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摘要：目的：分析抗精子抗体的测定方法，推进其医学研究进展，在临床中得到更广泛地应用。方法：在实验室环境下，采用间接法原理的酶促化学发光免疫分析方法。结论：JETLIA-962型微孔板单光子计数仪或其他发光免疫分析仪，包括振荡器、洗板机、水浴箱，可对抗精子抗体进行精确的测定，使精子质膜颗粒的流动性而阻碍获能，阻止精子穿过透明带与卵子的结合，引起受精的失败，引起不育不孕具有重要意义。
关键词：抗精子抗体；检验方法；临床意义
【中图分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1672-8602（2015）03-0110-02
抗精子抗体（ASA）采用间接法原理的酶促化学发光免疫分析方法。纯化的相应抗原物质预先结合在微孔板的表面，加入待测样本后，样本中相应的抗体与微孔板表面的抗原特异性结合，洗涤后，形成的免疫复合物与随后加入的辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗人单克隆抗体相结合，这样在微孔板表面形成了抗原一特异性抗体一酶标记二抗的免疫复合物，洗涤后加入发光底物，测定相对发光强度，与同时测定的阴性对照品相比较，确定样本中是否存在相应抗体。下面将抗精子抗体的测定方法及临床意义分析汇报如下。
1 检验准备
1.1 标本采集
采血方法：采集无抗凝静脉血2～3ml，也可采集EDTA（1.5g/L全血）、枸橼酸钠（10.9mmol/L全血）或肝素（20～30U/ml全血）作抗凝剂的血浆。
标本保存：室温保存，及时检测。样本在15～25℃放置不超过4h；2～8℃保存不超过12h；-20℃或低于～20℃保存不超过2个月，避免反复冻融；复融的冻存样本应充分平衡至室内温度后方可用于测定。
1.2 注意事项
推荐选用血清，测定前应平衡至室内温度。样本中含有叠氮钠、微型颗粒物会影响实验结果，同时应避免使用乳糜血、高蛋白血、低胆红素血、轻微溶血或生物污染的血液标本。
1.3 试剂
试剂来源：采用北京源德生物医学工程有限公司提供配套试剂。
试剂组成：包被板：8×12条（96人份）或8×6条（48人份）；酶结合物2瓶（96人份）或1瓶（48人份）；阳性对照1瓶；阴性对照l瓶；样本稀释液1瓶；发光液A l瓶；发光液B l瓶；浓缩洗涤剂1瓶。
1.4 试剂准备：试剂应置室温平衡30min。用蒸馏水将浓缩洗涤液稀释20倍后使用。液体试剂使用前应充分混匀。
1.5 试剂保存：未开封试剂盒及其各组分在2～8℃可保存至有效期。开封使用后酶结合物、阴性对照、阳性对照、样本稀释液、洗涤液可于2～8℃稳定4周；包被板、发光液稳定8周。
1.6 仪器：采用JETLIA-962型微孔板单光子计数仪或其他发光免疫分析仪，包括振荡器、洗板机、水浴箱。
2 检验步骤
2.1 实验设计：根据阴性、阳性对照、质控品及样本数量截取微孔板条，在板架上放好微孔板条（阴性对照品至少设3孔，阳性对照品至少设l孔）。
2.2 加样：在阴性、阳性对照品孔位中分别加入l00μl的阴性、阳性对照。在相应的待测样本孔位中分别加入lOOμl的样本稀释液和lOμl样本或质控品（建议先加入样本稀释液），加入样本时应吸打混匀（样本孔会变蓝，提示已加样）。
2.3 温育：盖上封板膜，在振荡器上振荡片刻（不少于5s），置37℃水浴箱中温育30min。
2.4 洗板：机洗或手洗。吸出或倒出反应液，加入洗涤液洗5次（每次加入洗液后静置时间不少于30s），洗涤液量每次每孔不少于300 μl，末次洗板后将板拍干。
2.5 加酶结合物：每孔依次加入lOOμl酶结合物。
2.6 温育：同步骤2.3。
2.7 洗板：同步骤2.4。
2.8 检测：用加样器向每孔中分别加入发光液A、B液各50μl（共lOOμl），振荡片刻（不少于5s），避光放置（5±0.5）min，测定相对发光强度。
2.9 设定孔位信息：在软件支持下将各孔位按实验需要进行定义，并按软件提示输入相关信息。
3 注意事项
3.1 环境相对湿度低于60%时，应关注样本及液体试剂蒸发浓缩对实验结果的影响。
3.2 试剂盒应在有效期内使用，不可混用不同批号试剂及过期试剂。使用前试剂需平衡至室温。样本和试剂不能长时间于室温放置，使用后剩余组分应迅速放回2～8℃保存。
3.3 实验过程中发光液和酶标记物要避免强光直射。
3.4 试剂和样本使用前要充分混匀并避免起泡，沿孔壁加样以避免外溅或产生气泡。
3.5 孵育及振荡过程中要避免微孔内水分的蒸发，应及时盖上盖板膜。
3.6 洗板时每次加入洗液量不能太多，以免造成溢液污染。
3.7 加入发光液后避光放置（5±0.5）min，测定相对发光强度，测定时的室内温度应在20～30℃。
4 结果判定
阴性对照品的平均RLU的2.1倍为Cut-Off值。用每个样本的RLU与Cut-Off值的比值（S/CO）来判断该样本为阴性或阳性。S/CO≤1.0的为阴性，>1.0为阳性，配套仪器中的操作软件可自动完成上述判断，也可以选择人工计算。测定正常参考值所用样本均为-20℃冷冻后复融的血清样本。各实验室应建立自己的Cut-Off值，上述Cut-Off值仅供参考。
5 临床意义
抗精子抗体是由于男性的血睾屏障破坏，或女性的生殖器官的炎症、损伤造成精子进入血液或淋巴循环，与免疫系统接触，引发免疫应答，产生抗体，无论精液还是宫颈黏液中存在的ASA抗体，接触精子后都会使其产生运动特征的改变，并影响精子质膜颗粒的流动性而阻碍获能，阻止精子穿过透明带与卵子的结合，引起受精的失败，引起不育不孕。
参考文献
[1] 李梅花，陈方基.反复自然流产妇女与其抗精子抗体及抗心磷脂抗体的相关性研究.中国保健营养（中旬刊），2013，03.
[2] 王传发.男性不育患者抗精子抗体（AsAb）与抗心磷脂抗体（ACA）联合检测意义的探讨.江西医学检验， 2002，20，06.
[3] 孟小波.男性不育患者抗精子抗体检测及临床应用. 中国社区医师（医学专业），2011， 13，28.
关键词：抗精子抗体；检验方法；临床意义
【中图分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1672-8602（2015）03-0110-02
抗精子抗体（ASA）采用间接法原理的酶促化学发光免疫分析方法。纯化的相应抗原物质预先结合在微孔板的表面，加入待测样本后，样本中相应的抗体与微孔板表面的抗原特异性结合，洗涤后，形成的免疫复合物与随后加入的辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗人单克隆抗体相结合，这样在微孔板表面形成了抗原一特异性抗体一酶标记二抗的免疫复合物，洗涤后加入发光底物，测定相对发光强度，与同时测定的阴性对照品相比较，确定样本中是否存在相应抗体。下面将抗精子抗体的测定方法及临床意义分析汇报如下。
1 检验准备
1.1 标本采集
采血方法：采集无抗凝静脉血2～3ml，也可采集EDTA（1.5g/L全血）、枸橼酸钠（10.9mmol/L全血）或肝素（20～30U/ml全血）作抗凝剂的血浆。
标本保存：室温保存，及时检测。样本在15～25℃放置不超过4h；2～8℃保存不超过12h；-20℃或低于～20℃保存不超过2个月，避免反复冻融；复融的冻存样本应充分平衡至室内温度后方可用于测定。
1.2 注意事项
推荐选用血清，测定前应平衡至室内温度。样本中含有叠氮钠、微型颗粒物会影响实验结果，同时应避免使用乳糜血、高蛋白血、低胆红素血、轻微溶血或生物污染的血液标本。
1.3 试剂
试剂来源：采用北京源德生物医学工程有限公司提供配套试剂。
试剂组成：包被板：8×12条（96人份）或8×6条（48人份）；酶结合物2瓶（96人份）或1瓶（48人份）；阳性对照1瓶；阴性对照l瓶；样本稀释液1瓶；发光液A l瓶；发光液B l瓶；浓缩洗涤剂1瓶。
1.4 试剂准备：试剂应置室温平衡30min。用蒸馏水将浓缩洗涤液稀释20倍后使用。液体试剂使用前应充分混匀。
1.5 试剂保存：未开封试剂盒及其各组分在2～8℃可保存至有效期。开封使用后酶结合物、阴性对照、阳性对照、样本稀释液、洗涤液可于2～8℃稳定4周；包被板、发光液稳定8周。
1.6 仪器：采用JETLIA-962型微孔板单光子计数仪或其他发光免疫分析仪，包括振荡器、洗板机、水浴箱。
2 检验步骤
2.1 实验设计：根据阴性、阳性对照、质控品及样本数量截取微孔板条，在板架上放好微孔板条（阴性对照品至少设3孔，阳性对照品至少设l孔）。
2.2 加样：在阴性、阳性对照品孔位中分别加入l00μl的阴性、阳性对照。在相应的待测样本孔位中分别加入lOOμl的样本稀释液和lOμl样本或质控品（建议先加入样本稀释液），加入样本时应吸打混匀（样本孔会变蓝，提示已加样）。
2.3 温育：盖上封板膜，在振荡器上振荡片刻（不少于5s），置37℃水浴箱中温育30min。
2.4 洗板：机洗或手洗。吸出或倒出反应液，加入洗涤液洗5次（每次加入洗液后静置时间不少于30s），洗涤液量每次每孔不少于300 μl，末次洗板后将板拍干。
2.5 加酶结合物：每孔依次加入lOOμl酶结合物。
2.6 温育：同步骤2.3。
2.7 洗板：同步骤2.4。
2.8 检测：用加样器向每孔中分别加入发光液A、B液各50μl（共lOOμl），振荡片刻（不少于5s），避光放置（5±0.5）min，测定相对发光强度。
2.9 设定孔位信息：在软件支持下将各孔位按实验需要进行定义，并按软件提示输入相关信息。
3 注意事项
3.1 环境相对湿度低于60%时，应关注样本及液体试剂蒸发浓缩对实验结果的影响。
3.2 试剂盒应在有效期内使用，不可混用不同批号试剂及过期试剂。使用前试剂需平衡至室温。样本和试剂不能长时间于室温放置，使用后剩余组分应迅速放回2～8℃保存。
3.3 实验过程中发光液和酶标记物要避免强光直射。
3.4 试剂和样本使用前要充分混匀并避免起泡，沿孔壁加样以避免外溅或产生气泡。
3.5 孵育及振荡过程中要避免微孔内水分的蒸发，应及时盖上盖板膜。
3.6 洗板时每次加入洗液量不能太多，以免造成溢液污染。
3.7 加入发光液后避光放置（5±0.5）min，测定相对发光强度，测定时的室内温度应在20～30℃。
4 结果判定
阴性对照品的平均RLU的2.1倍为Cut-Off值。用每个样本的RLU与Cut-Off值的比值（S/CO）来判断该样本为阴性或阳性。S/CO≤1.0的为阴性，>1.0为阳性，配套仪器中的操作软件可自动完成上述判断，也可以选择人工计算。测定正常参考值所用样本均为-20℃冷冻后复融的血清样本。各实验室应建立自己的Cut-Off值，上述Cut-Off值仅供参考。
5 临床意义
抗精子抗体是由于男性的血睾屏障破坏，或女性的生殖器官的炎症、损伤造成精子进入血液或淋巴循环，与免疫系统接触，引发免疫应答，产生抗体，无论精液还是宫颈黏液中存在的ASA抗体，接触精子后都会使其产生运动特征的改变，并影响精子质膜颗粒的流动性而阻碍获能，阻止精子穿过透明带与卵子的结合，引起受精的失败，引起不育不孕。
参考文献
[1] 李梅花，陈方基.反复自然流产妇女与其抗精子抗体及抗心磷脂抗体的相关性研究.中国保健营养（中旬刊），2013，03.
[2] 王传发.男性不育患者抗精子抗体（AsAb）与抗心磷脂抗体（ACA）联合检测意义的探讨.江西医学检验， 2002，20，06.
[3] 孟小波.男性不育患者抗精子抗体检测及临床应用. 中国社区医师（医学专业），2011， 13，28.