【摘 要】
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目的 构建HTRA1基因的shRNA慢病毒表达载体,并鉴定HTRA1 shRNA慢病毒感染RPE细胞株的效果.设计实验研究.研究对象HTRA1 shRNA慢病毒载体和RPE细胞.方法 设计靶向HTRA1 mRNA的
【机 构】
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100730,首都医科大学附属北京同仁医院北京同仁眼科中心北京市眼科学与视觉科学重点实验室
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目的 构建HTRA1基因的shRNA慢病毒表达载体,并鉴定HTRA1 shRNA慢病毒感染RPE细胞株的效果.设计实验研究.研究对象HTRA1 shRNA慢病毒载体和RPE细胞.方法 设计靶向HTRA1 mRNA的寡核苷酸序列,构建HTRA1 shRNA表达质粒,测序鉴定其序列的正确性.通过载体质粒pGC-LV与辅助质粒pHelper 1.0、pHelper 2.0共转染293T细胞包装慢病毒,收集病毒上清,测定滴度.将包装好的HTRA1shRNA慢病毒感染RPE细胞,设阴性对照和空白对照,采用实时PCR(RT-PCR)和蛋白印迹法(Western Blot)方法检测HTRA1基因的mRNA水平和蛋白质表达水平的变化.主要指标HTRA1基因的mRNA和蛋白质表达量.结果 DNA测序证实HTRA1 shRNA表达质粒包装了正确的RNA干扰序列.慢病毒滴度测定为8× 108 TU/ml.HTRA1 shRNA慢病毒感染RPE细胞后,HTRA1基因的mRNA水平和蛋白质表达水平较空白对照组和阴性对照组均明显下降,差异均有统计学意义.结论 成功构建了HTRA1 shRNA的慢病毒表达载体,该shRNA慢病毒能够有效地抑制RPE细胞株HTRA1基因的表达.
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