背景:二倍体成纤维细胞常用于研究细胞水平的衰老,β-半乳糖苷酶是鉴别衰老细胞的标志酶,本实验拟观察正常人成纤维细胞在体外培养过程中β-半乳糖苷酶的变化情况。目的:建立一个稳定的二倍体成纤维细胞体外培养体系,了解正常人成纤维细胞老化过程中β-半乳糖苷酶的变化规律。设计:自身对照实验。单位:潍坊医学院整形外科研究所、潍坊医学院附属医院普外科。材料:实验于2000-09/2002-09在潍坊医学院整形外科研究所完成。实验样本来源于在潍坊医学院附属医院普外科行包皮环切术的6～8岁正常男性儿童(n=20)切除的健康包皮组织。方法:①成纤维细胞培养:取包皮组织,分离真皮和表皮,真皮部分用含100mL/L胎牛血清DMEM培养液终止胰蛋白酶作用,再用200U/mLⅠ型胶原酶37℃条件下消化30min,收集细胞悬液,接种于培养皿中,细胞培养达80%汇合时进行传代培养。②细胞鉴定:用相差显微镜观察细胞形态变化及生长增殖情况、透射电镜及抗vimentin免疫细胞化学染色。③细胞生物学行为的观察对比:取生长状态良好的细胞,按群体倍增水平分为两组,第一组代表年轻细胞,采用10代龄;第二组代表老化细胞,采用65代龄。进行消化传代,分别按2×104,4×104分别接种于24孔培养板内。每隔24h消化计数,每次每组计数3孔,计算均值。共记数8d,以培养时间为横轴,细胞数为纵轴,绘制生长曲线并计算细胞的群体倍增时间。④β-半乳糖苷酶组化检测及阳性细胞的半定量分析:成纤维细胞每5n代龄(共13代)作细胞爬片,漂洗,加入SA-β-gal染色液,37℃孵育48h。在显微镜下观察计数,蓝染细胞为阳性细胞,每次随机挑选视野计数500个细胞,得到阳性细胞百分率。主要观察指标:①正常人成纤维细胞生物学行为的改变。②正常人成纤维细胞老化过程中β-半乳糖苷酶的表达。结果:①正常人成纤维细胞生物学行为的改变:细胞生长曲线显示,老化细胞生长速度较年轻细胞明显减慢。年轻细胞最大增殖数约为47.3×105,对数生长期在3.0～6.0d,细胞倍增时间为2.18d。老化细胞最大增殖数各为8.5×104,对数生长期分别在4.0～7.5d,细胞群体倍增时间依次为3.86d。②正常人成纤维细胞老化过程中β-半乳糖苷酶的表达:与年轻细胞组(阳性细胞率=4%)相比,衰老细胞组中阳性细胞率(60%)大为增强。直线相关分析结果显示,β-半乳糖苷酶染色的阳性率和细胞代龄之间呈显著正相关(r=0.92,P<0.01)。结论:在正常人成纤维细胞从年轻向老化发展的过程中,细胞群体倍增时间呈增高的趋势;与年轻细胞相比较(占4%),β-半乳糖苷酶的表达在老化细胞中显著增强(占60%),且这种增强与细胞衰老表型的出现和细胞增殖能力的丧失相平行,可反应细胞的老化程度。本实验为建立成纤维细胞衰老模型提供了实验依据,同时也为老年学及肿瘤生物学甚至组织工程学发展提供科学依据。