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动物细胞培养开始于本世纪初 1962 年， 其规模不断的扩大， 发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法，， 而大规模动物细胞培养技术已经成为生物技术制药中非常重要的环节。目前， 大规模动物细胞培养技术在兽用生物制品上面，也已经开始了一些大规模的生产应用，细胞大规模培养技术作为行业技术升级改革的重要内容，农业部自2012年2月1日起，停止受理转瓶培养生产方式的的兽用细胞苗生产线项目兽药GMP验收申请。因此，传统转瓶工艺的应用越来越受到限制使用。自从20世纪60年代微载体生物反应器培养技术建立以来，国外许多国家对其在疫苗生产中的应用进行了广泛研究，细胞悬浮培养已是当前国际上生物制品生产的主流模式。动物细胞有悬浮培养和贴壁培养两种，技术水平的提高主要集中在培养规模的扩大、细胞培养环境的优化、细胞特性的改变、不断提高产品的产量及保证其质量上。本文就大规模动物细胞培养技术在兽用疫苗上的应用进行综述，分析了其在獸用生物制品产业的发展趋势。
一、动物细胞培养方法
1.贴壁培养
贴壁培养是指细胞贴附在某种载体上，载体悬浮在反应器里的培养方法，一切贴壁型细胞都能够适用于贴壁培养。在实际生产中具有贴壁生长特性的细胞种类较多，如CHO细胞、PK—15细胞、ST细胞和Vero细胞等。由于贴壁细胞具有贴壁的要求，提高细胞的密度就是使细胞培养规模最大化的有效方法。传统的贴壁细胞培养包括方瓶、扁瓶、转瓶等。但是由于其不能有效监控细胞的生长，操作比较复杂，所占空间大，劳动量也大，贴附面积具有限制性，在实际生产使用中受到极大的限制。目前，贴壁细胞的微载体培养在细胞生产中得到广泛的应用。
2.悬浮培养
悬浮生长的细胞其培养和传代都十分简便，细胞经过一定程度的驯化培养后，直接悬浮在适宜的液体培养基中，置于特定的培养条件下即可良好的生长。传代时也不需要再进行分散，只需要添加一定比例的培养基即可继续生长。目前用于悬浮培养的细胞也在逐渐增加，以前主要有昆虫细胞和杂交瘤细胞等，现在发展到BHK-21和sk6细胞等，悬浮培养培养的规模大，操作工艺也简单，培养的细胞增殖快，而且产量高，是大规模培养动物细胞的首选模式之一。
3.动物细胞的大规模培养
动物细胞大规模培养技术是建立在贴壁培养和悬浮培养的基础上，参考了早期的流式细胞培养术、融合了固定化细胞培养技术、填充床培养技术、更是汇合了人工灌流和搅拌系统等生物反应器培养技术发展起来的，目前已广泛用于生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单克隆抗体等，已成为医药生物高技术产业的重要组成部分。目前较成熟且有应用价值的规模化培养方法主要包括：中空纤维法、微囊法和微载体法等。
空心纤维法：空心纤维培养法是Richard krrcazek等在1972年创建的，最初使用的空心纤维是由醋酸纤维素和硝酸纤维素混合组成的可透性滤膜，外径约为1/3～3/4mm，表面具有海绵多孔结构，能水分子、营养物质和气体透过，也能让细胞贴附在上面生长。这种培养系统的核心部分是由3～6层这样的空心纤维组成的，培养时将待培养细胞接种于空心纤维的外腔，培养一段时间后，当细胞密度达到一定密度时，细胞不再增殖，但能正常维持并继续分泌所需的蛋白质或其他生物物质。这种培养方式在分离和纯化细胞分泌物时很方便，因而在生产激素和单抗时被广泛应用。
微囊法：微囊细胞培养法是美国Damon Biotech公司创建的一种比较理想的大规模动物细胞培养方法，其基本技术是先将要培养的动物细胞悬浮于海藻酸钠溶液中，之后使其通过成滴装置（微囊发生器）逐滴滴入CaCl2溶液中，海藻酸钠一进入CaCl2溶液后即形成半透膜微囊，从而将细胞封闭在内，然后将包含有细胞的微囊悬浮于培养液中培养。培养液中的营养物质可通过半透膜进入微囊提供给细胞，细胞的代谢产物也可透过半透膜被排出，而细胞分泌的大分子物质则被阻拦而积累与囊内。当培养一段时间后，在细胞密度达到107/ml时，分离收集微囊，最后破开微囊就可获得高度纯化的大分子产物。
微载体法：微载体培养法是Wezel在1967年创建的。采用的微载体是由天然的葡聚糖、纤维素或胶原等物质制成固体小球，直径在60—250微米。其原理是将对细胞无害的微载体加入到培养液中，作为载体，使细胞贴附于载体表面生长，同时通过持续搅拌使将载体均匀悬浮于培养液中，微载体方法不但能使细胞均匀分布，也提供了极大的培养表面积/体积比，因此单位体积培养液的细胞产率高，将悬浮培养和贴壁培养融合在一起，兼有两则的特点，适用于各种细胞的大规模培养，收获过程简单，而且放大生产也较容易。因而是一种比较理想的培养方法，只是此法对载体要求较高。
4.用于病毒生产的细胞系的选择
目前，用于培养病毒的细胞系包括Vero细胞、BHK—21细胞、MDCK、PK—15、ST及Marc—145细胞等。Vero细胞是用来生产禽传染性法氏囊病毒、狂犬病毒等；MDCK用来制备禽流感病毒；PK—15用来培养猪圆环病毒；Marc—145细胞用来培养猪蓝耳病病毒；ST细胞用来培养猪瘟病毒等。目前，这些病毒生产基本上都采用传统的转瓶培养，所占场地大，操作复杂，批次间差异较大。目前国内已有一些单位采用生物反应器来优化培养细胞、病毒的培养条件，并取得了一定的进展，如利用生物反应器纯悬浮培养sf-9细胞生产杆状病毒基因重组疫苗，应用反应器悬浮培养 BHK—21细胞生产口蹄疫病毒也成为了较成熟的口蹄疫疫苗生产方式，应用生物反应器微载体培养MDCK细胞生产禽流感疫苗。
二、动物细胞生物反应器
动物细胞生物反应器作为细胞大规模培养的关键设备，目前较为常用的反应器有：搅拌式生物反应器、气升式生物反应器、固定床和流化床生物反应器、一次性生物反应器。
根据动物细胞培养类型不同，我们通常选用的的生物反应器一般分为三类：悬浮培养用生物反应器、贴壁培养用生物反应器、包埋培养用生物反应器。 1.悬浮培养用生物反应器
悬浮培养生物反应器不需要使用微载体，细胞在生物反应器中无需忒比，悬浮于细胞培养液中生长，如搅拌式生物反应器。气升式生物反应器等，其中，搅拌式生物反应器相比较气升式而言，操作简单，规模较容易放大。
2.贴壁培养用生物反应器
贴壁用生物反应器要使用微载体，细胞贴附在微载体上，悬浮于反应器中的营养液中生长。如搅拌式生物反应器、中空纤维生物反应器等。其中，搅拌式生物反应器相比而言，放大较为容易。
3.包埋培养用生物反应器
包埋用生物反应器使用多空载体或者微囊，细胞被截留在载体中或者包埋于微囊中，可以使用于悬浮细胞培养，也可以用于贴壁细胞培养。如流化床生物反应器、固定床生物反应器等，主要优点在于可以最大程度降低搅拌式产生的剪切力对细胞的伤害。但是不容易放大培养。
三、生物反应器细胞培养工艺的选择
无论是贴壁细胞还是纯悬浮细胞，按照其培养工艺都可以分为批次培养，流加培养以及灌注培养三种。
1.批次培养
批次培养主要采用机械搅拌式生物反应器，将细胞扩大培养后，和培养基一次性加入生物反应器内进行培养，在培养过程中除了调节pH和溶氧外，不添加其它成分，其体积不变，直至培养结束。
这种培养工艺操作简单易学，可直观的反应细胞生长代谢的过程，主要应用于生产抗体和蛋白方面。
但是批次培养，初始营养物质丰富，易造成细胞过量使用，产生大量代谢产物，使细胞生长受到抑制。应对措施在培养过程，尤其是在培养后期补充添加营养物质。
2.流加培养
流加培养是在批次培养的基础上，采用机械搅拌式生物反应器系统，悬浮培养细胞或以悬浮微载体培养贴壁细胞等，细胞初始接种的培养基不适一次性地加入到反应器中，而是在培养过程中根据细胞生长代谢的情况逐渐补加，维持葡萄糖、谷氨酰胺等营养物质，从而使细胞持续生长至较高的密度，目标产品达到较高的水平，流加培养由于其操作的简易行、易放大性和灵活性，已经被广泛应用于多种生物制品的生产，如动物细胞表达的兽用生物制品的生产。
3.灌注培养
灌注培养是指将细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断地灌注新的培养基，同时地将部分培养基取出。
灌注培养常使用的生物反应器主要有两种形式。一种是用具有细胞截流装置的搅拌式生物反应器悬浮培养细胞，中空纤维生物反应器是连续灌流操作常用的一种。它采用的中空纤维半透膜，透过小分子量的产物和底物，截流细胞和分子量较大的产物；近年来中空纤维生物反应器被广泛应用于产物分泌性动物细胞的生产，主要用于培养杂交瘤细胞生產单克隆抗体。另外一种形式是固定床和流化床生物反应器，固定床是在反应器中装配固定的篮筐，中间装填聚脂纤维载体，细胞可附着在载体上生长，也可固定在载体纤维之间，靠上搅拌中产生的负压，迫使培养基不断流经填料，有利于营养成分和氧的传递，这种形式的灌流速度较大，细胞在载体中高密度生长。流化床生物反应器是通过流体的上升运动使固体颗粒维持在悬浮状态进行反应，适合于固定化细胞的培养。
灌注培养的优点是：①细胞截流系统可使细胞或酶保留在反应器内，维持较高细胞密度，一般可达107-109/ml，从而较大的提高了产品的产量；②连续灌流系统，使细胞稳定的处在较好的的营养环境中，有害代谢废物浓度积累较低；③反应速率容易控制，培养周期较长，可提高生产率，目标产品回收率高；④产品在罐内停留时间短，可及时回收到低温下保存，有利于保持产品的活性。
不足之处在于操作繁琐，培养基利用率低，工艺放大较困难。在生产中灌注培养主要应用于贴壁细胞的悬浮微载体培养。
四、生物反应器动物细胞培养放大工艺
反应器的规模放大通常有两种方法：增加反应器的体积和增加反应器的数量。目前在生产中一般将两者结合起来。无论是悬浮细胞还是贴壁细胞，放大工艺都是采用细胞转瓶和反应器不断进行逐级放大。根据细胞的两种培养方法，培养放大工艺也份额外纯悬浮放大工艺和微载体培养放大工艺。
1.纯悬浮培养放大工艺
纯悬浮培养方式生长环境均一，规模放大简单，可直接实现反应器到反应器之间的放大，目前，此项技术较为成熟。
2.微载体培养放大工艺
微载体放大工艺较复杂，大规模生产中放大较为困难，细胞贴附在为载体上生长，要实现放大，需要将细胞从微载体上消化收获下来，再接种到下一级的反应器中，在实际生产中，细胞经过消化，活性会受到伤害，影响其再次贴壁生长，因此目前国内应用微载体培养的反应器体积一般较小，通常直接将转瓶细胞放大到反应器中，对于进一步放大还有一定的难度。
生物反应器为主题的细胞大规模培养工艺是提升我们生物制品企业生产效率、生产规模、产品质量的基础。为了提高产能，降低成本，提升产品质量，很多企业都加大研发和建立疫苗悬浮培养生产线，但是在建立之前就需要明确上述前提条件：打算生产的疫苗品种以及预计所需要的产能大小：选择生产所需要的细胞类型，根据细胞培养特点，选择细胞培养工艺，根据细胞和病毒的关系，选择反应器培养操作方式， 最后选取合适的生物反应器和反应器工艺。
一、动物细胞培养方法
1.贴壁培养
贴壁培养是指细胞贴附在某种载体上，载体悬浮在反应器里的培养方法，一切贴壁型细胞都能够适用于贴壁培养。在实际生产中具有贴壁生长特性的细胞种类较多，如CHO细胞、PK—15细胞、ST细胞和Vero细胞等。由于贴壁细胞具有贴壁的要求，提高细胞的密度就是使细胞培养规模最大化的有效方法。传统的贴壁细胞培养包括方瓶、扁瓶、转瓶等。但是由于其不能有效监控细胞的生长，操作比较复杂，所占空间大，劳动量也大，贴附面积具有限制性，在实际生产使用中受到极大的限制。目前，贴壁细胞的微载体培养在细胞生产中得到广泛的应用。
2.悬浮培养
悬浮生长的细胞其培养和传代都十分简便，细胞经过一定程度的驯化培养后，直接悬浮在适宜的液体培养基中，置于特定的培养条件下即可良好的生长。传代时也不需要再进行分散，只需要添加一定比例的培养基即可继续生长。目前用于悬浮培养的细胞也在逐渐增加，以前主要有昆虫细胞和杂交瘤细胞等，现在发展到BHK-21和sk6细胞等，悬浮培养培养的规模大，操作工艺也简单，培养的细胞增殖快，而且产量高，是大规模培养动物细胞的首选模式之一。
3.动物细胞的大规模培养
动物细胞大规模培养技术是建立在贴壁培养和悬浮培养的基础上，参考了早期的流式细胞培养术、融合了固定化细胞培养技术、填充床培养技术、更是汇合了人工灌流和搅拌系统等生物反应器培养技术发展起来的，目前已广泛用于生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单克隆抗体等，已成为医药生物高技术产业的重要组成部分。目前较成熟且有应用价值的规模化培养方法主要包括：中空纤维法、微囊法和微载体法等。
空心纤维法：空心纤维培养法是Richard krrcazek等在1972年创建的，最初使用的空心纤维是由醋酸纤维素和硝酸纤维素混合组成的可透性滤膜，外径约为1/3～3/4mm，表面具有海绵多孔结构，能水分子、营养物质和气体透过，也能让细胞贴附在上面生长。这种培养系统的核心部分是由3～6层这样的空心纤维组成的，培养时将待培养细胞接种于空心纤维的外腔，培养一段时间后，当细胞密度达到一定密度时，细胞不再增殖，但能正常维持并继续分泌所需的蛋白质或其他生物物质。这种培养方式在分离和纯化细胞分泌物时很方便，因而在生产激素和单抗时被广泛应用。
微囊法：微囊细胞培养法是美国Damon Biotech公司创建的一种比较理想的大规模动物细胞培养方法，其基本技术是先将要培养的动物细胞悬浮于海藻酸钠溶液中，之后使其通过成滴装置（微囊发生器）逐滴滴入CaCl2溶液中，海藻酸钠一进入CaCl2溶液后即形成半透膜微囊，从而将细胞封闭在内，然后将包含有细胞的微囊悬浮于培养液中培养。培养液中的营养物质可通过半透膜进入微囊提供给细胞，细胞的代谢产物也可透过半透膜被排出，而细胞分泌的大分子物质则被阻拦而积累与囊内。当培养一段时间后，在细胞密度达到107/ml时，分离收集微囊，最后破开微囊就可获得高度纯化的大分子产物。
微载体法：微载体培养法是Wezel在1967年创建的。采用的微载体是由天然的葡聚糖、纤维素或胶原等物质制成固体小球，直径在60—250微米。其原理是将对细胞无害的微载体加入到培养液中，作为载体，使细胞贴附于载体表面生长，同时通过持续搅拌使将载体均匀悬浮于培养液中，微载体方法不但能使细胞均匀分布，也提供了极大的培养表面积/体积比，因此单位体积培养液的细胞产率高，将悬浮培养和贴壁培养融合在一起，兼有两则的特点，适用于各种细胞的大规模培养，收获过程简单，而且放大生产也较容易。因而是一种比较理想的培养方法，只是此法对载体要求较高。
4.用于病毒生产的细胞系的选择
目前，用于培养病毒的细胞系包括Vero细胞、BHK—21细胞、MDCK、PK—15、ST及Marc—145细胞等。Vero细胞是用来生产禽传染性法氏囊病毒、狂犬病毒等；MDCK用来制备禽流感病毒；PK—15用来培养猪圆环病毒；Marc—145细胞用来培养猪蓝耳病病毒；ST细胞用来培养猪瘟病毒等。目前，这些病毒生产基本上都采用传统的转瓶培养，所占场地大，操作复杂，批次间差异较大。目前国内已有一些单位采用生物反应器来优化培养细胞、病毒的培养条件，并取得了一定的进展，如利用生物反应器纯悬浮培养sf-9细胞生产杆状病毒基因重组疫苗，应用反应器悬浮培养 BHK—21细胞生产口蹄疫病毒也成为了较成熟的口蹄疫疫苗生产方式，应用生物反应器微载体培养MDCK细胞生产禽流感疫苗。
二、动物细胞生物反应器
动物细胞生物反应器作为细胞大规模培养的关键设备，目前较为常用的反应器有：搅拌式生物反应器、气升式生物反应器、固定床和流化床生物反应器、一次性生物反应器。
根据动物细胞培养类型不同，我们通常选用的的生物反应器一般分为三类：悬浮培养用生物反应器、贴壁培养用生物反应器、包埋培养用生物反应器。 1.悬浮培养用生物反应器
悬浮培养生物反应器不需要使用微载体，细胞在生物反应器中无需忒比，悬浮于细胞培养液中生长，如搅拌式生物反应器。气升式生物反应器等，其中，搅拌式生物反应器相比较气升式而言，操作简单，规模较容易放大。
2.贴壁培养用生物反应器
贴壁用生物反应器要使用微载体，细胞贴附在微载体上，悬浮于反应器中的营养液中生长。如搅拌式生物反应器、中空纤维生物反应器等。其中，搅拌式生物反应器相比而言，放大较为容易。
3.包埋培养用生物反应器
包埋用生物反应器使用多空载体或者微囊，细胞被截留在载体中或者包埋于微囊中，可以使用于悬浮细胞培养，也可以用于贴壁细胞培养。如流化床生物反应器、固定床生物反应器等，主要优点在于可以最大程度降低搅拌式产生的剪切力对细胞的伤害。但是不容易放大培养。
三、生物反应器细胞培养工艺的选择
无论是贴壁细胞还是纯悬浮细胞，按照其培养工艺都可以分为批次培养，流加培养以及灌注培养三种。
1.批次培养
批次培养主要采用机械搅拌式生物反应器，将细胞扩大培养后，和培养基一次性加入生物反应器内进行培养，在培养过程中除了调节pH和溶氧外，不添加其它成分，其体积不变，直至培养结束。
这种培养工艺操作简单易学，可直观的反应细胞生长代谢的过程，主要应用于生产抗体和蛋白方面。
但是批次培养，初始营养物质丰富，易造成细胞过量使用，产生大量代谢产物，使细胞生长受到抑制。应对措施在培养过程，尤其是在培养后期补充添加营养物质。
2.流加培养
流加培养是在批次培养的基础上，采用机械搅拌式生物反应器系统，悬浮培养细胞或以悬浮微载体培养贴壁细胞等，细胞初始接种的培养基不适一次性地加入到反应器中，而是在培养过程中根据细胞生长代谢的情况逐渐补加，维持葡萄糖、谷氨酰胺等营养物质，从而使细胞持续生长至较高的密度，目标产品达到较高的水平，流加培养由于其操作的简易行、易放大性和灵活性，已经被广泛应用于多种生物制品的生产，如动物细胞表达的兽用生物制品的生产。
3.灌注培养
灌注培养是指将细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断地灌注新的培养基，同时地将部分培养基取出。
灌注培养常使用的生物反应器主要有两种形式。一种是用具有细胞截流装置的搅拌式生物反应器悬浮培养细胞，中空纤维生物反应器是连续灌流操作常用的一种。它采用的中空纤维半透膜，透过小分子量的产物和底物，截流细胞和分子量较大的产物；近年来中空纤维生物反应器被广泛应用于产物分泌性动物细胞的生产，主要用于培养杂交瘤细胞生產单克隆抗体。另外一种形式是固定床和流化床生物反应器，固定床是在反应器中装配固定的篮筐，中间装填聚脂纤维载体，细胞可附着在载体上生长，也可固定在载体纤维之间，靠上搅拌中产生的负压，迫使培养基不断流经填料，有利于营养成分和氧的传递，这种形式的灌流速度较大，细胞在载体中高密度生长。流化床生物反应器是通过流体的上升运动使固体颗粒维持在悬浮状态进行反应，适合于固定化细胞的培养。
灌注培养的优点是：①细胞截流系统可使细胞或酶保留在反应器内，维持较高细胞密度，一般可达107-109/ml，从而较大的提高了产品的产量；②连续灌流系统，使细胞稳定的处在较好的的营养环境中，有害代谢废物浓度积累较低；③反应速率容易控制，培养周期较长，可提高生产率，目标产品回收率高；④产品在罐内停留时间短，可及时回收到低温下保存，有利于保持产品的活性。
不足之处在于操作繁琐，培养基利用率低，工艺放大较困难。在生产中灌注培养主要应用于贴壁细胞的悬浮微载体培养。
四、生物反应器动物细胞培养放大工艺
反应器的规模放大通常有两种方法：增加反应器的体积和增加反应器的数量。目前在生产中一般将两者结合起来。无论是悬浮细胞还是贴壁细胞，放大工艺都是采用细胞转瓶和反应器不断进行逐级放大。根据细胞的两种培养方法，培养放大工艺也份额外纯悬浮放大工艺和微载体培养放大工艺。
1.纯悬浮培养放大工艺
纯悬浮培养方式生长环境均一，规模放大简单，可直接实现反应器到反应器之间的放大，目前，此项技术较为成熟。
2.微载体培养放大工艺
微载体放大工艺较复杂，大规模生产中放大较为困难，细胞贴附在为载体上生长，要实现放大，需要将细胞从微载体上消化收获下来，再接种到下一级的反应器中，在实际生产中，细胞经过消化，活性会受到伤害，影响其再次贴壁生长，因此目前国内应用微载体培养的反应器体积一般较小，通常直接将转瓶细胞放大到反应器中，对于进一步放大还有一定的难度。
生物反应器为主题的细胞大规模培养工艺是提升我们生物制品企业生产效率、生产规模、产品质量的基础。为了提高产能，降低成本，提升产品质量，很多企业都加大研发和建立疫苗悬浮培养生产线，但是在建立之前就需要明确上述前提条件：打算生产的疫苗品种以及预计所需要的产能大小：选择生产所需要的细胞类型，根据细胞培养特点，选择细胞培养工艺，根据细胞和病毒的关系，选择反应器培养操作方式， 最后选取合适的生物反应器和反应器工艺。