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【摘要】本文以LAMP技术的优缺点为分析对象，并食源性致病徽生物和临床致病微生物检测行业的发展现状进行了阐述，结合实际情况，对LAMP技术在微生物检测中的应用进行了探讨。
【关键词】LAMP技术，微生物检测，应用
中图分类号：K826文献标识码： A
一、前言
LAMP技术是随着微生物检测技术发展而不断发展的，LAMP技术在微生物检测中的应用中越来越广泛。经过几十年的迅速发展，目前LAMP技术已广泛应用于很多微生物检测当中，成为一门实用的技术。
二、LAMP技术的优缺点
1、优点
（一）、特异性强、灵敏度高
4条引物可以严格识别靶核酸序列上的6个独立区域,反应过程不会受到反应混合物种非靶序列DNA的影响,保证了LAMP扩增的高度特异性。在检测过程中可以根据是否扩增就能判断目标基因是否存在,可用于细菌或病毒的定性检测。
（二）、等温高效
LAMP在等温条件下扩增,不会因温度改变而造成时间的损失,在1 h内可将靶序列扩增至109～1010倍。而且受非靶序列的影响小,模板也不需要热变性。
（三）、整个扩增反应操作简便、快捷
LAMP反应过程中会产生白色的焦磷酸镁沉淀,肉眼即可直接观察,是鉴定反应是否进行的最直接方法。另外,LAMP扩增产物可以像PCR反应利用凝胶电泳结合成像系统进行鉴定,通过产生的不同梯型来区分特异性扩增和非特异性扩增。
（四）、实验装置简单,费用相对较低
LAMP反应不需要进行模板的热变性、长时间的温度循环、繁琐的电泳和紫外观察等,在操作过程中,仅需要普通的水浴锅或其他可以得到稳定热源的设备即可。
2、缺点
（一）、LAMP技术对试验设计的要求较高
需要设计的引物数目相对较多、结构复杂,需要考虑到靶序列的片段及茎环结构等因素。在检测高度变异的病原体时,实验设计相对比较困难
（二）、LAMP技术在一次反应中只能检测一个病原体
LAMP技术的阳性反应并不只呈现单条带,而出现拖尾和一些低分子质量的带,一旦产生非特异性扩增,则不易鉴别。
三、食源性致病徽生物和临床致病微生物检测行业的发展现状
随着生态环境的破坏、经济全球化的急剧发展等环境和社会因素变化,食品安全、环境保护和医疗健康问题日益受到关注。病原微生物正在向人类发起挑战:新的致病微生物突变对人类社会构成严重威胁;大规模突发性疾病是当前生物医学面临的重大挑战;一些重大传染病的死灰复燃,在我国和世界人口大多数的欠发达地区情况仍然严重。
致病微生物的检测技术急需向高通量、高精准度和快速现场应用多元方向发展。目前基层食品安全、环境卫生和医学临床对致病微生物的检测诊断仍以微生物分离培养技术为主、分子或生化手段为辅,通常序繁复、耗时长、费用高,并且灵敏度和特异性不强。国内外学者对致病微生物的检测方法进行了大量研究,建立了从病原分离鉴定、特异蛋自的免疫学检测技术、形态学鉴定和白动生化鉴定,到核酸探针、PCR等分子生物学检测方法。在基因水平上的核酸检测,其灵敏度远高于病原分离鉴定,同时避免了医学临床检验上的窗口期影响,赢得时间,对于预防控制重大传染性疾病至关重要。近年来核酸检测在快速性、安全性、准确性和灵敏性等方面都有很大的提高。这些新技术突破了传统的形态学、生化反应等旧模式,不需要对微生物进行分离提纯,而直接用样品或样品的增菌液进行快速检测,并且与分子生物学技术及生物信息学设计相结合,向准确、快速、灵敏和自动化的方向发展。
日前流行的以PCR为代表的核酸检测技术在实际应用中也存在一些问题,如PCR技术需要专门的CPR仪,且存在易交叉污染和操作过程烦琐的缺点。而荧光实时定量PCR虽然较好地解决了交义污染,并简化了操作过程,但却需要定量PCR仪,因此不适用于现场快速检测。且实时定量PCR技术中荧光探针的成本较高,加大了推广的难度。目前国内外的致病微生物的检测产品市场中,缺少快速、准确、简便的分子检测试剂盒,不能满足用户的检测要求,加上现有产品的假阴性和假阳性问题比较严重,导致用户使用的信心不足。所以,及时运用生物技术发展的最新成果对满足病原微生物检测的要求具有重要意义。食品安全检测,医学病原微生物诊断,农畜牧致病微生物检测,水体微生物等等领域,都非常需要快速、准确、简便、设备投入少的核酸检测技术。
四、LAMP技术在微生物检测中的应用
1、细菌检测
（一）、分枝杆菌属检测
由于分枝杆菌生長缓慢,目前临床上使用的检测方法如培养法和分子诊断方法存在耗时长及需要先进的仪器设备等缺点,通过检测24株分枝杆菌和7株非分枝杆菌证实了ＬＡＭＰ法的特异性和敏感性。
（二）、志贺菌属及侵袭性大肠埃希菌检测
临床和卫生检疫机构一般通过细菌培养和ＰＣＲ法检测志贺菌属及侵袭性大肠埃希菌。通过设计6对引物(包括4个特异引物和两个环引物)来扩增志贺菌属和侵袭性大肠埃希菌均携带的侵袭性质粒抗原基因(ｉｐａＨ),用ＬＡＭＰ法来检测志贺菌属及侵袭性大肠埃希菌,整个过程只需2ｈ,且每次反应最低只需8ＣＦＵ。
（三）、假结核耶尔森菌检测
假结核耶尔森菌是一种重要的动物媒介性传染性病原微生物,可自猴、狗、猪、兔、鹿、禽鸟等多种动物中分离到此种细菌。目前的基因诊断方法中,ＰＣＲ的应用最为广泛。
（四）、肺炎链球菌检测
目前临床使用的检测方法鉴别肺炎链球菌、轻型链球菌、口腔链球菌三种基因相似性链球菌的结果不太理想,针对肺炎链球菌的特异性基因序列设计6条引物,认为利用ＬＡＭＰ法检测肺炎链球菌是一个可靠且敏感的检测手段。
（五）、耐药性细菌检测
耐药性细菌已成为医院感染的重要病原菌,因此快速、准确检测耐药性细菌,对预防耐药性细菌的感染具有重要意义。认为该方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便快速,适用于直接快速基因检测临床标本中的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
2、病毒检测
（一）、丙型肝炎病毒(ＨＣＶ)检测
ＨＣＶ是一种常见的ＲＮＡ病毒,它可以通过血液和母婴传播等方式感染人而造成丙型肝炎的流行。而在基因诊断方面普遍采用的套式ＲＴ-ＰＣＲ不但繁琐,而且因为特异性低和易交叉污染,往往结果并不可靠,很难作为一种临床上的常规方法进行推广。
（二）、诺瓦克病毒检测
诺瓦克病毒是引起人类腹泻的一种重要的传染性病原体,可在幼儿园、医院、学校传播流行,由于诺瓦克病毒培养困难,目前一般通过电镜或ＲＴ-ＰＣＲ进行检测。
（三）、人疱疹病毒6型检测
原发性ＨＨＶ-6感染虽然是一个良性的自限性疾病,但它也可引起严重的并发症。由于ＨＨＶ-6感染的早期表现为发热,没有任何皮肤症状,临床早期诊断显得很困难。故建立一个可靠和快速的检测方法用于早期ＨＨＶ-6感染发热阶段的诊断显得尤为重要。
3、支原体检测
用于肺炎支原体感染的常规检测方法有培养法、血清学和核酸扩增技术,培养法条件要求较高,分离和鉴定需1～2周,周期太长且阳性率低,因此对临床帮助不大。血清学方法灵敏度不高且要求采集病人急性期和康复期的血清标本,更快更灵敏的ＰＣＲ和Ｒｅａｌ-ｔｉｍｅＰＣＲ用于肺炎支原体的检测已有报道,然而其需要昂贵的设备限制了其广泛运用。
4、真菌检测
南美牙生菌病(ＰＣＭ)是一种由热依赖的二相真菌巴西类球孢子菌(ＰＢ)引起的疾病,高发于拉丁美洲国家,而在非流行地区,ＰＢ的诊断比较困难。
5、寄生虫检测
非洲锥虫是医学和农业上重要的原虫,可引起人类的睡眠疾病或牛的那加那病,如不治疗或误诊可造成人或动物的死亡,如果能做到早期诊断,将会大大减少由非洲锥虫造成的死亡率。目前常规的检测方法为显微镜下寻找血液或脑脊液中的病原体,这一方法灵敏度差,分子检测被公认为针对感染性疾病最为特异和灵敏的方法。
五、结束语
LAMP技术在微生物检测中有广泛的应用，随着生物检测技术的进步，LAMP技术会更频繁的被应用，LAMP技术所发挥的作用也会越来越大。
参考文献
[1] 徐芊,孙晓红,赵勇,等.利用环介导等温扩增技术快速检测水产品中的副溶血弧菌[J]农业生物技术学报,2008
[2]欧新华,张如胜,宋克云,等.环节导等温扩增(LAMP)技术检测沙门氏菌属方法的建立[J]实用预防医学,2008
[3]马保华,李贺,高家明,等.使用LAMP技术快速检测单增李斯特氏菌[J]中国动物检疫,2008
【关键词】LAMP技术，微生物检测，应用
中图分类号：K826文献标识码： A
一、前言
LAMP技术是随着微生物检测技术发展而不断发展的，LAMP技术在微生物检测中的应用中越来越广泛。经过几十年的迅速发展，目前LAMP技术已广泛应用于很多微生物检测当中，成为一门实用的技术。
二、LAMP技术的优缺点
1、优点
（一）、特异性强、灵敏度高
4条引物可以严格识别靶核酸序列上的6个独立区域,反应过程不会受到反应混合物种非靶序列DNA的影响,保证了LAMP扩增的高度特异性。在检测过程中可以根据是否扩增就能判断目标基因是否存在,可用于细菌或病毒的定性检测。
（二）、等温高效
LAMP在等温条件下扩增,不会因温度改变而造成时间的损失,在1 h内可将靶序列扩增至109～1010倍。而且受非靶序列的影响小,模板也不需要热变性。
（三）、整个扩增反应操作简便、快捷
LAMP反应过程中会产生白色的焦磷酸镁沉淀,肉眼即可直接观察,是鉴定反应是否进行的最直接方法。另外,LAMP扩增产物可以像PCR反应利用凝胶电泳结合成像系统进行鉴定,通过产生的不同梯型来区分特异性扩增和非特异性扩增。
（四）、实验装置简单,费用相对较低
LAMP反应不需要进行模板的热变性、长时间的温度循环、繁琐的电泳和紫外观察等,在操作过程中,仅需要普通的水浴锅或其他可以得到稳定热源的设备即可。
2、缺点
（一）、LAMP技术对试验设计的要求较高
需要设计的引物数目相对较多、结构复杂,需要考虑到靶序列的片段及茎环结构等因素。在检测高度变异的病原体时,实验设计相对比较困难
（二）、LAMP技术在一次反应中只能检测一个病原体
LAMP技术的阳性反应并不只呈现单条带,而出现拖尾和一些低分子质量的带,一旦产生非特异性扩增,则不易鉴别。
三、食源性致病徽生物和临床致病微生物检测行业的发展现状
随着生态环境的破坏、经济全球化的急剧发展等环境和社会因素变化,食品安全、环境保护和医疗健康问题日益受到关注。病原微生物正在向人类发起挑战:新的致病微生物突变对人类社会构成严重威胁;大规模突发性疾病是当前生物医学面临的重大挑战;一些重大传染病的死灰复燃,在我国和世界人口大多数的欠发达地区情况仍然严重。
致病微生物的检测技术急需向高通量、高精准度和快速现场应用多元方向发展。目前基层食品安全、环境卫生和医学临床对致病微生物的检测诊断仍以微生物分离培养技术为主、分子或生化手段为辅,通常序繁复、耗时长、费用高,并且灵敏度和特异性不强。国内外学者对致病微生物的检测方法进行了大量研究,建立了从病原分离鉴定、特异蛋自的免疫学检测技术、形态学鉴定和白动生化鉴定,到核酸探针、PCR等分子生物学检测方法。在基因水平上的核酸检测,其灵敏度远高于病原分离鉴定,同时避免了医学临床检验上的窗口期影响,赢得时间,对于预防控制重大传染性疾病至关重要。近年来核酸检测在快速性、安全性、准确性和灵敏性等方面都有很大的提高。这些新技术突破了传统的形态学、生化反应等旧模式,不需要对微生物进行分离提纯,而直接用样品或样品的增菌液进行快速检测,并且与分子生物学技术及生物信息学设计相结合,向准确、快速、灵敏和自动化的方向发展。
日前流行的以PCR为代表的核酸检测技术在实际应用中也存在一些问题,如PCR技术需要专门的CPR仪,且存在易交叉污染和操作过程烦琐的缺点。而荧光实时定量PCR虽然较好地解决了交义污染,并简化了操作过程,但却需要定量PCR仪,因此不适用于现场快速检测。且实时定量PCR技术中荧光探针的成本较高,加大了推广的难度。目前国内外的致病微生物的检测产品市场中,缺少快速、准确、简便的分子检测试剂盒,不能满足用户的检测要求,加上现有产品的假阴性和假阳性问题比较严重,导致用户使用的信心不足。所以,及时运用生物技术发展的最新成果对满足病原微生物检测的要求具有重要意义。食品安全检测,医学病原微生物诊断,农畜牧致病微生物检测,水体微生物等等领域,都非常需要快速、准确、简便、设备投入少的核酸检测技术。
四、LAMP技术在微生物检测中的应用
1、细菌检测
（一）、分枝杆菌属检测
由于分枝杆菌生長缓慢,目前临床上使用的检测方法如培养法和分子诊断方法存在耗时长及需要先进的仪器设备等缺点,通过检测24株分枝杆菌和7株非分枝杆菌证实了ＬＡＭＰ法的特异性和敏感性。
（二）、志贺菌属及侵袭性大肠埃希菌检测
临床和卫生检疫机构一般通过细菌培养和ＰＣＲ法检测志贺菌属及侵袭性大肠埃希菌。通过设计6对引物(包括4个特异引物和两个环引物)来扩增志贺菌属和侵袭性大肠埃希菌均携带的侵袭性质粒抗原基因(ｉｐａＨ),用ＬＡＭＰ法来检测志贺菌属及侵袭性大肠埃希菌,整个过程只需2ｈ,且每次反应最低只需8ＣＦＵ。
（三）、假结核耶尔森菌检测
假结核耶尔森菌是一种重要的动物媒介性传染性病原微生物,可自猴、狗、猪、兔、鹿、禽鸟等多种动物中分离到此种细菌。目前的基因诊断方法中,ＰＣＲ的应用最为广泛。
（四）、肺炎链球菌检测
目前临床使用的检测方法鉴别肺炎链球菌、轻型链球菌、口腔链球菌三种基因相似性链球菌的结果不太理想,针对肺炎链球菌的特异性基因序列设计6条引物,认为利用ＬＡＭＰ法检测肺炎链球菌是一个可靠且敏感的检测手段。
（五）、耐药性细菌检测
耐药性细菌已成为医院感染的重要病原菌,因此快速、准确检测耐药性细菌,对预防耐药性细菌的感染具有重要意义。认为该方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便快速,适用于直接快速基因检测临床标本中的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
2、病毒检测
（一）、丙型肝炎病毒(ＨＣＶ)检测
ＨＣＶ是一种常见的ＲＮＡ病毒,它可以通过血液和母婴传播等方式感染人而造成丙型肝炎的流行。而在基因诊断方面普遍采用的套式ＲＴ-ＰＣＲ不但繁琐,而且因为特异性低和易交叉污染,往往结果并不可靠,很难作为一种临床上的常规方法进行推广。
（二）、诺瓦克病毒检测
诺瓦克病毒是引起人类腹泻的一种重要的传染性病原体,可在幼儿园、医院、学校传播流行,由于诺瓦克病毒培养困难,目前一般通过电镜或ＲＴ-ＰＣＲ进行检测。
（三）、人疱疹病毒6型检测
原发性ＨＨＶ-6感染虽然是一个良性的自限性疾病,但它也可引起严重的并发症。由于ＨＨＶ-6感染的早期表现为发热,没有任何皮肤症状,临床早期诊断显得很困难。故建立一个可靠和快速的检测方法用于早期ＨＨＶ-6感染发热阶段的诊断显得尤为重要。
3、支原体检测
用于肺炎支原体感染的常规检测方法有培养法、血清学和核酸扩增技术,培养法条件要求较高,分离和鉴定需1～2周,周期太长且阳性率低,因此对临床帮助不大。血清学方法灵敏度不高且要求采集病人急性期和康复期的血清标本,更快更灵敏的ＰＣＲ和Ｒｅａｌ-ｔｉｍｅＰＣＲ用于肺炎支原体的检测已有报道,然而其需要昂贵的设备限制了其广泛运用。
4、真菌检测
南美牙生菌病(ＰＣＭ)是一种由热依赖的二相真菌巴西类球孢子菌(ＰＢ)引起的疾病,高发于拉丁美洲国家,而在非流行地区,ＰＢ的诊断比较困难。
5、寄生虫检测
非洲锥虫是医学和农业上重要的原虫,可引起人类的睡眠疾病或牛的那加那病,如不治疗或误诊可造成人或动物的死亡,如果能做到早期诊断,将会大大减少由非洲锥虫造成的死亡率。目前常规的检测方法为显微镜下寻找血液或脑脊液中的病原体,这一方法灵敏度差,分子检测被公认为针对感染性疾病最为特异和灵敏的方法。
五、结束语
LAMP技术在微生物检测中有广泛的应用，随着生物检测技术的进步，LAMP技术会更频繁的被应用，LAMP技术所发挥的作用也会越来越大。
参考文献
[1] 徐芊,孙晓红,赵勇,等.利用环介导等温扩增技术快速检测水产品中的副溶血弧菌[J]农业生物技术学报,2008
[2]欧新华,张如胜,宋克云,等.环节导等温扩增(LAMP)技术检测沙门氏菌属方法的建立[J]实用预防医学,2008
[3]马保华,李贺,高家明,等.使用LAMP技术快速检测单增李斯特氏菌[J]中国动物检疫,2008