【摘 要】
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目的:为揭示E1A激活基因阻遏子(CREG1)在人血管平滑肌细胞(VSMCs)和人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中表达的调控机制,构建人CREG1(hCREG1)启动子报告基因载体,探讨CREG1在不同血管
【机 构】
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沈阳军区总医院全军心血管病研究所心内科
【基金项目】
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国家自然科学基金资助项目(No.30570664);辽宁省自然科学基金资助项目(No.2050426)
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目的:为揭示E1A激活基因阻遏子(CREG1)在人血管平滑肌细胞(VSMCs)和人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中表达的调控机制,构建人CREG1(hCREG1)启动子报告基因载体,探讨CREG1在不同血管细胞中的表达。方法:在对hCREG1进行生物信息学分析的基础上,以人基因组DNA为模板,PCR方法扩增含有hCREG1基因上游-3677bp序列,构建了hCREG15′上游-3677bp、-2310bp和-945bp序列片段,分别将这3个序列克隆到pMD18-T载体上并定向亚克隆到pEGFP-1报告基因载体-pEGFP-hCREG1-P3677、pEGFP-hCREG1-P2310和pEGFP-hCREG1-P945。将重组质粒瞬时转染VSMCs株HITASY和HUVECs,检测绿色荧光蛋白(GFP)的表达。结果:经测序鉴定证实,3个报告基因载体中插入的PCR扩增序列均与hCREG1基因上游DNA序列完全匹配。瞬时转染体外培养的人VSMCs和HUVECs后,经荧光观察和蛋白质印迹(Western blotting)证实,细胞内存在GFP的表达,并且0.5%FBS培养的HITASY细胞中GFP表达较10%FBS培养的细胞中明显增加。HU-VECs中的GFP表达较人VSMCs明显增加。结论:hCREG1基因启动子报告基因载体构建成功,核心启动子存在于5′上游序列的-945bp-0bp区域,为进一步研究hCREG1基因表达提供了条件。
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