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摘要 乙酰乳酸合成酶（ALS）是支链氨基酸生物合成途径中的关键酶之一，是磺酰脲类除草剂的作用靶标。针对目前市场上使用的4种ALS除草剂，对ALS抑制剂类除草剂的抗性杂草问题， ALS氨基酸序列中关键位点替换对ALS酶活性的影响与ALS基因编辑等方面的相关研究进展进行了概述。
关键词 乙酰乳酸合成酶;除草剂;抗性杂草;基因编辑
中图分类号 S482.4文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2019）04-0018-04
Abstract Acetolactate synthase （ALS） is a key enzyme in the branched chain amino acid biosynthesis pathway，and it is an important target for sulfonylurea herbicides.This article is a brief overview of study about ALS inhibitor herbicides and resistance weeds problem，including ALS inhibitor herbicides used in commercial，the problem of resistance weeds to ALS herbicides，the effect of ALS enzyme activity resulting from the ALS amino acids subsititution，and ALS gene editing.
Key words Acetylactate synthase;Herbicides;Resistance weeds;Gene editing
乙酰乳酸合成酶（acetolactate synthase，ALS，EC 2.2.1.6）是催化支鏈氨基酸（缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸）生物合成途径中的关键酶之一。ALS酶只存在于植物和微生物体内，如果采用ALS抑制剂对植物，包括农作物进行处理，不会影响食草动物和人类体内支链氨基酸的生物合成，因此ALS抑制剂的使用对动物而言具有生物安全性[1]。酶活性的发挥与酶蛋白的结构密切相关，对于ALS而言，其结构的解析是深入研究和利用ALS的基础。关于乙酰乳酸合成酶ALS的结构研究，首先是在大肠杆菌（Escherichia coli）中进行的，并且到目前为止，大肠杆菌ALS酶的结构也是研究最为清楚的。研究发现大肠杆菌的ALS酶为四聚体，由2个大亚基和2个小亚基组成，大亚基的分子量约为60 kD，小亚基的分子量为10～20 kD[2-6]。
自从ALS酶的结构开始解析以来，针对ALS酶为靶标的除草剂的研发也如火如荼展开着。农药工作者先后开发出了不同系列的抑制剂，并成功推广为商业化使用的除草剂。随着除草剂的大量使用，特别是同一种除草剂的连续使用，杂草对某些抑制剂产生了抗性。为消除杂草，一些除草剂被加大剂量使用，尤其是残留期较长的除草剂的使用，对土壤质地和农作物的正常生长造成严重危害，近年来关于ALS除草剂的结构、除草活性与抗性杂草问题的研究逐步深入，并取得了可喜的进展。笔者概括了近年使用的几种主要ALS除草剂及其抗药性问题，同时围绕ALS酶编码基因介绍了基因编辑等方面的主要研究进展。
1 ALS抑制剂类除草剂的作用和应用
1.1 作用
ALS抑制剂类除草剂不仅对动物具有生物安全性，而且该类除草剂的使用量显著低于其他除草剂，具有广谱除草、选择性强、低毒高效、土壤残留活性低的优点[7]。现已开发出的ALS抑制剂类除草剂共有13类50余种，包括磺酰脲类（sulfonylureas，SU）[8-9]、嘧啶氧苯甲酸类（pyrimidinyloxy benzoic acids，PTB，又称嘧啶水杨酸类）[10-11]、咪唑啉酮类（imidazolinones，IMI）[12]和三唑并嘧啶磺酰胺类（triazolopyrimidine sulfonanilides，SUT）[13]等主要类型[14]。它们的作用机制相同，都是通过抑制乙酰乳酸合成酶的活性，从而影响支链氨基酸和蛋白质的合成，导致植物生长停止而死亡。植物吸收上述4类除草剂的方式也相同，都通过茎叶和根吸收后在木质部与韧皮部传导进行传输，最后积累于分生组织，即通过内吸传导作用进行。
1.2 应用 虽然这4类除草剂的作用和吸收方式相同，但是它们的结构（图1）[15]、作用杂草的种类、使用剂量、残留期等有所不同（表1），因此，针对不同的作物需要有选择地使用不同类型的ALS除草剂。
2 ALS抑制剂类除草剂的抗性杂草问题
生产实践中ALS类除草剂的使用推广极大地提高了农业生产的产量，减少了人力除草的成本，显著增加了农民的经济收入。但过度依赖单一除草剂（或作用位点相同的除草剂）可能导致对这种或这类除草剂有抗性的杂草种群出现[16]。特别是ALS抑制剂类除草剂，一直因其作用靶标单一且易诱发杂草抗性而面临着众多问题。不同种类的ALS除草剂的应用作物之间有一定的特异性，使得某些作物中的杂草只能长期使用同种除草剂，这样便导致ALS除草剂抗性杂草的快速发生。
1998年ALS抑制剂类除草剂在已被报道的抗性杂草数量方面超过了所有其他类除草剂（图2）[17]。近年，ALS抑制剂类除草剂面临的杂草抗性问题呈现进一步恶化的趋势。由表2可知（通过总结统计Weed Science网站http：∥www.weedscience.org/数据做图），仅2016、2017年2年时间，便已发现有22例ALS抗性杂草情况的发生。因此亟需对ALS抑制剂类除草剂的抗性问题展开深入研究。 3 ALS基因中突變位点的研究
Lawther等[18]首先在大肠杆菌中发现并克隆到了ALS基因。Falco等[19]在酵母（Saccharomyces cerevisiae）中也发现并克隆到了ALS基因。截至目前，借助于拟南芥和烟草的基因组文库信息，相继筛选到了多种植物的ALS基因[20-21]。其中拟南芥ALS基因的发现和克隆有着重要的意义，其为人们发掘植物，特别是农作物的ALS基因提供了重要的信息。Wiersma等[22]发现芸苔属的多个种具有ALS基因，且发现该物种存在4个以上的ALS基因。李汝刚等[23]研究也发现ALS基因在芸苔属亚种间和品种间存在广泛的遗传变异性。
磺酰脲类Sultonylureas磺酰脲桥结构是具备较高活性的决定因素4～701年生或多年生阔叶杂草及部分禾本科氯磺隆、甲磺隆、胺苯磺隆、氯嘧磺隆、单嘧磺隆残效期长可化学水解、微生物降解、光解或挥发无伤害（除残效期长品种外）
4 ALS基因编辑研究
由上所述可知，抗性杂草ALS基因位点的突变是引起抗性的分子基础，意味着通过ALS基因的优化有望解决抗性杂草问题。近年来不同研究组证实ALS酶中氨基酸序列的替换是解决ALS抑制剂类除草剂抗性杂草多发问题的策略。如许多课题组针对ALS氨基酸替换展开研究，包括单点突变和多点同时突变等，以期解决抗性杂草带来的作物减产等严重问题。有的通过利用杂草产生的自然突变位点来培育抗性作物，更多的是采用基因编辑技术对ALS基因进行点突变以获得抗性作物。
综合近年对ALS氨基酸序列进行点突变的研究报道发现，大多研究是针对ALS氨基酸序列中高发生突变位点进行编辑。研究最多是针对杂草中197位的Pro突变，作物中Pro位点的突变能使其产生磺酰脲类除草剂抗性。如2015年，有报道显示利用Cas9的基因编辑技术对玉米的ALS基因进行了点突变处理，用Ser替换了165位的Pro，培育出了抗除草剂（氯磺隆）的基因编辑玉米。转基因株系的除草剂处理显示，无论是对4周龄的幼苗进行氯磺隆喷洒，还是在培养玉米种子的培养基中直接添加氯磺隆，未做编辑的野生型已经出现叶片黄化、植株矮小萎蔫的生长状况，而经编辑的株系生长正常[26]。2017年，Chen等[27]在拟南芥中，利用传统Cas9系统结合胞苷脱氨酶BE3使197位Pro的C碱基变为T碱基，结果发现在使用5 mg/L苯磺隆处理的情况下，野生型完全无法生长而突变株生长状况与无处理的对照组差异很小。2018年，北京市农林科学院国家蔬菜工程技术中心许勇研究团队与中国农业大学姜临建课题组合作利用CRISPR/Cas9单碱基编辑技术在西瓜内源ALS基因上引入了单碱基突变，使190位的Pro被Ser替换，创制出全球首个基因编辑抗除草剂（苯磺隆）的西瓜[28]。
另外，也有针对其他热点的单突变，如杂草中122位的Ala突变能使作物产生磺酰脲类和咪唑啉酮类除草剂抗性。2018年Zenpei Shimatani课题组将水稻中96位（杂草中为122位）Ala替换为Val，并在0.07 mg/L甲氧咪草烟处理条件下相对野生型就已表现出明显的生长优势[29]。
除上述单位点突变，还有双位点突变成功的报道。如杂草中574位的Trp突变能使作物产生对磺酰脲类和咪唑啉酮类除草剂的抗性，杂草中653位的Ser突变能使作物产生对咪唑啉酮类除草剂的抗性，而多位点突变可能会产生交互抗性或新的除草剂抗性。2016年报道以Cas9技术对水稻ALS基因进行突变处理，分别将548位（杂草中为574位）Trp和627位（杂草中为653位）Ser 替换为Ler和Ile，培育出了抗双草醚的基因编辑水稻。使用双草醚喷洒处理五叶期基因编辑水稻和野生型水稻，结果显示野生型叶片黄化、植株矮小萎蔫十分严重，而经编辑的株系生长正常[30]。
5 展望
综上所述，尽管使用ALS除草剂是非常有效的杂草清理方法，但是由于不同种类ALS除草剂对不同作物的作用效果有较大差异，大部分作物只能依赖特定或某几种除草剂来清除杂草，这种长期过度依赖单一或一类除草剂导致抗性杂草种群的出现。针对ALS抗性杂草严重影响作物生长及产量的问题已经引起农业产业领域相关学科的极大关注，而且在未来几年，仍将是研究热点。一方面亟需设计合成，或通过对已有除草剂的修饰来开发绿色环保的新型ALS除草剂;另一方面，ALS基因的编辑有望成为解决ALS抗性杂草问题的重要途径之一。笔者所在的课题组近年也在采用基因编辑技术，对ALS基因进行点突变。以模式植物拟南芥为材料，进行改造后ALS基因的遗传转化，以探究ALS基因中特定编码氨基酸的替换是否能使拟南芥获得目的除草剂抗性，目前已经获得数个具有特定除草剂抗性的转基因拟南芥株系。
参考文献
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关键词 乙酰乳酸合成酶;除草剂;抗性杂草;基因编辑
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Abstract Acetolactate synthase （ALS） is a key enzyme in the branched chain amino acid biosynthesis pathway，and it is an important target for sulfonylurea herbicides.This article is a brief overview of study about ALS inhibitor herbicides and resistance weeds problem，including ALS inhibitor herbicides used in commercial，the problem of resistance weeds to ALS herbicides，the effect of ALS enzyme activity resulting from the ALS amino acids subsititution，and ALS gene editing.
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1 ALS抑制剂类除草剂的作用和应用
1.1 作用
ALS抑制剂类除草剂不仅对动物具有生物安全性，而且该类除草剂的使用量显著低于其他除草剂，具有广谱除草、选择性强、低毒高效、土壤残留活性低的优点[7]。现已开发出的ALS抑制剂类除草剂共有13类50余种，包括磺酰脲类（sulfonylureas，SU）[8-9]、嘧啶氧苯甲酸类（pyrimidinyloxy benzoic acids，PTB，又称嘧啶水杨酸类）[10-11]、咪唑啉酮类（imidazolinones，IMI）[12]和三唑并嘧啶磺酰胺类（triazolopyrimidine sulfonanilides，SUT）[13]等主要类型[14]。它们的作用机制相同，都是通过抑制乙酰乳酸合成酶的活性，从而影响支链氨基酸和蛋白质的合成，导致植物生长停止而死亡。植物吸收上述4类除草剂的方式也相同，都通过茎叶和根吸收后在木质部与韧皮部传导进行传输，最后积累于分生组织，即通过内吸传导作用进行。
1.2 应用 虽然这4类除草剂的作用和吸收方式相同，但是它们的结构（图1）[15]、作用杂草的种类、使用剂量、残留期等有所不同（表1），因此，针对不同的作物需要有选择地使用不同类型的ALS除草剂。
2 ALS抑制剂类除草剂的抗性杂草问题
生产实践中ALS类除草剂的使用推广极大地提高了农业生产的产量，减少了人力除草的成本，显著增加了农民的经济收入。但过度依赖单一除草剂（或作用位点相同的除草剂）可能导致对这种或这类除草剂有抗性的杂草种群出现[16]。特别是ALS抑制剂类除草剂，一直因其作用靶标单一且易诱发杂草抗性而面临着众多问题。不同种类的ALS除草剂的应用作物之间有一定的特异性，使得某些作物中的杂草只能长期使用同种除草剂，这样便导致ALS除草剂抗性杂草的快速发生。
1998年ALS抑制剂类除草剂在已被报道的抗性杂草数量方面超过了所有其他类除草剂（图2）[17]。近年，ALS抑制剂类除草剂面临的杂草抗性问题呈现进一步恶化的趋势。由表2可知（通过总结统计Weed Science网站http：∥www.weedscience.org/数据做图），仅2016、2017年2年时间，便已发现有22例ALS抗性杂草情况的发生。因此亟需对ALS抑制剂类除草剂的抗性问题展开深入研究。 3 ALS基因中突變位点的研究
Lawther等[18]首先在大肠杆菌中发现并克隆到了ALS基因。Falco等[19]在酵母（Saccharomyces cerevisiae）中也发现并克隆到了ALS基因。截至目前，借助于拟南芥和烟草的基因组文库信息，相继筛选到了多种植物的ALS基因[20-21]。其中拟南芥ALS基因的发现和克隆有着重要的意义，其为人们发掘植物，特别是农作物的ALS基因提供了重要的信息。Wiersma等[22]发现芸苔属的多个种具有ALS基因，且发现该物种存在4个以上的ALS基因。李汝刚等[23]研究也发现ALS基因在芸苔属亚种间和品种间存在广泛的遗传变异性。
磺酰脲类Sultonylureas磺酰脲桥结构是具备较高活性的决定因素4～701年生或多年生阔叶杂草及部分禾本科氯磺隆、甲磺隆、胺苯磺隆、氯嘧磺隆、单嘧磺隆残效期长可化学水解、微生物降解、光解或挥发无伤害（除残效期长品种外）
4 ALS基因编辑研究
由上所述可知，抗性杂草ALS基因位点的突变是引起抗性的分子基础，意味着通过ALS基因的优化有望解决抗性杂草问题。近年来不同研究组证实ALS酶中氨基酸序列的替换是解决ALS抑制剂类除草剂抗性杂草多发问题的策略。如许多课题组针对ALS氨基酸替换展开研究，包括单点突变和多点同时突变等，以期解决抗性杂草带来的作物减产等严重问题。有的通过利用杂草产生的自然突变位点来培育抗性作物，更多的是采用基因编辑技术对ALS基因进行点突变以获得抗性作物。
综合近年对ALS氨基酸序列进行点突变的研究报道发现，大多研究是针对ALS氨基酸序列中高发生突变位点进行编辑。研究最多是针对杂草中197位的Pro突变，作物中Pro位点的突变能使其产生磺酰脲类除草剂抗性。如2015年，有报道显示利用Cas9的基因编辑技术对玉米的ALS基因进行了点突变处理，用Ser替换了165位的Pro，培育出了抗除草剂（氯磺隆）的基因编辑玉米。转基因株系的除草剂处理显示，无论是对4周龄的幼苗进行氯磺隆喷洒，还是在培养玉米种子的培养基中直接添加氯磺隆，未做编辑的野生型已经出现叶片黄化、植株矮小萎蔫的生长状况，而经编辑的株系生长正常[26]。2017年，Chen等[27]在拟南芥中，利用传统Cas9系统结合胞苷脱氨酶BE3使197位Pro的C碱基变为T碱基，结果发现在使用5 mg/L苯磺隆处理的情况下，野生型完全无法生长而突变株生长状况与无处理的对照组差异很小。2018年，北京市农林科学院国家蔬菜工程技术中心许勇研究团队与中国农业大学姜临建课题组合作利用CRISPR/Cas9单碱基编辑技术在西瓜内源ALS基因上引入了单碱基突变，使190位的Pro被Ser替换，创制出全球首个基因编辑抗除草剂（苯磺隆）的西瓜[28]。
另外，也有针对其他热点的单突变，如杂草中122位的Ala突变能使作物产生磺酰脲类和咪唑啉酮类除草剂抗性。2018年Zenpei Shimatani课题组将水稻中96位（杂草中为122位）Ala替换为Val，并在0.07 mg/L甲氧咪草烟处理条件下相对野生型就已表现出明显的生长优势[29]。
除上述单位点突变，还有双位点突变成功的报道。如杂草中574位的Trp突变能使作物产生对磺酰脲类和咪唑啉酮类除草剂的抗性，杂草中653位的Ser突变能使作物产生对咪唑啉酮类除草剂的抗性，而多位点突变可能会产生交互抗性或新的除草剂抗性。2016年报道以Cas9技术对水稻ALS基因进行突变处理，分别将548位（杂草中为574位）Trp和627位（杂草中为653位）Ser 替换为Ler和Ile，培育出了抗双草醚的基因编辑水稻。使用双草醚喷洒处理五叶期基因编辑水稻和野生型水稻，结果显示野生型叶片黄化、植株矮小萎蔫十分严重，而经编辑的株系生长正常[30]。
5 展望
综上所述，尽管使用ALS除草剂是非常有效的杂草清理方法，但是由于不同种类ALS除草剂对不同作物的作用效果有较大差异，大部分作物只能依赖特定或某几种除草剂来清除杂草，这种长期过度依赖单一或一类除草剂导致抗性杂草种群的出现。针对ALS抗性杂草严重影响作物生长及产量的问题已经引起农业产业领域相关学科的极大关注，而且在未来几年，仍将是研究热点。一方面亟需设计合成，或通过对已有除草剂的修饰来开发绿色环保的新型ALS除草剂;另一方面，ALS基因的编辑有望成为解决ALS抗性杂草问题的重要途径之一。笔者所在的课题组近年也在采用基因编辑技术，对ALS基因进行点突变。以模式植物拟南芥为材料，进行改造后ALS基因的遗传转化，以探究ALS基因中特定编码氨基酸的替换是否能使拟南芥获得目的除草剂抗性，目前已经获得数个具有特定除草剂抗性的转基因拟南芥株系。
参考文献
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[10] 张特，赵强，康正华，等.嘧啶（ 氧） 硫苯甲酸类除草剂研究进展[J].植物保护，2018，44（2）：22-28.
[11] 刘长令.嘧啶氧（硫）苯甲酸类除草剂的创制经纬[J].农药，2002，9.
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