%和22.9%。Zn作为植物必需的营养元素，在一定浓度下能促进植物的生长发育，但达到较高浓度时反而影响叶绿素合成。Pb-Cd处理组叶绿素a含量、叶绿素总量和光合色素总量最高，较CK分别提高9.5%、10.8%和10.0%。对于叶绿素b含量，Pb处理组最高，较CK提高28.0%;Cd、Pb-Zn和Pb-Zn-Cd处理组分别较CK下降20.3%、12.0%和20.0%（图1-B）。对于类胡萝卜素含量，Zn-Cd处理组较CK显著提高12.6%，Pb、Cd处理组分别较CK下降12.2%和7.9%（图1-C）。
2. 3 Pb2+、Zn2+、Cd2+单一及复合胁迫对多年生黑麦草抗氧化酶活性的影响
由图2-A可知，重金属胁迫下，多年生黑麦草POD活性高于CK，其中Pb-Zn-Cd处理组POD活性最高，Cd处理组POD活性最低，分别较CK增加64.6%和29.9%。Pb-Zn-Cd处理组SOD活性最高，其次是Zn处理组，分别较CK显著提高3.8和3.3倍;Pb处理组SOD活性最低，较CK降低33.7%（图2-B）。
2. 4 Pb2+、Zn2+、Cd2+单一及复合胁迫对多年生黑麦草渗透调节物质的影响
由图3-A可知，多年生黑麦草重金属处理组Pro含量较CK均有不同程度的增加;其中Zn、Pb-Zn和Zn-Cd处理组Pro含量较高，分别为1278.3、1278.2和1291.7 μg/g，分别较CK显著增加67.7%、67.6%和69.4%;Cd处理组Pro含量最低，也较CK显著增加48.5%。Zn、Pb-Cd和Zn-Cd处理组SS含量分别较CK显著增加25.5%、35.6%和56.4%;Pb、Cd、Pb-Zn和Pb-Zn-Cd处理组分别较CK显著下降71.8%、81.1%、16.5%和61.9%;Zn-Cd处理组对多年生黑麦草SS含量影响最大，Cd处理组影响最小（图3-B）。
2. 5 Pb2+、Zn2+、Cd2+单一及复合胁迫对多年生黑麦草MDA含量的影响
由图4可知，与CK相比，除Pb处理组MDA含量显著减少外，其他处理组MDA含量均显著增加;Zn-Cd处理组MDA含量最高，较CK提高7.0倍;Pb处理组MDA含量最低，与CK相比下降30.3%。 2. 6 Pb2+、Zn2+、Cd2+对多年生黑麦草形态指标和生理指标的影响
Pb2+、Zn2+、Cd2+对多年生黑麦草形态指标和生理指标影响的三因素方差分析结果见表4。Pb2+对株高、根长、POD活性、SS含量、Pro含量和MDA含量影响极显著（P<0.01，下同），对分蘖数影响显著;Zn2+对叶绿素b和类胡萝卜素含量影响不显著，对分蘖数影响显著，对其他指标均有极显著影响;Cd2+对株高、根长、地上生物量、地下生物量、叶绿素a含量、类胡萝卜素含量、SOD活性、Pro含量和MDA含量影响极显著，对分蘖数、光合色素总量和SS含量影响显著。
Pb2+和Zn2+对株高、根长、叶绿素b含量、叶绿素总量及Pro、SS和MDA含量的影响有交互作用;Pb2+和Cd2+对SOD活性及Pro、SS和MDA含量的影响有交互作用;Zn2+和Cd2+对地上生物量、地下生物量及叶绿素a、类胡萝卜素、Pro、SS和MDA含量的影响有交互作用;除地上生物量、地下生物量和叶绿素b含量外，Pb2+、Zn2+、Cd2+对其他指标的影响均有交互作用。
根据各形态和生理指标的隶属函数值（表5），评价出多年生黑麦草对各个处理的耐受性为：Zn>CK>Cd>Zn-Cd>Pb-Zn>Pb>Pb-Cd>Pb-Zn-Cd。
3 讨论
生长情况和生物量的改变是植物对重金属胁迫响应的总体反映（文晓慧，2012），重金属污染对植物最明显的毒害在于使其生长发育迟缓、植株较矮等。本研究结果表明，不同重金属处理组对多年生黑麦草的株高、叶宽、根长、分蘖数、地上生物量、地下生物量和根冠比均具有抑制作用。Pb2+、Zn2+和Cd2+三因素复合胁迫的抑制作用大于双因素及单因素胁迫，Pb-Zn-Cd对多年生黑麦草的生长影响最大。
叶绿素是植物光合作用的物质基础，其含量高低直接影响植物光合作用的强度及物质合成速率。当植物受到重金属胁迫时，叶绿素含量显著降低，叶绿体膜结构受到损伤，叶绿体内的光合酶含量降低，叶片气孔关闭，光合作用强度降低（朱成豪等，2019）。在重金属胁迫下，叶绿素含量的变化可较直接反映重金属对植物的损害程度。本研究中，Zn处理组对多年生黑麦草叶绿素a含量、类胡萝卜素含量、叶绿素总量和光合色素总量影响明显，但与Pb2+和Cd2+复合后，其对叶绿素的影响降低，Cd处理组对多年生黑麦草叶绿素b含量影响最大。Zn2+既为植物生长发育所必需的营养元素，同时也是一个有害的重金属元素。低浓度Zn2+能促进植物生长，高浓度Zn2+则抑制植物生长。有研究表明，Pb2+、Cd2+、Zn2+污染明显降低黑麦草叶绿素含量（赵玉红等，2014），究其原因可能是Zn以离子的形式进入细胞内部，与植物体内叶绿素合成的几种酶分子的-SH相结合或取代其中Fe2+、Mg2+（任永霞等，2005），改变酶分子构象，从而降低酶活性，导致细胞中叶绿素的合成受阻，降低叶绿素含量。在胁迫过程中，Zn2+还会破坏叶绿体结构，致使存在于叶绿体和有色体膜上的类胡萝卜素含量也呈下降趋势。重金属的存在提高了叶绿素酶的活性，使叶绿素分解（刘柿良等，2015）。
重金属污染对植物抗氧化酶的影响已有报道。CAT、POD和SOD抗氧化酶是植物适应外部污染胁迫的保护性酶，在外部重金属胁迫下可协同清除由其产生的活性氧基团，从而保护植物细胞不受到破坏（赵玉红等，2014）。本研究中，除Pb和Pb-Zn处理组外，其他重金属处理组的SOD活性较CK均有所提高，其中Zn和Pb-Zn-Cd 2个处理组多年生黑麦草的SOD活性增加最明显，说明这2个处理对多年生黑麦草伤害最大。SOD广泛存在于植物体内不同组织中，作为活性较高的适应性酶，能反映植物生长发育的特点、体内代谢状况以及对外界环境的适应性（Yilmaz et al.，2017）。POD也是植物体内抗氧化酶系统的重要组成部分，能催化有毒物质的分解，将H2O2转化成O2和H2O，其活性的高低能反映植物受毒害的程度以及植物对逆境的适应能力（杨国远等，2014）。本研究中，各重金属处理组POD活性较CK均有明显提高，尤其是Pb、Zn和Pb-Zn-Cd处理组。由此可知，在重金属离子的逆境胁迫下，生物体自身有抗氧化能力。
渗透调节是植物适应盐渍、低温、干旱和重金属等胁迫的重要生理机制之一，在逆境條件下，植物通过积累一些小分子化合物，以增加细胞质浓度，降低渗透势，保持体内正常生理活动的进行，从而增强植物的抗逆性（刘慧芹等，2012）。Pro和SS是植物体内重要的渗透调节物质，在植物渗透调节中起着举足轻重的作用。重金属处理下植物SS含量增加的原因可能是叶片内不溶性糖降解及光合产物运输受阻的结果（沙翠芸等，2011）。本研究中，Pb、Zn、Cd单一处理，仅有Zn处理SS含量高于CK。在Pb-Zn复合处理中，Pb的进入减弱了Zn对SS的刺激作用，显示Pb对Zn有一定的拮抗效应，相反Cd对Zn、Pb有一定的协同效应，Pb、Zn、Cd的交互较复杂，需进一步研究。植物体内游离Pro含量的增加是植物对逆境胁迫的一种生理生化反应（张呈祥和陈为峰，2013）。植株细胞内Pro的增量可表征植株受到重金属的毒害程度，Pro增量越大植株受到的伤害就越深，反之则伤害越轻。在本研究中，各重金属处理组Pro含量较CK均显著升高，Zn-Cd处理较单一Cd、Zn处理含量高，表现为协同作用，与郭晓音等（2009）的研究结果一致。这可能由于重金属胁迫改变了植物体内Pro的代谢途径，影响蛋白质合成，使得Pro氧化受阻，蛋白质合成速度减慢，Pro含量升高（温瑀和穆立蔷，2013）。
MDA含量是植物受逆境胁迫时发生膜脂过氧化的最终产物，其含量直接反映植物细胞发生膜脂过氧化的程度（张宇君等，2018）。本研究中，Pb-Zn、Pb-Cd和Cd-Zn复合胁迫的MDA含量较Pb、Zn、Cd单一胁迫高，说明Pb与Zn、Pb与Cd、Cd与Zn在对多年生黑麦草MDA的影响上表现为协同，Pb-Zn-Cd交互较复杂有待进一步研究。 自然界中重金属污染物通常不是单独存在的，而是相互伴生。相同的复合污染对不同的效应和指标可能会表现出不同的效果（郭俊娒等，2019）。本研究发现Pb-Zn、Pb-Cd、Zn-Cd和Pb-Zn-Cd交互作用对多年生黑麦草生长和生理指标的影响各不相同。Pb-Zn交互胁迫对多年生黑麦草株高、根长、叶绿素总量、Pro含量和MDA含量的交互效应是拮抗作用，对叶绿素b和SS含量则是协同作用;Pb-Cd交互胁迫对Pro、SS和MDA含量是拮抗作用，对SOD活性是协同作用;Zn-Cd交互胁迫对地上生物量、地下生物量及叶绿素a、类胡萝卜素、Pro、SS和MDA含量是拮抗作用;Pb-Zn-Cd交互胁迫对株高、叶宽、根长、分蘖数、根冠比、POD活性、Pro含量和MDA含量是拮抗作用，对叶绿素a含量、类胡萝卜素含量、叶绿素总量、光合色素总量、SOD活性和SS含量是协同作用。通过隶属函数综合评价得知，Zn处理隶属函数值最大，有利于多年生黑麦草的生长，较其他胁迫处理更具优势;Pb-Zn-Cd胁迫处理隶属函数值最小，对多年生黑麦草的伤害最大。
4 结论
本研究得出多年生黑麦草对各处理的耐受性为：Zn>CK>Cd>Zn-Cd>Pb-Zn>Pb>Pb-Cd>Pb-Zn-Cd。其中Zn对多年生黑麦草的抗性有促进作用，多年生黑麦草在Pb-Zn-Cd复合胁迫中耐受性最差，可为多年生黑麦草修复Pb/Zn/Cd污染提供一定的理论依据。
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（責任编辑 罗 丽）