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【摘 要】在科学技术迅速发展的21世纪，生物技术作为一种可能改变未来经济格局的技术，在医药健康、环境保护、新能源、新材料，现代农业和海洋等领域发挥着越来越重要的作用，然而盲目地开发与滥用同样会给人类健康和生态环境带来潜在的威胁，对其进行合理的利用和管理就显得尤为关键。以三种具有代表性的生物技术为例，结合其具体的应用价值分别论述了它们的发展与前景，研究探讨了促进社会经济效益的管理方法，并根据当前趋势提出建议以供相关领域的同行和专家参考借鉴。
【关键词】生物技术；基因测序；生物芯片；双向电泳；管理
The Application and Management of Modern Biotechnology
ZHANG Dong-wei
（Shanghai Jiemin Biotechnology Co.，Ltd China Shanghai 200000）
【Abstract】During the rapid development of science and technology in the 21st century，biotechnology plays a very important role in healthcare， environment，new energy & material，agriculture & ocean etc.As a new possible solution that may transform the economic layout in the future，it could also cause serious consequences to human health and ecologic balance by over deployment or abuse， therefore proper utilization and management would become crucial.This article would describe the application and prospect about modern biotechnology by three classic examples respectively， and then discuss several management approaches that could add more value to human society.Meanwhile it makes some suggestions for peers and experts’reference in related field based on current trends.
【Key words】Biotechnology；Gene sequencing；Biochip；Two-dimensional electrophoresis；Management
0.引言
生物技术（Biotechnology）是应用生命科学研究成果，以人们的意志设计，对生物或生物的成分进行改造和利用的综合性新兴技术，涵盖了基因工程、分子生物学、遗传学、胚胎学、物理学、化学、信息学和计算机科学等多门学科，具有广泛的应用前景。近半个世纪来，生命科学在分子水平上取得了突破性成就，生物技术也得到了长足的发展，生物学家的研究重心从揭示生命的所有遗传信息转移到在整体水平上对生物功能的研究。生命科学是实验科学，快速准确地获得生物体的遗传信息对于生命科学研究具有十分重要的意义，因此生命科学的发展极大地依赖于生物技术的发展。以DNA序列分析技术为核心的基因组研究技术推动了基因组研究的日新月异；而以生物芯片技术为代表的基因表达研究技术为科学家了解基因表达规律立下汗马功劳；在蛋白质组研究中，二维电泳和质谱技术的黄金组合又为科学家掌握蛋白质的表达规律再铸辉煌。在后工业化时代背景下，生物技术发展面临的主要课题仍然是人口、环境和资源。
1.基因测序技术
基因是携带有遗传信息的DNA或RNA序列，是控制性状的基本遗传单位。基因通过指导蛋白质的合成来表达自己所携带的遗传信息，从而控制着生物个体的性状表现，支持着生命的基本构造和性能。由30亿个碱基对组成的人类基因组大约含有2.5～4万个基因，储存着生命的种族、血型、孕育、生长、凋亡过程的全部信息。基因测序是国际上公认的一种基因检测标准，是基因工程和分子生物学领域最重要的技术之一。它能够从血液、唾液等组织样本中分析测定基因全序列，预测罹患多种疾病的风险，从而通过改善自己的生活环境和生活习惯，避免或延缓疾病的发生。目前仍然主要应用于科研领域，在相关准入标准、管理规范出台以前，还不能够应用于临床实践。
基因测序技术是遗传学研究发展起来的，能够真实反映DNA的遗传信息，是了解基因结构和功能的基础，可以应用于肿瘤学、免疫学、微生物学等多门学科。1977年Maxam和Gilbert报道了化学降解法，同年Sanger推出了双脱氧链终止法，Sanger法简便快捷并且适合于自动化测序，因而得到了广泛的应用。上世纪80～90年代，学术界开始涉足人类基因组计划，有力地推动了全自动测序技术的发展。基因测序仪得到了重大改进，毛细管电泳取代了传统的薄层板凝胶电泳，采用专利的荧光标记和CCD成像技术，实现了自动灌胶、进样、数据收集与分析等功能，是一台可以测定DNA的碱基顺序或定量DNA片段大小的精密仪器。在计算机控制下有96或384通道两种可选模式，能够在24小时无人干预状态下工作，测序的平均成功率可达85%，读长接近1000bp。配合不同的试剂盒还可以进行微卫星序列分析、单核苷酸多态性分析、基因突变检测、HLA配型、法医学上的亲子和个体鉴定、微生物与病毒的分型与鉴定等。 图1 基因测序
进入21世纪后，采用微磁珠和高密度芯片的第二代测序技术应运而生，其核心思想是使DNA模板与固体表面相结合，然后边合成边测序，通过捕捉新合成的末端标记来确定DNA序列，克服了传统测序方法成本高、效率低等缺点。二代测序技术是测序技术发展过程中一次革命性的改变，是一次可以对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定的大规模平行测序技术，同时使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，因此具有更好的寻找和发现新信息的能力，又被称为深度测序[1]。例如利用合成法测序的454技术和利用连接法测序的SOLiD技术，这些测序平台的共同特点是不需要大肠杆菌系统进行DNA模板扩增，由于测序读长较短带来了后续大量的数据拼接和注释工作，其中454测序技术的读长已经提高到400bp，SOLiD系统原始碱基数据的准确度大于99.94%。二代高通量测序可以帮助研究者跨过文库构建这一实验步骤，避免了亚克隆过程中引入的偏差，比较适合于对已知序列的基因组进行重新测序，而在对全新的基因组进行测序时还需要结合第一代测序技术。
运用第一代Sanger测序技术完成人类基因组计划耗资近30亿美元，历时大约13年；而第二代SOLiD技术完成基因组测序只需几周的时间，成本降到100万美元以下，单次运行能产生50GB的数据，相当于基因组的17倍覆盖度。新一代测序技术提高了速度，但测序产生的海量数据却为后续的分析与储存带来巨大的挑战，现有的生物信息分析软件还没有能力处理如此大量的数据资料，只有发展出能迅速准确分析和储存大量测序数据的软件和方法，才能充分体现出新技术高通量和高准确度的应用价值。另外新一代测序仪的价格大约在50～100万美元，一般实验室是难以负担的，因此对于Kb到Mb范围的小型项目，传统的DNA测序方法无疑还是最佳选择。但在全基因组测序、鉴定体细胞突变及病毒细菌感染与变异等大型基因组计划的实施中，新一代测序技术将发挥巨大作用。
第三代测序技术最大的特点是单分子实时测序，测序时无需PCR扩增，实现了对每一条DNA分子的单独测序，其分辨率具有不可比拟的优势，因此在稀有突变及其频率的测定中可以大显身手。单分子荧光测序是通过显微镜对DNA链合成时的荧光强度变化进行实时记录来完成的，在蚀刻有纳米结构的微阵列芯片上放置数以千计的波导管，每个波导管的空间仅能容纳一个DNA分子外加一个DNA多聚酶分子，在一块小小的芯片上能同时进行数千个测序反应；纳米孔测序是借助电泳技术驱动单个分子逐一通过纳米孔来实现的，在外切酶的辅助下，纳米孔的直径仅允许单个核酸聚合物通过，而不同碱基的带电性质不一样，通过电信号的差异就能检测出通过的碱基类别。三代测序技术保留了DNA聚合酶自身内在的反应速度和延续性，同时系统误差和干扰会显著减小，精确度能达到99.9999%[2]。利用这种技术组合，科研人员能够在24小时内获取基因组信息，检测费用也降到了最低1千美元。据预测，DNA测序技术可能跟随计算机技术和通讯技术成为第三个“摩尔定律化”的学科产业，并将推动个性化医疗的全面发展。
昂贵的费用曾经是阻碍个体基因组测序普及的最大障碍，而随着新的高通量测序技术的发展，测序成本的不断降低，以及在计算机技术的辅助下拼接大量的基因组序列信息，可以更加方便快捷地获取个体遗传信息，DNA测序技术已由一项前沿技术迅速普及为生命科学领域的常规技术。每一种测序方法都具有一定的优势和局限，针对特定目的的基因分析，进行合理的评估，根据具体需求选择或搭配合适的测序平台才是最佳的解决方案，虽然第二、第三代测序技术有很大的通量，基于Sanger原理的毛细管电泳测序仍然是高精度测序的黄金标准，是一种既能从头测序又能从头组装的成熟技术，可以协助验证新一代测序技术的准确性和精确度。人类基因组计划破译了人类全部遗传信息，使人类第一次在分子水平上全面地认识自我，尽管发表于2001年的基因组仍然处于有待完善的阶段中，但其已作为基因组的参照序列而被采用，成为生命科学转化为实际应用的基础，并继续对研究基因型和表现型的关系，揭示生物进化和生命起源的奥秘发挥着重要的作用。
2.生物芯片技术
在20世纪末，生物技术和电子技术相结合诞生了半导体芯片的兄弟—生物芯片（biochip），这将给人类的生活和健康带来深远的影响，对社会的可持续性发展也会起到不可估量的作用。目前主要分为两大类：用于生物计算机等生物电子产品制造的生物电子芯片和用于各种生物大分子、细胞、组织操作以及生物化学反应检测的生物分析芯片，前一类目前在技术和应用上还不成熟，一般情况下生物芯片所指的是生物分析芯片。生物芯片在生命科学研究及实践、医学科研及临床、药物设计、环境保护等各个领域有着广泛的用武之地，既具有重大的基础研究价值，又具有明显的产业化前景。
生物芯片技术的起源最初得益于埃德温·迈勒·萨瑟恩（Edwin Mellor Southern）提出的核酸杂交理论，即标记的核酸分子能够与被固化的与之互补配对的核酸分子杂交，从这一角度而言，Southern杂交可以被看作是生物芯片的雏形。生物芯片的基础研究始于20世纪80年代末，本质上是一种生物技术，主要是在生物遗传学领域发展起来的，是融微电子学、生物学、物理学、化学和计算机科学为一体的高度交叉的新技术。它是通过缩微技术，根据分子间特异性地相互作用的原理，将生命科学领域中不连续的分析过程集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、基因及其它生物组分的准确、快速、大信息量的检测。按照芯片上固化的生物材料的不同，可以将生物芯片划分为基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片和组织芯片；根据原理的不同，还可以分为元件型、通道型微阵列芯片以及生物传感芯片。由于常用硅片作为固相基质，且在制备过程中模拟计算机芯片的制备技术，所以称之为生物芯片技术。
微阵列芯片（microarray）是指高密度固定在支持介质上包含生物信息的分子点阵，每个分子的序列及位置都是已知的，并且是预先设定好的。该技术采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子比如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等等生物样品有序地固化于支持物的表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而获取样品中靶分子的数量或序列信息。例如基因芯片，它是DNA杂交探针技术与半导体工业技术相结合的结晶，具有高通量、微量化和自动化等特点。基因芯片技术由于同时将大量探针固定于支持物上，所以可以一次性对样品大量序列进行检测和分析，从而解决了传统核酸印迹杂交技术操作繁杂、序列数量少、检测效率低等不足。而且，通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有多种不同的应用价值，如基因表达谱测定、突变检测、多态性分析、基因组文库作图及杂交测序等。表达谱基因芯片是用于基因功能研究的一种基因芯片，是目前技术比较成熟，应用最广泛的一种基因芯片，其主要的优点是：检测系统的微型化，对样品需要量非常小，检测基因表达变化的灵敏度高，可检测丰度相差几个数量级的表达情况，而且节约费用和时间。采用表达谱基因芯片研究基因表达可以同时研究上万个基因的表达变化，研究效率明显提高，能更多地揭示基因之间表达变化的相互关系，从而研究基因与基因之间内在的作用关系，使研究更具目的性和系统性，同时也拓宽研究领域。微阵列芯片技术是系统生物技术的基本内容，能为现代医学发展提供强有力的手段，促进医学从“系统、血管、组织和细胞层次”向“DNA、RNA、蛋白质及其相互作用层次”过渡。 图2 基因芯片
微型芯片实验室（lab-on-a-chip）是生物芯片技术发展的高级阶段，或称微全分析系统（Micro Total Analysis System），是指把生物或化学领域所涉及的样品制备、生物与化学反应、分离检测等基本操作单位集成于一块几平方厘米的芯片上，用以完成不同的生物或化学反应过程，并对其产物进行分析的一种技术。它是通过分析化学、微机电加工、计算机、电子学、材料科学与生物学、医学和工程学等技术，实现从试样处理到检测的微型化、自动化与集成化这一目标。功能化芯片实验室大体包括三个部分：一是芯片，将微泵、微阀、管道、流量控制与反应器等高度集成化，完成液体在芯片内部的定向流动与分配等功能；二是分析仪，包括驱动源和信号检测装置；三是实现芯片功能化的方法与试剂盒[3]。最近的发展表明，90年代初由Manz等人提出的以微电子加工技术为依托的芯片实验室的发展将会像四十年前微电子技术在信息科学的发展中引发一场革命一样，预计芯片实验室将在未来的发展中对分析科学乃至整个科学技术以及相关的产业界产生相似的作用。计算机芯片使计算微型化，而芯片实验室使实验室微型化，在生物医学领域它可以使珍贵的生物样品和试剂消耗降低到微升甚至纳升级，而且分析速度成倍提高，成本成倍下降；在化学领域，以前需要在一个大实验室花费大量样品、试剂和很多时间才能完成的分析和合成，将在一块小的芯片上花很少量样品和试剂以很短的时间同时完成；在分析化学领域，它可以使以前大的分析仪器变成平方厘米尺寸规模的分析仪，将大大节约资源和能源。芯片实验室排污很少，所以是一种“绿色”技术。
目前，生物芯片已从主要应用的生命科学领域扩展到其它领域，产业化发展越来越明显、越快速。例如用于DNA、RNA、蛋白质等方向分析检测，还用于化学和生物试剂、环境污染的监测；监控微秒级的化学和生物化学反应动力学；用于许多化学合成反应的研究，药物和化学合成与筛选等。因此，芯片实验室不仅为生物医学家，也为合成化学家打开了通往无限美好明天的大门。由于它的基础研究和技术研究越来越专和精，使整体技术发展速度加快，再加之它朝着检测功能化方面发展，可能成为新的经济增长点。因此生物芯片在经济、社会及科研等方面的应用前景越来越广，其产值有可能超过微电子芯片，成为下一个具有巨大商业潜力的高技术产业。
3.蛋白质双向电泳技术
蛋白质（protein）是生命的物质基础和生命活动的主要承担者，是构成生物体的主要大分子。蛋白质占人体重量的16%～20%，人体内蛋白质的种类很多，性质、功能各异，但都是由20多种氨基酸按不同比例组合而成的，并在体内不断进行代谢与更新。1994年由Marc Wilkins提出了蛋白质组学，指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识。蛋白质组的研究不仅能为生命活动规律提供物质基础，也能为众多种疾病机理的阐明及攻克提供理论根据和解决途径，蛋白质组研究的发展是以双向电泳技术作为核心的。
双向电泳技术（two-dimensional electrophoresis）是分析从细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混合物的有力手段，通过第一向等电聚焦和第二向聚丙烯酰胺凝胶电泳，将不同种类的蛋白质按照等电点和分子量的差异在二维平面上进行分离，并得到每种蛋白质的等电点、表观分子量和含量等信息。等电聚焦电泳是60年代中期问世的一种利用等电点不同在pH梯度介质上分离蛋白质的电泳技术，其特点是分辨率高，不受扩散作用的影响。等电聚焦是一个与pH相关的平衡过程，蛋白质分子在含有载体两性电解质形成的一个连续而稳定的线性pH梯度中电泳，在偏离其等电点的pH条件下带有电荷，当其迁移至等电点的位置时静电荷数为零，这样蛋白质在电场中以不同的速率靠近并最终停留在各自的pI值；聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺作为支持介质的一种常用电泳技术，网状结构的凝胶具有分子筛效应，加入阴离子去污剂和强还原剂十二烷基硫酸钠后，能消除不同蛋白分子间的电荷差异和结构差异，因而电泳迁移率就取决于分子量的大小，可以直接测定蛋白质的分子量，一般采用不连续缓冲系统来获得较高的分辨率[4]。O’Farrell于1975年首次建立二维电泳并成功地分离出约1000个E.coli蛋白，并表明蛋白质谱不是稳定的，而是随环境而变化的。随着技术的飞速发展，现在最多已能分离出10000个斑点，当双向电泳斑点的全面分析成为现实的时候，蛋白质组的分析变得可行。
蛋白质组研究实质上是在细胞水平上对蛋白质进行大规模的平行分离和分析，因而要求有高分辨率的蛋白质分离技术及准确、灵敏的质谱鉴定技术，如何提高双向电泳的分离容量、灵敏度和分辨率以及对蛋白质差异表达的准确检测是目前双向电泳技术发展的关键问题。双向电泳技术虽然难以辨别低丰度蛋白，对操作要求也较高，但其通量高、分辨率和重复性好以及可与质谱联用的特点，使其成为目前最流行、可靠的蛋白质组研究手段。以双向电泳和质谱分析为基础的蛋白质组学研究的程序为：样品制备→等电聚焦→聚丙烯酰胺凝胶电泳→凝胶染色成像→软件分析定量→采集感兴趣的蛋白质点→胶内酶切→质谱分析确定肽指纹图谱或部分氨基酸序列→利用数据库确定蛋白。蛋白质组研究的主要困难是对用双向凝胶电泳分离出来的蛋白质进行定性和定量的分析。
双向电泳技术发展的趋势是在第一维等电聚焦电泳中采用范围窄的PH梯度凝胶，以及开发高灵敏度的的蛋白质荧光染色技术，凝胶电泳中蛋白质的着色不仅影响蛋白质分离的分辨率，同时也影响后续的质谱鉴定。样品的制备和溶解同样事关双向电泳的成效，用化学法和机械裂解法破碎以尽可能溶解和解聚蛋白以提高分辨率。样品预处理涉及溶解、变性和还原，可以完全破坏蛋白间的相互作用，并除去如核酸等非蛋白物质。此外，固相化PH梯度技术建立了稳定的并可以精确设定的PH梯度，避免了载体两性电解质向阴极漂移等许多缺点，增大了蛋白质的上样量，提高了双向电泳的分辨率和可重复性[5]。蛋白质研究技术远比基因技术复杂和困难，蛋白质组学研究的成功与否，很大程度上取决于其技术方法水平的高低，可以说蛋白质组学的发展既是技术所推动的也是受技术限制的。 图3 蛋白质双向电泳
Unlu等提出了一种荧光差异显示双向电泳（F-2D-DIGE）的定量蛋白质组学分析方法，比经典的双向电泳具有更高的动力学范围和灵敏性。差异凝胶电泳是双向电泳在技术上的改良，结合多重荧光分析的方法，在同一块胶上共同分离多个分别由不同荧光标记的样品，并第一次引入了内标的概念。两种样品中的蛋白质采用不同的荧光标记，混合后再进行双向电泳，用来检测蛋白质在两种样品中的表达情况，极大地提高了结果的准确性、可靠性和可重复性。由于每个蛋白点都有自己的内标，软件可全自动根据每个蛋白点的内标对其表达量进行校准，保证所检测到的蛋白丰度变化是真实的，解决了系统误差的问题。在DIGE技术中，不同样品在同一凝胶上电泳后产生多个凝胶图像，避免了几种双向电泳的比较，并且能够在纳克级进行检测，通过Internet可以获得参考图谱。较早期的双向电泳相比，有两个主要的进步：首先，极高的重复性可以用来比较不同组织类型、不同状态的基因表达；其次，高加样量使得双向电泳成为一项真正的制备型技术。
成功的二维电泳可以将2000到3000种蛋白质进行分离，近年来经过多方面改进已成为研究蛋白质组的最有使用价值的核心方法，蛋白质组学技术的发展已经成为现代生物技术快速发展的重要支撑，并将引领生物技术取得关键性的突破。由于双向电泳技术在蛋白质组与医学研究中所处的重要位置，它可用于蛋白质转录及转录后修饰研究，蛋白质组的比较和蛋白质间的相互作用，细胞分化凋亡研究，致病机制及耐药机制的研究，疗效监测，新药开发，癌症研究，蛋白纯度检查，小量蛋白纯化，新替代疫苗的研制等许多方面。通过对正常个体及病理个体间的蛋白质组比较分析，可以找到某些疾病特异性的蛋白质分子，它们可成为新药物设计的分子靶点，或者也会为疾病的早期诊断提供分子标志。确实，那些世界范围内销路最好的药物本身是蛋白质或其作用靶点为某种蛋白质分子。因此，蛋白质组学研究不仅是探索生命奥秘的必须工作，也能为人类健康事业带来巨大的利益。蛋白质组学的研究是生命科学进入后基因组时代的特征，蛋白质组学与其它大规模科学如基因组学，生物信息学等领域交叉融合，呈现出系统生物学（Systems Biology）研究模式，将成为未来生命科学的新前沿。
4.总结
我国具有丰富的生物资源，合理地开发和利用生物技术对国民经济的健康协调和可持续性发展有着非常重要的意义。另一方面，有效的创新能力不足，资金投入有限，管理和技术人才缺乏是目前制约生物技术进一步发展的主要因素。在资源有限的情况下，避免从事低水平，重复性的研究工作，相对集中一部分人力，物力和财力，建立集生物技术，自动化技术和信息技术为一体的研发中心，可能是适合我国国情的发展道路。加强各大专院校、科研院所重点实验室仪器设备的配置和管理，优化资源共享与人才交流的机制，创造良好的环境促进具有明显效益和前景的科研成果转化应用。条件成熟时，可以有针对性地根据具体需求，国内自主研发新一代的科研仪器。
生物技术研究中不断涌现出新信息、新技术、新疗法、新药物和新观念等等新事物，在一定时期内还难以判定其利弊优劣，在采用它们或研究它们时，必然涉及道德、法律和社会问题。例如：生物信息的隐私权问题，基因诊断、治疗和预防中的安全性问题，个人遗传信息的知情同意权问题，并由此引发出来的保险权、工作权、继承权、生育权等等问题。面对当前生命科学工业的趋势形成，生物技术的产业化应当有规化有节制地进行，生物科技在一定程度上造福了人类社会，同时也带来了环境安全和社会伦理等一系列问题，基于生物技术发展有可能带来的不利影响，如何采取有效预防和控制措施，对其进行科学管理，逐步提上了日程。
【参考文献】
[1]郭奕斌.基因诊断中测序技术的应用与优缺点.遗传，北京，2014.11，36（11）：1121～1130.
[2]张得芳，马秋月，尹佟明，等.第三代测序技术及其应用.中国生物工程杂志，北京，2013，33（5）：125～131.
[3]曲萌，孙立伟，王艳双.分子生物学实验技术.上海：第二军医大学出版社，2012.5：137～138.
[4]郭尧君.蛋白质电泳实验技术.北京：科学出版社，1999，2：56～68.
[5]朱玉贤.现代分子生物学（第4版）.北京：高等教育出版社，2013，1：197.
【关键词】生物技术；基因测序；生物芯片；双向电泳；管理
The Application and Management of Modern Biotechnology
ZHANG Dong-wei
（Shanghai Jiemin Biotechnology Co.，Ltd China Shanghai 200000）
【Abstract】During the rapid development of science and technology in the 21st century，biotechnology plays a very important role in healthcare， environment，new energy & material，agriculture & ocean etc.As a new possible solution that may transform the economic layout in the future，it could also cause serious consequences to human health and ecologic balance by over deployment or abuse， therefore proper utilization and management would become crucial.This article would describe the application and prospect about modern biotechnology by three classic examples respectively， and then discuss several management approaches that could add more value to human society.Meanwhile it makes some suggestions for peers and experts’reference in related field based on current trends.
【Key words】Biotechnology；Gene sequencing；Biochip；Two-dimensional electrophoresis；Management
0.引言
生物技术（Biotechnology）是应用生命科学研究成果，以人们的意志设计，对生物或生物的成分进行改造和利用的综合性新兴技术，涵盖了基因工程、分子生物学、遗传学、胚胎学、物理学、化学、信息学和计算机科学等多门学科，具有广泛的应用前景。近半个世纪来，生命科学在分子水平上取得了突破性成就，生物技术也得到了长足的发展，生物学家的研究重心从揭示生命的所有遗传信息转移到在整体水平上对生物功能的研究。生命科学是实验科学，快速准确地获得生物体的遗传信息对于生命科学研究具有十分重要的意义，因此生命科学的发展极大地依赖于生物技术的发展。以DNA序列分析技术为核心的基因组研究技术推动了基因组研究的日新月异；而以生物芯片技术为代表的基因表达研究技术为科学家了解基因表达规律立下汗马功劳；在蛋白质组研究中，二维电泳和质谱技术的黄金组合又为科学家掌握蛋白质的表达规律再铸辉煌。在后工业化时代背景下，生物技术发展面临的主要课题仍然是人口、环境和资源。
1.基因测序技术
基因是携带有遗传信息的DNA或RNA序列，是控制性状的基本遗传单位。基因通过指导蛋白质的合成来表达自己所携带的遗传信息，从而控制着生物个体的性状表现，支持着生命的基本构造和性能。由30亿个碱基对组成的人类基因组大约含有2.5～4万个基因，储存着生命的种族、血型、孕育、生长、凋亡过程的全部信息。基因测序是国际上公认的一种基因检测标准，是基因工程和分子生物学领域最重要的技术之一。它能够从血液、唾液等组织样本中分析测定基因全序列，预测罹患多种疾病的风险，从而通过改善自己的生活环境和生活习惯，避免或延缓疾病的发生。目前仍然主要应用于科研领域，在相关准入标准、管理规范出台以前，还不能够应用于临床实践。
基因测序技术是遗传学研究发展起来的，能够真实反映DNA的遗传信息，是了解基因结构和功能的基础，可以应用于肿瘤学、免疫学、微生物学等多门学科。1977年Maxam和Gilbert报道了化学降解法，同年Sanger推出了双脱氧链终止法，Sanger法简便快捷并且适合于自动化测序，因而得到了广泛的应用。上世纪80～90年代，学术界开始涉足人类基因组计划，有力地推动了全自动测序技术的发展。基因测序仪得到了重大改进，毛细管电泳取代了传统的薄层板凝胶电泳，采用专利的荧光标记和CCD成像技术，实现了自动灌胶、进样、数据收集与分析等功能，是一台可以测定DNA的碱基顺序或定量DNA片段大小的精密仪器。在计算机控制下有96或384通道两种可选模式，能够在24小时无人干预状态下工作，测序的平均成功率可达85%，读长接近1000bp。配合不同的试剂盒还可以进行微卫星序列分析、单核苷酸多态性分析、基因突变检测、HLA配型、法医学上的亲子和个体鉴定、微生物与病毒的分型与鉴定等。 图1 基因测序
进入21世纪后，采用微磁珠和高密度芯片的第二代测序技术应运而生，其核心思想是使DNA模板与固体表面相结合，然后边合成边测序，通过捕捉新合成的末端标记来确定DNA序列，克服了传统测序方法成本高、效率低等缺点。二代测序技术是测序技术发展过程中一次革命性的改变，是一次可以对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定的大规模平行测序技术，同时使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，因此具有更好的寻找和发现新信息的能力，又被称为深度测序[1]。例如利用合成法测序的454技术和利用连接法测序的SOLiD技术，这些测序平台的共同特点是不需要大肠杆菌系统进行DNA模板扩增，由于测序读长较短带来了后续大量的数据拼接和注释工作，其中454测序技术的读长已经提高到400bp，SOLiD系统原始碱基数据的准确度大于99.94%。二代高通量测序可以帮助研究者跨过文库构建这一实验步骤，避免了亚克隆过程中引入的偏差，比较适合于对已知序列的基因组进行重新测序，而在对全新的基因组进行测序时还需要结合第一代测序技术。
运用第一代Sanger测序技术完成人类基因组计划耗资近30亿美元，历时大约13年；而第二代SOLiD技术完成基因组测序只需几周的时间，成本降到100万美元以下，单次运行能产生50GB的数据，相当于基因组的17倍覆盖度。新一代测序技术提高了速度，但测序产生的海量数据却为后续的分析与储存带来巨大的挑战，现有的生物信息分析软件还没有能力处理如此大量的数据资料，只有发展出能迅速准确分析和储存大量测序数据的软件和方法，才能充分体现出新技术高通量和高准确度的应用价值。另外新一代测序仪的价格大约在50～100万美元，一般实验室是难以负担的，因此对于Kb到Mb范围的小型项目，传统的DNA测序方法无疑还是最佳选择。但在全基因组测序、鉴定体细胞突变及病毒细菌感染与变异等大型基因组计划的实施中，新一代测序技术将发挥巨大作用。
第三代测序技术最大的特点是单分子实时测序，测序时无需PCR扩增，实现了对每一条DNA分子的单独测序，其分辨率具有不可比拟的优势，因此在稀有突变及其频率的测定中可以大显身手。单分子荧光测序是通过显微镜对DNA链合成时的荧光强度变化进行实时记录来完成的，在蚀刻有纳米结构的微阵列芯片上放置数以千计的波导管，每个波导管的空间仅能容纳一个DNA分子外加一个DNA多聚酶分子，在一块小小的芯片上能同时进行数千个测序反应；纳米孔测序是借助电泳技术驱动单个分子逐一通过纳米孔来实现的，在外切酶的辅助下，纳米孔的直径仅允许单个核酸聚合物通过，而不同碱基的带电性质不一样，通过电信号的差异就能检测出通过的碱基类别。三代测序技术保留了DNA聚合酶自身内在的反应速度和延续性，同时系统误差和干扰会显著减小，精确度能达到99.9999%[2]。利用这种技术组合，科研人员能够在24小时内获取基因组信息，检测费用也降到了最低1千美元。据预测，DNA测序技术可能跟随计算机技术和通讯技术成为第三个“摩尔定律化”的学科产业，并将推动个性化医疗的全面发展。
昂贵的费用曾经是阻碍个体基因组测序普及的最大障碍，而随着新的高通量测序技术的发展，测序成本的不断降低，以及在计算机技术的辅助下拼接大量的基因组序列信息，可以更加方便快捷地获取个体遗传信息，DNA测序技术已由一项前沿技术迅速普及为生命科学领域的常规技术。每一种测序方法都具有一定的优势和局限，针对特定目的的基因分析，进行合理的评估，根据具体需求选择或搭配合适的测序平台才是最佳的解决方案，虽然第二、第三代测序技术有很大的通量，基于Sanger原理的毛细管电泳测序仍然是高精度测序的黄金标准，是一种既能从头测序又能从头组装的成熟技术，可以协助验证新一代测序技术的准确性和精确度。人类基因组计划破译了人类全部遗传信息，使人类第一次在分子水平上全面地认识自我，尽管发表于2001年的基因组仍然处于有待完善的阶段中，但其已作为基因组的参照序列而被采用，成为生命科学转化为实际应用的基础，并继续对研究基因型和表现型的关系，揭示生物进化和生命起源的奥秘发挥着重要的作用。
2.生物芯片技术
在20世纪末，生物技术和电子技术相结合诞生了半导体芯片的兄弟—生物芯片（biochip），这将给人类的生活和健康带来深远的影响，对社会的可持续性发展也会起到不可估量的作用。目前主要分为两大类：用于生物计算机等生物电子产品制造的生物电子芯片和用于各种生物大分子、细胞、组织操作以及生物化学反应检测的生物分析芯片，前一类目前在技术和应用上还不成熟，一般情况下生物芯片所指的是生物分析芯片。生物芯片在生命科学研究及实践、医学科研及临床、药物设计、环境保护等各个领域有着广泛的用武之地，既具有重大的基础研究价值，又具有明显的产业化前景。
生物芯片技术的起源最初得益于埃德温·迈勒·萨瑟恩（Edwin Mellor Southern）提出的核酸杂交理论，即标记的核酸分子能够与被固化的与之互补配对的核酸分子杂交，从这一角度而言，Southern杂交可以被看作是生物芯片的雏形。生物芯片的基础研究始于20世纪80年代末，本质上是一种生物技术，主要是在生物遗传学领域发展起来的，是融微电子学、生物学、物理学、化学和计算机科学为一体的高度交叉的新技术。它是通过缩微技术，根据分子间特异性地相互作用的原理，将生命科学领域中不连续的分析过程集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、基因及其它生物组分的准确、快速、大信息量的检测。按照芯片上固化的生物材料的不同，可以将生物芯片划分为基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片和组织芯片；根据原理的不同，还可以分为元件型、通道型微阵列芯片以及生物传感芯片。由于常用硅片作为固相基质，且在制备过程中模拟计算机芯片的制备技术，所以称之为生物芯片技术。
微阵列芯片（microarray）是指高密度固定在支持介质上包含生物信息的分子点阵，每个分子的序列及位置都是已知的，并且是预先设定好的。该技术采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子比如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等等生物样品有序地固化于支持物的表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而获取样品中靶分子的数量或序列信息。例如基因芯片，它是DNA杂交探针技术与半导体工业技术相结合的结晶，具有高通量、微量化和自动化等特点。基因芯片技术由于同时将大量探针固定于支持物上，所以可以一次性对样品大量序列进行检测和分析，从而解决了传统核酸印迹杂交技术操作繁杂、序列数量少、检测效率低等不足。而且，通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有多种不同的应用价值，如基因表达谱测定、突变检测、多态性分析、基因组文库作图及杂交测序等。表达谱基因芯片是用于基因功能研究的一种基因芯片，是目前技术比较成熟，应用最广泛的一种基因芯片，其主要的优点是：检测系统的微型化，对样品需要量非常小，检测基因表达变化的灵敏度高，可检测丰度相差几个数量级的表达情况，而且节约费用和时间。采用表达谱基因芯片研究基因表达可以同时研究上万个基因的表达变化，研究效率明显提高，能更多地揭示基因之间表达变化的相互关系，从而研究基因与基因之间内在的作用关系，使研究更具目的性和系统性，同时也拓宽研究领域。微阵列芯片技术是系统生物技术的基本内容，能为现代医学发展提供强有力的手段，促进医学从“系统、血管、组织和细胞层次”向“DNA、RNA、蛋白质及其相互作用层次”过渡。 图2 基因芯片
微型芯片实验室（lab-on-a-chip）是生物芯片技术发展的高级阶段，或称微全分析系统（Micro Total Analysis System），是指把生物或化学领域所涉及的样品制备、生物与化学反应、分离检测等基本操作单位集成于一块几平方厘米的芯片上，用以完成不同的生物或化学反应过程，并对其产物进行分析的一种技术。它是通过分析化学、微机电加工、计算机、电子学、材料科学与生物学、医学和工程学等技术，实现从试样处理到检测的微型化、自动化与集成化这一目标。功能化芯片实验室大体包括三个部分：一是芯片，将微泵、微阀、管道、流量控制与反应器等高度集成化，完成液体在芯片内部的定向流动与分配等功能；二是分析仪，包括驱动源和信号检测装置；三是实现芯片功能化的方法与试剂盒[3]。最近的发展表明，90年代初由Manz等人提出的以微电子加工技术为依托的芯片实验室的发展将会像四十年前微电子技术在信息科学的发展中引发一场革命一样，预计芯片实验室将在未来的发展中对分析科学乃至整个科学技术以及相关的产业界产生相似的作用。计算机芯片使计算微型化，而芯片实验室使实验室微型化，在生物医学领域它可以使珍贵的生物样品和试剂消耗降低到微升甚至纳升级，而且分析速度成倍提高，成本成倍下降；在化学领域，以前需要在一个大实验室花费大量样品、试剂和很多时间才能完成的分析和合成，将在一块小的芯片上花很少量样品和试剂以很短的时间同时完成；在分析化学领域，它可以使以前大的分析仪器变成平方厘米尺寸规模的分析仪，将大大节约资源和能源。芯片实验室排污很少，所以是一种“绿色”技术。
目前，生物芯片已从主要应用的生命科学领域扩展到其它领域，产业化发展越来越明显、越快速。例如用于DNA、RNA、蛋白质等方向分析检测，还用于化学和生物试剂、环境污染的监测；监控微秒级的化学和生物化学反应动力学；用于许多化学合成反应的研究，药物和化学合成与筛选等。因此，芯片实验室不仅为生物医学家，也为合成化学家打开了通往无限美好明天的大门。由于它的基础研究和技术研究越来越专和精，使整体技术发展速度加快，再加之它朝着检测功能化方面发展，可能成为新的经济增长点。因此生物芯片在经济、社会及科研等方面的应用前景越来越广，其产值有可能超过微电子芯片，成为下一个具有巨大商业潜力的高技术产业。
3.蛋白质双向电泳技术
蛋白质（protein）是生命的物质基础和生命活动的主要承担者，是构成生物体的主要大分子。蛋白质占人体重量的16%～20%，人体内蛋白质的种类很多，性质、功能各异，但都是由20多种氨基酸按不同比例组合而成的，并在体内不断进行代谢与更新。1994年由Marc Wilkins提出了蛋白质组学，指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识。蛋白质组的研究不仅能为生命活动规律提供物质基础，也能为众多种疾病机理的阐明及攻克提供理论根据和解决途径，蛋白质组研究的发展是以双向电泳技术作为核心的。
双向电泳技术（two-dimensional electrophoresis）是分析从细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混合物的有力手段，通过第一向等电聚焦和第二向聚丙烯酰胺凝胶电泳，将不同种类的蛋白质按照等电点和分子量的差异在二维平面上进行分离，并得到每种蛋白质的等电点、表观分子量和含量等信息。等电聚焦电泳是60年代中期问世的一种利用等电点不同在pH梯度介质上分离蛋白质的电泳技术，其特点是分辨率高，不受扩散作用的影响。等电聚焦是一个与pH相关的平衡过程，蛋白质分子在含有载体两性电解质形成的一个连续而稳定的线性pH梯度中电泳，在偏离其等电点的pH条件下带有电荷，当其迁移至等电点的位置时静电荷数为零，这样蛋白质在电场中以不同的速率靠近并最终停留在各自的pI值；聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺作为支持介质的一种常用电泳技术，网状结构的凝胶具有分子筛效应，加入阴离子去污剂和强还原剂十二烷基硫酸钠后，能消除不同蛋白分子间的电荷差异和结构差异，因而电泳迁移率就取决于分子量的大小，可以直接测定蛋白质的分子量，一般采用不连续缓冲系统来获得较高的分辨率[4]。O’Farrell于1975年首次建立二维电泳并成功地分离出约1000个E.coli蛋白，并表明蛋白质谱不是稳定的，而是随环境而变化的。随着技术的飞速发展，现在最多已能分离出10000个斑点，当双向电泳斑点的全面分析成为现实的时候，蛋白质组的分析变得可行。
蛋白质组研究实质上是在细胞水平上对蛋白质进行大规模的平行分离和分析，因而要求有高分辨率的蛋白质分离技术及准确、灵敏的质谱鉴定技术，如何提高双向电泳的分离容量、灵敏度和分辨率以及对蛋白质差异表达的准确检测是目前双向电泳技术发展的关键问题。双向电泳技术虽然难以辨别低丰度蛋白，对操作要求也较高，但其通量高、分辨率和重复性好以及可与质谱联用的特点，使其成为目前最流行、可靠的蛋白质组研究手段。以双向电泳和质谱分析为基础的蛋白质组学研究的程序为：样品制备→等电聚焦→聚丙烯酰胺凝胶电泳→凝胶染色成像→软件分析定量→采集感兴趣的蛋白质点→胶内酶切→质谱分析确定肽指纹图谱或部分氨基酸序列→利用数据库确定蛋白。蛋白质组研究的主要困难是对用双向凝胶电泳分离出来的蛋白质进行定性和定量的分析。
双向电泳技术发展的趋势是在第一维等电聚焦电泳中采用范围窄的PH梯度凝胶，以及开发高灵敏度的的蛋白质荧光染色技术，凝胶电泳中蛋白质的着色不仅影响蛋白质分离的分辨率，同时也影响后续的质谱鉴定。样品的制备和溶解同样事关双向电泳的成效，用化学法和机械裂解法破碎以尽可能溶解和解聚蛋白以提高分辨率。样品预处理涉及溶解、变性和还原，可以完全破坏蛋白间的相互作用，并除去如核酸等非蛋白物质。此外，固相化PH梯度技术建立了稳定的并可以精确设定的PH梯度，避免了载体两性电解质向阴极漂移等许多缺点，增大了蛋白质的上样量，提高了双向电泳的分辨率和可重复性[5]。蛋白质研究技术远比基因技术复杂和困难，蛋白质组学研究的成功与否，很大程度上取决于其技术方法水平的高低，可以说蛋白质组学的发展既是技术所推动的也是受技术限制的。 图3 蛋白质双向电泳
Unlu等提出了一种荧光差异显示双向电泳（F-2D-DIGE）的定量蛋白质组学分析方法，比经典的双向电泳具有更高的动力学范围和灵敏性。差异凝胶电泳是双向电泳在技术上的改良，结合多重荧光分析的方法，在同一块胶上共同分离多个分别由不同荧光标记的样品，并第一次引入了内标的概念。两种样品中的蛋白质采用不同的荧光标记，混合后再进行双向电泳，用来检测蛋白质在两种样品中的表达情况，极大地提高了结果的准确性、可靠性和可重复性。由于每个蛋白点都有自己的内标，软件可全自动根据每个蛋白点的内标对其表达量进行校准，保证所检测到的蛋白丰度变化是真实的，解决了系统误差的问题。在DIGE技术中，不同样品在同一凝胶上电泳后产生多个凝胶图像，避免了几种双向电泳的比较，并且能够在纳克级进行检测，通过Internet可以获得参考图谱。较早期的双向电泳相比，有两个主要的进步：首先，极高的重复性可以用来比较不同组织类型、不同状态的基因表达；其次，高加样量使得双向电泳成为一项真正的制备型技术。
成功的二维电泳可以将2000到3000种蛋白质进行分离，近年来经过多方面改进已成为研究蛋白质组的最有使用价值的核心方法，蛋白质组学技术的发展已经成为现代生物技术快速发展的重要支撑，并将引领生物技术取得关键性的突破。由于双向电泳技术在蛋白质组与医学研究中所处的重要位置，它可用于蛋白质转录及转录后修饰研究，蛋白质组的比较和蛋白质间的相互作用，细胞分化凋亡研究，致病机制及耐药机制的研究，疗效监测，新药开发，癌症研究，蛋白纯度检查，小量蛋白纯化，新替代疫苗的研制等许多方面。通过对正常个体及病理个体间的蛋白质组比较分析，可以找到某些疾病特异性的蛋白质分子，它们可成为新药物设计的分子靶点，或者也会为疾病的早期诊断提供分子标志。确实，那些世界范围内销路最好的药物本身是蛋白质或其作用靶点为某种蛋白质分子。因此，蛋白质组学研究不仅是探索生命奥秘的必须工作，也能为人类健康事业带来巨大的利益。蛋白质组学的研究是生命科学进入后基因组时代的特征，蛋白质组学与其它大规模科学如基因组学，生物信息学等领域交叉融合，呈现出系统生物学（Systems Biology）研究模式，将成为未来生命科学的新前沿。
4.总结
我国具有丰富的生物资源，合理地开发和利用生物技术对国民经济的健康协调和可持续性发展有着非常重要的意义。另一方面，有效的创新能力不足，资金投入有限，管理和技术人才缺乏是目前制约生物技术进一步发展的主要因素。在资源有限的情况下，避免从事低水平，重复性的研究工作，相对集中一部分人力，物力和财力，建立集生物技术，自动化技术和信息技术为一体的研发中心，可能是适合我国国情的发展道路。加强各大专院校、科研院所重点实验室仪器设备的配置和管理，优化资源共享与人才交流的机制，创造良好的环境促进具有明显效益和前景的科研成果转化应用。条件成熟时，可以有针对性地根据具体需求，国内自主研发新一代的科研仪器。
生物技术研究中不断涌现出新信息、新技术、新疗法、新药物和新观念等等新事物，在一定时期内还难以判定其利弊优劣，在采用它们或研究它们时，必然涉及道德、法律和社会问题。例如：生物信息的隐私权问题，基因诊断、治疗和预防中的安全性问题，个人遗传信息的知情同意权问题，并由此引发出来的保险权、工作权、继承权、生育权等等问题。面对当前生命科学工业的趋势形成，生物技术的产业化应当有规化有节制地进行，生物科技在一定程度上造福了人类社会，同时也带来了环境安全和社会伦理等一系列问题，基于生物技术发展有可能带来的不利影响，如何采取有效预防和控制措施，对其进行科学管理，逐步提上了日程。
【参考文献】
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