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摘要 采用半静水法，研究了CuO-ENPs对三疣梭子蟹的急性毒性作用。结果表明：在海水pH值=7.9～8.2、T=24.0～25.2 ℃、S=27.9～29.1的条件下，CuO-ENPs对三疣梭子蟹的96 h LC50为49 mg/L，95%置信区间为37～60 mg/L，CuO-ENPs对三疣梭子蟹的安全浓度为0.49 mg/L。CuO-ENPs对三疣梭子蟹的毒为低毒。
关键词 CuO-ENPs；三疣梭子蟹；急性毒性；半致死浓度；安全浓度
中图分类号 S945；Q583 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2015）20-0226-02
Study on Acute Toxicity of CuO-ENPs on Portuns trituberculatus
YOU Ju-ju XUE Bin YU Liang ZHANG Yu-rong LI Tie-jun *
（Marine Fishery Research Institute of Zhejiang Province，Scientific Observing and Experimental Station of Fishery Resources for Key Fishing Grounds，Ministry of Agriculture，Key Laboratory of Sustainable Utilization of Technology Research for Fishery Resource of Zhejiang Province，Zhoushan Zhejiang 316021）
Abstract The acute toxicity effects of CuO-ENPs on Portuns trituberculatus was determined by low-hydrostatic method in a laboratory，the results showed that 96 h LC50 with 95% confidence limits were 49 mg/L（37～60 mg/L） for Portuns trituberculatus under the condition of seawater pH=7.9～8.2，T=24.0～25.2 ℃，S=27.9～29.1.The safety concentrations of tetrachloroethylene on Portuns trituberculatus were 0.49 mg/L.The toxicity level of CuO-ENPs was low to the Portuns trituberculatus.
Key words CuO-ENPs；Portuns trituberculatus；acute toxicity；median lethal concentration；safety concentration
CuO-ENPs是一類十分重要的纳米材料，由于其具有电子关联效应、独特的高温超导性、极高的催化活性和抑菌作用，在工业上得到广泛的应用，如用于制备传感器、超导材料、热导材料[1]、抗菌剂[2]、催化剂[3-5]等，与人类生活有着很密切的联系，在广泛应用于消费产品时，很可能通过释放进入大气、陆地，再通过地表径流、雨水沉降等进入水体，并且这些纳米材料最终会进入海洋，对海洋生态环境造成影响。因此，了解纳米材料对海洋生态环境的影响十分重要。
目前，关于CuO-ENPs的毒性和生态毒性效应已有报道，集中在CuO-ENPs对离体细胞[6-7]、微生物[8]、藻类[9]、原生动物[10]、甲壳动物[11-12]、软体动物[13]、海生双壳类[14]、海洋贝类[15-16]以及高等植物[17-18]的毒性和作用机理，对三疣梭子蟹（Portuns trituberculatus）的毒性研究还未见报道。本研究将三疣梭子蟹暴露于CuO-ENPs不同浓度溶液中，测得其96 h LC50值，以观察CuO-ENPs对水生生物的急性毒性效应，同时对其环境安全性进行初步评估。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试验化学品。CuO-ENPs 40 nm、球形，由成都西亚化工股份有限公司生产。
1.1.2 试验用海水。在浙江省海水增养殖基地——浙江省舟山市普陀区西闪岛附近的海域取海水，经48 h沉淀，测得pH值7.9～8.2，盐度为27.9～29.1，溶解氧>8.4 mg/L。
1.1.3 试验生物。三疣梭子蟹取自浙江省海水增养殖基地，壳宽、体重分别为7.0～9.5 cm、140～251 g。
1.1.4 试验装置。塑料方箱（60 cm×40 cm×50 cm），配充氧装置。
1.2 试验方法
在试验用海水中先暂养7 d，取没有异常表现的生物进行试验。根据CuO-ENPs的浓度，设6组试验，分别为0、20.0、29.9、44.8、67.0、100.0 mg/L，每组1个塑料方箱，装24 L水，放10只蟹，并放入筛绢网片作隐蔽物，以免蟹相互残杀。
采用半静水法试验[19]，24 h进行换水1次，同时一直充氧，控制室温在23～26 ℃，实测试验期间水温为24.0～25.2 ℃。
试验过程中对照组的死亡率、不正常行为或病态不得超过10%，否则要重新试验。
1.3 调查与统计
试验开始后，前8 h内连续观察，以后定时观察。试验期间，每天投喂适量丰年虫幼体，并捞出死亡个体，吸去桶底粪便与残饵，96 h后终止培养。采用移动平均角法[20]，计算不同时间的半致死浓度值LC50、半致死浓度的95%置信区间。 2 结果与分析
从表1可知，当CuO-ENPs浓度为20 mg/L，96 h期间试验蟹没有发生死亡。随着CuO-ENPs浓度的升高，96 h时试验蟹死亡率逐渐增加，CuO-ENPs浓度在29.9、44.8、67.0 mg/L时，死亡率分别为20%、40%和70%。当CuO-ENPs浓度达到100.0 mg/L时，梭子蟹放入几小时后就出现剧烈游动、上浮到水层、继而颤抖下沉等状况，13 h后出现死亡，96 h时所有试验蟹全部死亡，期间试验蟹没有发生蜕皮。CuO-ENPs对梭子蟹的96 h LC50为49 mg/L，95%置信区间37～60 mg/L。
3 结论与讨论
3.1 毒性机理
目前，對人工纳米颗粒致毒作用机理的认识主要有2点：一是人工纳米颗粒自身能够产生活性氧自由基，引起氧化胁迫，进而引发基因毒性；二是由人工纳米颗粒释放的金属离子致毒[21]。针对CuO-ENPs致毒的原因，是纳米效应还是离子效应，研究人员还未达成一致。Buffet[14]、Baek[8]、Fahmy[22]、Karlsson[23]、向垒[24]、Ahamed等[25]对人肺上皮细胞、微生物、海生双壳类、植物等的研究结果表明，氧化胁迫是CuO-ENPs致毒的原因，而且证实CuO-ENPs的生态毒性效应由纳米颗粒本身所致。Blinova[11]、Midander[26]、Heinlaan[12]、Aruoja[9]、Morti-mer[10]、金盛杨[27]、崔静[28]、陆其聪等[29]对甲壳动物、原生动物、细菌、微藻、小麦、金鱼藻、酿酒酵母等的研究指出，CuO-ENPs的毒性是由纳米颗粒所释放的有效Cu2 所致。然而，Heinlaan[12]、金盛杨等[27]对甲壳动物中肠内腔、土壤酶活性的研究指出，CuO-ENPs溶出的Cu2 只是致毒的部分原因，毒性是由纳米颗粒态和溶出Cu2 共同作用引起的。根据三疣梭子蟹的中毒症状以及上述研究成果进一步推断，CuO-ENPs对三疣梭子蟹的毒性可能是由纳米颗粒态和溶出Cu2 共同作用导致的，该结论有待今后进行的毒理研究证实。
3.2 CuO-ENPs对三疣梭子蟹的毒性
试验表明，在一定试验时间内，CuO-ENPs浓度越高，三疣梭子蟹死亡越多，说明毒性作用越强；在CuO-ENPs浓度一定的条件下，随着试验时间延长，三疣梭子蟹死亡逐渐增加，表明CuO-ENPs对生物体的毒性大小与受暴露时间密切相关，即在96 h之内，暴露时间越长，毒性越大，LC50越小。
CuO-ENPs对三疣梭子蟹具有急性毒性，对三疣梭子蟹的96 h LC50为49 mg/L，95%置信区间为37～60 mg/L。
《化学农药环境安全评价试验准则》[30]中对鱼类的毒性等级划分，96 h LC50>10 mg/L、1～10 mg/L、<1 mg/L分别为低毒、中毒、高毒农药。可见CuO-ENPs对三疣梭子蟹的毒性为低毒。
3.3 CuO-ENPs对三疣梭子蟹的安全浓度
综合考虑化学物质对水生生物的急性毒性数据，常使用安全浓度=96 h LC50×0.1或安全浓度=96 h LC50×0.01计算安全浓度[31]。本文采用后者计算，CuO-ENPs对三疣梭子蟹的安全浓度为0.49 mg/L。该研究结果可为客观评价CuO-ENPs对海洋生态环境的潜在风险、制订环境保护标准和污染控制决策及其对水产品质量安全的潜在影响提供参考依据。
4 参考文献
[1] 雷涛，李芬，王艳红，等.纳米氧化铜粉体的制备及应用研究进展[J].化工进展，2013，32（10）：429-433.
[2] DELGADO K，QUIJADA R，PALMA R，et al.Polypropylene with embed-ded copper metal or copper oxide nano-particles as a novel plastic antimicrobial agent[J].Lett Appl Microbiol，2011，53（1）：50-54.
[3] 杨慧，刘志宏.花状氧化铜纳米结构的制备及其性能研究[J].陕西师范大学学报（自然科学版），2009，37（6）：60-62.
[4] 孙健，于锟，黄家锐，等.两种形貌氧化铜微纳米材料的制备及光催化研究[J].滁州学院学报，2011，13（2）：55-56.
[5] 程远见，姜红，陈日志，等.纳米晶氧化铜的制备及其催化苯酚氧化性能[J].石油化工，2012，41（4）：391-395.
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[14] BUFFET P E，TANKOUA O F，PAN J F，et al.Behavioural and bioche-mical responses of two marine invertebrates Scrobicularia plana and Hediste diversicolor to copper oxide nanoparticles[J].Chemosphere，2011，84（1）：166-174.
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[20] EUGENE K，HARRIS.Confidence Limits for the LD50 using the moving average-angle method[J].Biometrics，1959，15（3）：424-432.
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关键词 CuO-ENPs；三疣梭子蟹；急性毒性；半致死浓度；安全浓度
中图分类号 S945；Q583 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2015）20-0226-02
Study on Acute Toxicity of CuO-ENPs on Portuns trituberculatus
YOU Ju-ju XUE Bin YU Liang ZHANG Yu-rong LI Tie-jun *
（Marine Fishery Research Institute of Zhejiang Province，Scientific Observing and Experimental Station of Fishery Resources for Key Fishing Grounds，Ministry of Agriculture，Key Laboratory of Sustainable Utilization of Technology Research for Fishery Resource of Zhejiang Province，Zhoushan Zhejiang 316021）
Abstract The acute toxicity effects of CuO-ENPs on Portuns trituberculatus was determined by low-hydrostatic method in a laboratory，the results showed that 96 h LC50 with 95% confidence limits were 49 mg/L（37～60 mg/L） for Portuns trituberculatus under the condition of seawater pH=7.9～8.2，T=24.0～25.2 ℃，S=27.9～29.1.The safety concentrations of tetrachloroethylene on Portuns trituberculatus were 0.49 mg/L.The toxicity level of CuO-ENPs was low to the Portuns trituberculatus.
Key words CuO-ENPs；Portuns trituberculatus；acute toxicity；median lethal concentration；safety concentration
CuO-ENPs是一類十分重要的纳米材料，由于其具有电子关联效应、独特的高温超导性、极高的催化活性和抑菌作用，在工业上得到广泛的应用，如用于制备传感器、超导材料、热导材料[1]、抗菌剂[2]、催化剂[3-5]等，与人类生活有着很密切的联系，在广泛应用于消费产品时，很可能通过释放进入大气、陆地，再通过地表径流、雨水沉降等进入水体，并且这些纳米材料最终会进入海洋，对海洋生态环境造成影响。因此，了解纳米材料对海洋生态环境的影响十分重要。
目前，关于CuO-ENPs的毒性和生态毒性效应已有报道，集中在CuO-ENPs对离体细胞[6-7]、微生物[8]、藻类[9]、原生动物[10]、甲壳动物[11-12]、软体动物[13]、海生双壳类[14]、海洋贝类[15-16]以及高等植物[17-18]的毒性和作用机理，对三疣梭子蟹（Portuns trituberculatus）的毒性研究还未见报道。本研究将三疣梭子蟹暴露于CuO-ENPs不同浓度溶液中，测得其96 h LC50值，以观察CuO-ENPs对水生生物的急性毒性效应，同时对其环境安全性进行初步评估。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试验化学品。CuO-ENPs 40 nm、球形，由成都西亚化工股份有限公司生产。
1.1.2 试验用海水。在浙江省海水增养殖基地——浙江省舟山市普陀区西闪岛附近的海域取海水，经48 h沉淀，测得pH值7.9～8.2，盐度为27.9～29.1，溶解氧>8.4 mg/L。
1.1.3 试验生物。三疣梭子蟹取自浙江省海水增养殖基地，壳宽、体重分别为7.0～9.5 cm、140～251 g。
1.1.4 试验装置。塑料方箱（60 cm×40 cm×50 cm），配充氧装置。
1.2 试验方法
在试验用海水中先暂养7 d，取没有异常表现的生物进行试验。根据CuO-ENPs的浓度，设6组试验，分别为0、20.0、29.9、44.8、67.0、100.0 mg/L，每组1个塑料方箱，装24 L水，放10只蟹，并放入筛绢网片作隐蔽物，以免蟹相互残杀。
采用半静水法试验[19]，24 h进行换水1次，同时一直充氧，控制室温在23～26 ℃，实测试验期间水温为24.0～25.2 ℃。
试验过程中对照组的死亡率、不正常行为或病态不得超过10%，否则要重新试验。
1.3 调查与统计
试验开始后，前8 h内连续观察，以后定时观察。试验期间，每天投喂适量丰年虫幼体，并捞出死亡个体，吸去桶底粪便与残饵，96 h后终止培养。采用移动平均角法[20]，计算不同时间的半致死浓度值LC50、半致死浓度的95%置信区间。 2 结果与分析
从表1可知，当CuO-ENPs浓度为20 mg/L，96 h期间试验蟹没有发生死亡。随着CuO-ENPs浓度的升高，96 h时试验蟹死亡率逐渐增加，CuO-ENPs浓度在29.9、44.8、67.0 mg/L时，死亡率分别为20%、40%和70%。当CuO-ENPs浓度达到100.0 mg/L时，梭子蟹放入几小时后就出现剧烈游动、上浮到水层、继而颤抖下沉等状况，13 h后出现死亡，96 h时所有试验蟹全部死亡，期间试验蟹没有发生蜕皮。CuO-ENPs对梭子蟹的96 h LC50为49 mg/L，95%置信区间37～60 mg/L。
3 结论与讨论
3.1 毒性机理
目前，對人工纳米颗粒致毒作用机理的认识主要有2点：一是人工纳米颗粒自身能够产生活性氧自由基，引起氧化胁迫，进而引发基因毒性；二是由人工纳米颗粒释放的金属离子致毒[21]。针对CuO-ENPs致毒的原因，是纳米效应还是离子效应，研究人员还未达成一致。Buffet[14]、Baek[8]、Fahmy[22]、Karlsson[23]、向垒[24]、Ahamed等[25]对人肺上皮细胞、微生物、海生双壳类、植物等的研究结果表明，氧化胁迫是CuO-ENPs致毒的原因，而且证实CuO-ENPs的生态毒性效应由纳米颗粒本身所致。Blinova[11]、Midander[26]、Heinlaan[12]、Aruoja[9]、Morti-mer[10]、金盛杨[27]、崔静[28]、陆其聪等[29]对甲壳动物、原生动物、细菌、微藻、小麦、金鱼藻、酿酒酵母等的研究指出，CuO-ENPs的毒性是由纳米颗粒所释放的有效Cu2 所致。然而，Heinlaan[12]、金盛杨等[27]对甲壳动物中肠内腔、土壤酶活性的研究指出，CuO-ENPs溶出的Cu2 只是致毒的部分原因，毒性是由纳米颗粒态和溶出Cu2 共同作用引起的。根据三疣梭子蟹的中毒症状以及上述研究成果进一步推断，CuO-ENPs对三疣梭子蟹的毒性可能是由纳米颗粒态和溶出Cu2 共同作用导致的，该结论有待今后进行的毒理研究证实。
3.2 CuO-ENPs对三疣梭子蟹的毒性
试验表明，在一定试验时间内，CuO-ENPs浓度越高，三疣梭子蟹死亡越多，说明毒性作用越强；在CuO-ENPs浓度一定的条件下，随着试验时间延长，三疣梭子蟹死亡逐渐增加，表明CuO-ENPs对生物体的毒性大小与受暴露时间密切相关，即在96 h之内，暴露时间越长，毒性越大，LC50越小。
CuO-ENPs对三疣梭子蟹具有急性毒性，对三疣梭子蟹的96 h LC50为49 mg/L，95%置信区间为37～60 mg/L。
《化学农药环境安全评价试验准则》[30]中对鱼类的毒性等级划分，96 h LC50>10 mg/L、1～10 mg/L、<1 mg/L分别为低毒、中毒、高毒农药。可见CuO-ENPs对三疣梭子蟹的毒性为低毒。
3.3 CuO-ENPs对三疣梭子蟹的安全浓度
综合考虑化学物质对水生生物的急性毒性数据，常使用安全浓度=96 h LC50×0.1或安全浓度=96 h LC50×0.01计算安全浓度[31]。本文采用后者计算，CuO-ENPs对三疣梭子蟹的安全浓度为0.49 mg/L。该研究结果可为客观评价CuO-ENPs对海洋生态环境的潜在风险、制订环境保护标准和污染控制决策及其对水产品质量安全的潜在影响提供参考依据。
4 参考文献
[1] 雷涛，李芬，王艳红，等.纳米氧化铜粉体的制备及应用研究进展[J].化工进展，2013，32（10）：429-433.
[2] DELGADO K，QUIJADA R，PALMA R，et al.Polypropylene with embed-ded copper metal or copper oxide nano-particles as a novel plastic antimicrobial agent[J].Lett Appl Microbiol，2011，53（1）：50-54.
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[4] 孙健，于锟，黄家锐，等.两种形貌氧化铜微纳米材料的制备及光催化研究[J].滁州学院学报，2011，13（2）：55-56.
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[18] 何蓉.CuO NPs对拟南芥幼苗的胁迫机理研究[D].深圳：深圳大学，2014.
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