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摘 要：目的：探讨能力验证中双歧杆菌计数培养基的选择及注意事项。方法：依据《食品安全国家标准 食品微生物学检验 双歧杆菌检验》（GB 4789.34—2016）和乳粉中乳酸菌检验能力验证[ACAS-PT926（2020）]参试指导书的要求，通过采用人员比对及不同培养基（MRS培养基、双歧杆菌培养基），比较分析双歧杆菌计数结果的差异性。结果：相同培养条件下，同一样品使用MRS培养基和双歧杆菌培养基，结果的再现性均较低，两种培养基的稳定性较好。同一样品在双歧杆菌培养基中的菌落计数均比MRS培养基高，但两者的再现性（r=0.17，r=0.21）均小于再现性限（r=0.45），表明两者的差异是可以接受的。结论：MRS培养基和双歧杆菌培养基均可作为双歧杆菌计数培养基，两者的稳定性均较好。在日常样品检验过程中，为了提高工作效率，可选用更为便捷的MRS培养基，若要尽可能多地计算样品中双歧杆菌含量，可选用BBL培养基进行培养计数。
关键词：能力验证;双歧杆菌;培养基
双歧杆菌（Bifidobacterium）是一类严格厌氧的革兰氏阳性杆菌，广泛存在于人和动物体内，具有抗菌、抗感染、免疫调节、降低胆固醇、抗肿瘤等多种生理功能[1-4]，是人体内重要的益生菌。目前，双歧杆菌在医学、功能性食品、保健食品等方面有较深入的研究，被广泛应用于各种乳制品中。
随着食品行业的快速发展，消费者对食品的安全性和质量要求越来越高，我国食品微生物标准《食品安全国家标准 婴儿配方食品》（GB 10765—2010）和《食品安全国家标准 较大婴儿和幼儿配方食品》（GB 10767—2010）中明确规定添加活性菌种的产品其活性益生菌的数量要≥
106 CFU/mL，但要准确测定食品中双歧杆菌的含量，通常受测试环境、样品保存条件、样品均匀性、稀释体积、取样体积、培养时间、培养温度、观察计数等多方面因素的影响[4-8]。因此，科学、准确地测定产品中双歧杆菌等益生菌的数量十分关键。
能力验证是利用实验室间的比对判定实验室的特定校准、检测能力，以考察实验室检验技术能力的外部质量活动[9-10]，在人员能力评估、数据准确性分析等方面具有重要意义[11-13]。为了更准确更科学全面的得出能力验证结果，本实验室依据《食品安全国家标准 食品微生物学检验 双歧杆菌检验》（GB 4789.34—2016），采用人员比对及MRS琼脂和双歧杆菌琼脂（BBL培养基）2种培养基对能力验证样品进行检测，通过比较分析不同培养基对双歧杆菌计算结果的差异，探究不同培养基的适用性，为实验室进行双歧杆菌计数培养提供培养基的选择参考。
1 材料与方法
1.1 样品
样品20-U983和20-Z259来源于中国检验检疫科学研究院测试评价中心。
1.2 仪器与试剂
Dilumat STRT重量稀释仪（法国biomerieux公司）;Ⅱ级A2型生物安全柜（美国Thermo公司）;Anoxomat Ⅲ 智能化厌氧系统（荷兰anoxomat公司）;IF450 生化培养箱（德国memmert公司）;MRS培养基（北京陆桥技术股份有限公司）;双歧杆菌培养基（广东环凯微生物科技有限公司）;0.85%生理盐水（实验室自制）;西红柿浸出液（实验室自制）。
1.3 实验方法
本研究参照ACAS-PT926（2020）乳粉中乳酸菌检验能力验证参试指导书、GB 4789.34—2016方法操作，制备10倍系列稀释样品匀液至10-5。样品称量前要充分混匀，确保乳酸菌在样品中分布均勻。稀释过程中应充分均质拍打1～2 min，10倍系列稀释管注意要用旋涡振荡器混匀。在进行10倍递增稀释的同时，吸取10-3～10-5样品匀液1 mL于无菌平皿内，做2个平行平皿。及时将10～20 mL冷却至46～50 ℃的琼脂培养基倾注平皿，转动平皿使其混合均匀，于（36±1） ℃下厌氧培养48 h，计数平板上的所有菌落数。样品制备到平板倾注要求在15 min内完成。
分别选择BBL培养基和MRS培养基及3名检测员进行比对实验。
1.4 分析方法
实验结果采用重复性限、再现性限[14]进行分析。重复性为同一样品使用同一培养基，由同一操作者在短时间内进行的两次平行试验的结果，取以10为底的对数后，绝对值差值≤0.25（即重复性限，r=0.25）。再现性为同一样品使用不同培养基进行计数，同一操作者2次独立试验结果取以10为底的对数后，绝对值差值≤0.45（即再现性限，r=0.45）。人员比对再现性：同一样品使用同一培养基进行计数，由不同操作者进行的2次独立试验结果取以10为底的对数后，绝对值差值不大于0.45（即再现性限，r=0.45）。
2 结果与分析
样品使用BBL培养基和MRS培养基经（36±1）℃厌氧培养48 h后，双歧杆菌数计数结果及计算见表1。
人员1的重复性分别为：r=0.11，r=0.08，r=0.01，r=0.06;
人员2的重复性分别为：r=0.06，r=0.10，r=0.04，r=0.04，人员3的重复性分别为：r=0.13，r=0.09，r=0.04，r=0.02，均低于重复性限（r=0.25），重复性均较好。
样品Z259使用MRS培养基做人员比对，其再现性r=0.10，r=0.05，r=0.05;使用BBL培养基做人员比对，其再现性r=0，r=0.02，r=0.02。样品U983使用MRS培养基作人员比对，其再现性均为r=0.01，使用BBL培养基作人员比对，其再现性均为r=0。以上人员比对的再现性均低于再现性限r=0.45，表明两种培养基的稳定性均较好。最终选取人员1的计数结果进行分析及报告。 样品Z259取稀释度10-4进行菌落计数，在MRS培养基上的菌落计数取平均值后乘以稀释倍数，结果为
2.3×105 CFU/g。在BBL培养基上的菌落计数取平均值后乘以稀释倍数，结果为3.4×105 CFU/g。样品Z259在BBL培养基上的菌落计数和在MRS培养基上的菌落计数的再现性r=0.17，小于再现性限（r=0.45），同一样品在2种培养基的计数结果之间的差值不明显。
样品U983取稀释度10-4进行菌落计数，在MRS培养基上的菌落计数取平均值后乘以稀释倍数，结果为7.4×105 CFU/g。
在BBL培养基上的菌落计数取平均值后乘以稀释倍数，结果为1.2×106 CFU/g。样品U983在BBL培养基上的菌落计数和在MRS培养基上的菌落计数的再现性r=0.21，小于再现性限（r=0.45），表明2种培养基对同一样品的计数结果之间的差值是可以接受的。
3 结论与讨论
（1）本次能力验证乳粉样品中仅含有双歧杆菌，按照GB 4789.34—2016的标准要求对样品中双歧杆菌进行计数。本次能力验证为实验室间评定，因MRS培养基和BBL培养基的菌落计数差异不大，考虑到BBL培养基配制烦琐，多数实验室更倾向于使用较为便捷的MRS培养基，故本次结果报告取MRS培养基的菌落计数，20-Z259结果报告为2.3×105 CFU/g，20-U983结果报告为7.4×105 CFU/g，|Z|值均小于2，结果均反馈为满意结果。
（2）实验所用的BBL培养基和MRS培养基均以蛋白胨作为氮源，葡萄糖或可溶性淀粉作为碳源，酵母提取物作为生长因子[15]。相同培养条件下，BBL培养基上的菌落数较MRS培养基多，可能是因为BBL培养基中含有半胱氨酸盐，能为双歧杆菌的生长提供更适宜的还原性环境（厌氧环境），BBL培养基额外添加了番茄汁作为天然营养物质，新鲜番茄汁富含多种维生素，能作为促进双歧杆菌生长的双歧增殖因子，提高双歧杆菌的生长活力[16-17]。研究表明[18]，以3%马铃薯汁为碳源、3%黄豆汁为氮源、10%番茄汁作为生长因子，经37 ℃培养10 h后，活菌数比原MRS培养基增加了2.11倍。
（3）《食品安全国家标准 食品微生物学检验 双歧杆菌检验》（GB 4789.34—2016）中规定的双歧杆菌计数培养基为BBL培养基或MRS培养基，本次实验和相关文献均表明，相同培养条件下，BBL培养基上的活菌数较MRS培养基多，但两者的再现性（r=0.17，r=0.21）均低于再现性限（r=0.45），表明两者的差值明显。因此，在日常样品检验过程中，为了提高工作效率，实验室可选用更为便捷的MRS培养基，若要尽可能多地计算样品中双歧杆菌含量，可选用BBL培养基进行培养计数。
（4）对于能力验证中的实验室间评定，如果多数实验室都采用MRS培养基，只有个别实验室使用BBL培养基，则结果的中位值可能偏低，采用BBL培养基的实验室结果易会落于上四分位值上方，表现为离群值[19]，影响实验室间评定结果的真实性与客观性。因此，对于能力验证中的实验室间评定，能力验证组织方可设置两组不同培养基的实验结果比对，以提高能力验证的客观性和真实性。
本实验通过选取2种培养基（MRS培养基和BBL培养基）对能力验证乳粉样品中双歧杆菌含量进行培养计数，发现BBL培养基的活菌数高于MRS培养基，但两者的再现性低于再现性限，MRS培养基和BBL培养基均可作为双歧杆菌计数培养基。在日常样品检验过程中，实验室可根据实验需求（便捷性需求或更接近真值需求），选取相应的计数培养基。
参考文献
[1]李吉平，陈雪，刘建华，等.双歧杆菌生物特性及其功能研究进展[J].中国奶牛，2020（6）：57-61.
[2]杨淼，赵笑笑，宋馨，等.双歧杆菌的分离培养和生理功能研究进展[J].工业微生物，2020，50（4）：45-51.
[3]张琳，徐加英，石羽杰，等.双歧杆菌BB-12及其免疫调节功能的研究进展[J].上海预防医学，2020，32（7）：600-605.
[4]丁诗瑶，雷文平，刘成国，等.乳酸菌细胞表面结构与胃肠道的相互作用[J].食品与机械，2020，36（4）：40-44.
[5]李宗瑾，王轶，郭晏强，等.城市和农村生活饮用水中菌落总数平皿计数法测量不确定度的A类和B类评定[J].医学动物防制，2021，37（3）：303-305.
[6]李静芳，汤水平，唐小蘭，等.奶粉大肠菌群检测中不确定度的评定[J].中国卫生检验杂志，2009，19（7）：1477-1478.
[7]王海华，兰茜.能力验证菌落总数测定结果不确定度的评定[J].食品安全质量检测学报，2015，6（6）：2352-2355.
[8]杨燕，李琼琼，宋光艳，等.能力验证乳粉中乳酸菌计数不确定度的评定[J].食品安全质量检测学报，2016，7（7）：2747-2750.
[9]BSI Standards Publication.General requirements for the competence of testing and calibration laboratories：ISO/IEC 17025[S].The British Standards institution，2018-3-31
[10]芦云，王芳，金鑫.食品微生物学能力验证[J].检验检疫学刊，2013，23（2）：44-47.
[11]贾东，李宏，王金玲，等.食品微生物学能力验证过程质量控制的研究[J].现代测量与实验室管理，2012，20（6）：49-52.
[12]雷质文.食品微生物实验室质量管理手册[M].北京：中国标准出版社，2006.
[13]周黎明.质量控制技术[M].广州：广东经济出版，2003.
[14]ISO 4833：2003 Microbiology of food and animal feeding stuffs-Horizontal method for the enumeration of microorganisms-Colony-count techni queat 30 degrees C[EB/OL].（2003-02-01）[2021-05-13]https：//www.iso.org/standard/34524.html
[15]王春耀，张德纯，朱辉，等.双歧杆菌番茄培养基的初步研究[J].中国微生态学杂志，2011，23（11）：991-993.
[16]谭欢，侯爱香，周传云.乳酸菌高效增殖条件的探索[J].中国酿造，2007（5）：49-52.
[17]孙媛媛，崔树茂，唐鑫，等.发酵乳杆菌的生长限制性因素分析及高密度培养工艺优化[J].食品与发酵工业，2021，47（6）：1-10.
[18]杜磊，袁超，董亚敏.乳酸菌培养基的优化设计研究[J].黑龙江畜牧兽医，2017（7）：165-168.
[19]吴孝槐.定量食品微生物能力验证统计方法比较研究[J].中国检验检测，2018，26（6）：34-37.
关键词：能力验证;双歧杆菌;培养基
双歧杆菌（Bifidobacterium）是一类严格厌氧的革兰氏阳性杆菌，广泛存在于人和动物体内，具有抗菌、抗感染、免疫调节、降低胆固醇、抗肿瘤等多种生理功能[1-4]，是人体内重要的益生菌。目前，双歧杆菌在医学、功能性食品、保健食品等方面有较深入的研究，被广泛应用于各种乳制品中。
随着食品行业的快速发展，消费者对食品的安全性和质量要求越来越高，我国食品微生物标准《食品安全国家标准 婴儿配方食品》（GB 10765—2010）和《食品安全国家标准 较大婴儿和幼儿配方食品》（GB 10767—2010）中明确规定添加活性菌种的产品其活性益生菌的数量要≥
106 CFU/mL，但要准确测定食品中双歧杆菌的含量，通常受测试环境、样品保存条件、样品均匀性、稀释体积、取样体积、培养时间、培养温度、观察计数等多方面因素的影响[4-8]。因此，科学、准确地测定产品中双歧杆菌等益生菌的数量十分关键。
能力验证是利用实验室间的比对判定实验室的特定校准、检测能力，以考察实验室检验技术能力的外部质量活动[9-10]，在人员能力评估、数据准确性分析等方面具有重要意义[11-13]。为了更准确更科学全面的得出能力验证结果，本实验室依据《食品安全国家标准 食品微生物学检验 双歧杆菌检验》（GB 4789.34—2016），采用人员比对及MRS琼脂和双歧杆菌琼脂（BBL培养基）2种培养基对能力验证样品进行检测，通过比较分析不同培养基对双歧杆菌计算结果的差异，探究不同培养基的适用性，为实验室进行双歧杆菌计数培养提供培养基的选择参考。
1 材料与方法
1.1 样品
样品20-U983和20-Z259来源于中国检验检疫科学研究院测试评价中心。
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1.3 实验方法
本研究参照ACAS-PT926（2020）乳粉中乳酸菌检验能力验证参试指导书、GB 4789.34—2016方法操作，制备10倍系列稀释样品匀液至10-5。样品称量前要充分混匀，确保乳酸菌在样品中分布均勻。稀释过程中应充分均质拍打1～2 min，10倍系列稀释管注意要用旋涡振荡器混匀。在进行10倍递增稀释的同时，吸取10-3～10-5样品匀液1 mL于无菌平皿内，做2个平行平皿。及时将10～20 mL冷却至46～50 ℃的琼脂培养基倾注平皿，转动平皿使其混合均匀，于（36±1） ℃下厌氧培养48 h，计数平板上的所有菌落数。样品制备到平板倾注要求在15 min内完成。
分别选择BBL培养基和MRS培养基及3名检测员进行比对实验。
1.4 分析方法
实验结果采用重复性限、再现性限[14]进行分析。重复性为同一样品使用同一培养基，由同一操作者在短时间内进行的两次平行试验的结果，取以10为底的对数后，绝对值差值≤0.25（即重复性限，r=0.25）。再现性为同一样品使用不同培养基进行计数，同一操作者2次独立试验结果取以10为底的对数后，绝对值差值≤0.45（即再现性限，r=0.45）。人员比对再现性：同一样品使用同一培养基进行计数，由不同操作者进行的2次独立试验结果取以10为底的对数后，绝对值差值不大于0.45（即再现性限，r=0.45）。
2 结果与分析
样品使用BBL培养基和MRS培养基经（36±1）℃厌氧培养48 h后，双歧杆菌数计数结果及计算见表1。
人员1的重复性分别为：r=0.11，r=0.08，r=0.01，r=0.06;
人员2的重复性分别为：r=0.06，r=0.10，r=0.04，r=0.04，人员3的重复性分别为：r=0.13，r=0.09，r=0.04，r=0.02，均低于重复性限（r=0.25），重复性均较好。
样品Z259使用MRS培养基做人员比对，其再现性r=0.10，r=0.05，r=0.05;使用BBL培养基做人员比对，其再现性r=0，r=0.02，r=0.02。样品U983使用MRS培养基作人员比对，其再现性均为r=0.01，使用BBL培养基作人员比对，其再现性均为r=0。以上人员比对的再现性均低于再现性限r=0.45，表明两种培养基的稳定性均较好。最终选取人员1的计数结果进行分析及报告。 样品Z259取稀释度10-4进行菌落计数，在MRS培养基上的菌落计数取平均值后乘以稀释倍数，结果为
2.3×105 CFU/g。在BBL培养基上的菌落计数取平均值后乘以稀释倍数，结果为3.4×105 CFU/g。样品Z259在BBL培养基上的菌落计数和在MRS培养基上的菌落计数的再现性r=0.17，小于再现性限（r=0.45），同一样品在2种培养基的计数结果之间的差值不明显。
样品U983取稀释度10-4进行菌落计数，在MRS培养基上的菌落计数取平均值后乘以稀释倍数，结果为7.4×105 CFU/g。
在BBL培养基上的菌落计数取平均值后乘以稀释倍数，结果为1.2×106 CFU/g。样品U983在BBL培养基上的菌落计数和在MRS培养基上的菌落计数的再现性r=0.21，小于再现性限（r=0.45），表明2种培养基对同一样品的计数结果之间的差值是可以接受的。
3 结论与讨论
（1）本次能力验证乳粉样品中仅含有双歧杆菌，按照GB 4789.34—2016的标准要求对样品中双歧杆菌进行计数。本次能力验证为实验室间评定，因MRS培养基和BBL培养基的菌落计数差异不大，考虑到BBL培养基配制烦琐，多数实验室更倾向于使用较为便捷的MRS培养基，故本次结果报告取MRS培养基的菌落计数，20-Z259结果报告为2.3×105 CFU/g，20-U983结果报告为7.4×105 CFU/g，|Z|值均小于2，结果均反馈为满意结果。
（2）实验所用的BBL培养基和MRS培养基均以蛋白胨作为氮源，葡萄糖或可溶性淀粉作为碳源，酵母提取物作为生长因子[15]。相同培养条件下，BBL培养基上的菌落数较MRS培养基多，可能是因为BBL培养基中含有半胱氨酸盐，能为双歧杆菌的生长提供更适宜的还原性环境（厌氧环境），BBL培养基额外添加了番茄汁作为天然营养物质，新鲜番茄汁富含多种维生素，能作为促进双歧杆菌生长的双歧增殖因子，提高双歧杆菌的生长活力[16-17]。研究表明[18]，以3%马铃薯汁为碳源、3%黄豆汁为氮源、10%番茄汁作为生长因子，经37 ℃培养10 h后，活菌数比原MRS培养基增加了2.11倍。
（3）《食品安全国家标准 食品微生物学检验 双歧杆菌检验》（GB 4789.34—2016）中规定的双歧杆菌计数培养基为BBL培养基或MRS培养基，本次实验和相关文献均表明，相同培养条件下，BBL培养基上的活菌数较MRS培养基多，但两者的再现性（r=0.17，r=0.21）均低于再现性限（r=0.45），表明两者的差值明显。因此，在日常样品检验过程中，为了提高工作效率，实验室可选用更为便捷的MRS培养基，若要尽可能多地计算样品中双歧杆菌含量，可选用BBL培养基进行培养计数。
（4）对于能力验证中的实验室间评定，如果多数实验室都采用MRS培养基，只有个别实验室使用BBL培养基，则结果的中位值可能偏低，采用BBL培养基的实验室结果易会落于上四分位值上方，表现为离群值[19]，影响实验室间评定结果的真实性与客观性。因此，对于能力验证中的实验室间评定，能力验证组织方可设置两组不同培养基的实验结果比对，以提高能力验证的客观性和真实性。
本实验通过选取2种培养基（MRS培养基和BBL培养基）对能力验证乳粉样品中双歧杆菌含量进行培养计数，发现BBL培养基的活菌数高于MRS培养基，但两者的再现性低于再现性限，MRS培养基和BBL培养基均可作为双歧杆菌计数培养基。在日常样品检验过程中，实验室可根据实验需求（便捷性需求或更接近真值需求），选取相应的计数培养基。
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[8]杨燕，李琼琼，宋光艳，等.能力验证乳粉中乳酸菌计数不确定度的评定[J].食品安全质量检测学报，2016，7（7）：2747-2750.
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[12]雷质文.食品微生物实验室质量管理手册[M].北京：中国标准出版社，2006.
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