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摘要用高效液相色谱仪(HPLC)快速测定水果中苯并咪唑类农药(多菌灵、噻菌灵和甲基硫菌灵)残留量，样品经乙腈萃取后盐析，提取液经PSA和ODS吸附剂加无水硫酸镁净化后，过0.45μm滤膜，直接用HPLC-PDA(二极管阵列检测器)分离测定，外标法定量。采用乙腈/0.02moL/L磷酸缓冲盐(pH值7.4)=28/72体系为流动相，多菌灵、噻菌灵和甲基硫菌灵在苹果、梨、葡萄、香蕉、芒果、桔子等6种水果中杂质干扰少，分离度较好，靈敏度高，测定结果准确可靠。最低检出限分别为：多菌灵0.045 5mg/kg，噻菌灵0.042 1mg/kg，甲基硫菌灵0.068 6mg/kg。在添加0.2～1.0mg/kg浓度水平的回收率试验中，多菌灵、噻菌灵和甲基硫菌灵的平均添加回收率分别为82.0%～102.4%、87.6%～104.8%和79.6%～112.5%，RSD均在10%以下，满足残留分析的要求。
关键词苯并咪唑类农药；水果；高效液相色谱仪；残留；测定
中图分类号S66；S482.2 文献标识码A 文章编号 1007-5739(2009)01-0114-03
苯并咪唑类杀菌剂是一类高效、低毒和广谱的内吸性杀菌剂，兼具预防和治疗作用。该类杀菌剂常用于作物生长后期或采后的病害防治，在农产品中检出率较高，蔬菜、水果中尤为突出[1，2]。残留于果蔬中的苯并咪唑类杀菌剂对人体有一定的毒性。因此，检测其在果蔬中残留量，对保证人体健康有重要意义。多菌灵、噻菌灵是苯并咪唑类杀菌剂中的代表性农药，尤其是多菌灵，是苯菌灵、氰菌灵、硫菌灵及醚菌灵等多种农药的共同降解产物。实际上，在pH值接近中性时，果实上的苯菌灵在分析过程中几乎完全转化成多菌灵，而甲基硫菌灵仅有少量转化成多菌灵，故分析苯并咪唑类杀菌剂残留时，只需测定多菌灵、噻菌灵和甲基硫菌灵即可[3]。近年来，关于苯并咪唑类杀菌剂在不同作物中的残留测定已有报道[4-10]，但样品前处理均需经过液—液萃取或固相萃取富集、净化，比较复杂。据统计，在农药残留分析中，有2/3的时间都花在提取和净化等预处理上，因此研究快速、有效的样品预处理方法在农药残留分析中具有重要的意义。笔者以苹果、梨、柑橘、葡萄、香蕉、芒果等6种代表性水果为试材，以多菌灵、噻菌灵和甲基硫菌灵等3种主要苯并咪唑类农药为对象，探索建立一种操作步骤较为简单、快速，结果准确、可靠，能满足水果中多菌灵、噻菌灵和甲基硫菌灵同时测定的分析方法。
1.5净化
从离心管中准确吸取2.0mL乙腈溶液到盛有50mg PSA、50mg ODS、100mg无水MgSO4的10mL离心管中，在旋涡混合器上混匀后，上清液用0.45μm滤膜过滤，待测。
2结果与分析
2.1检测波长的确立
经二极管阵列检测器波长扫描，多菌灵在225nm和285nm处有较大吸收峰，甲基硫菌灵在210nm和265nm处有较大吸收峰，噻菌灵在200nm和300nm处有较大吸收峰。但多菌灵在285nm、甲基硫菌灵在265nm、噻菌灵在300nm处杂质峰少，基线稳定，因此选择其为检测波长。
2.2流动相的选择
流动相的组成对样品中组分的分离有一定的影响。采用传统的甲醇/水作为流动相体系时，苹果、梨、香蕉、芒果等样品中多菌灵、噻菌灵和甲基硫菌灵与杂质峰基本可分开，但对于柑橘样品，无论采用何种比例的甲醇/水为流动相，多菌灵和噻菌灵峰均被杂质峰掩盖。采用乙腈/0.02moL/L磷酸缓冲盐(pH值7.4)= 28/72作为流动相体系，6种水果中多菌灵、噻菌灵和甲基硫菌灵与杂质峰的分离效果较好，均无杂质峰干扰，且峰形较好。流动相pH值影响被分析物的分离效果。考虑到多菌灵在酸性条件下会形成盐，故采用碱性的二乙胺调节流动相的pH值。分别调节流动相pH值为6.0、6.4、6.8、7.0、7.2、7.4，结果表明，pH值在7.0以下时，多菌灵响应值偏低，噻菌灵和甲基硫菌灵峰形较宽且有明显的拖尾现象；pH值在7.2~7.4时，多菌灵、噻菌灵和甲基硫菌灵的灵敏度高，峰形尖锐且对称性好。
2.3色谱分离
在所确定的试验条件下，多菌灵、噻菌灵和甲基硫菌灵三者分离良好，保留时间分别为5.710min、7.255min和17.255min。即使基质较为复杂的柑橘样品，也获得了良好的分离效果。标准样品色谱图和柑橘添加标样色谱图见图1。
2.4提取与净化
考虑到综合提取效率、选择性、与样品混合性以及溶剂化作用和渗透能力等因素，本方法采用乙腈作为苯并咪唑类农药残留量的提取剂，提取速度快，易于操作。对于蔬菜和水果类的农残分析，PSA吸附剂具有弱的阴离子交换能力，有利于吸附样品基质中的有机酸、糖及色素，并且对各种性能差异较大的农药具有较高的回收率。为更好地去除对色谱柱性能有影响的杂质，本方法采用前处理中在PSA加入一定量ODS和硫酸镁的净化方法，在去除水分、色素、蛋白质、脂肪、腊质等干扰物的同时又对色谱柱起到一定保护作用。
2.5线性关系与检测限
以0.1mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L等4个标准系列绘制标准曲线，以浓度Y对峰面积X进行回归。结果表明，在0.1~2.0mg/L浓度范围内，苯并咪唑类农药的浓度与峰面积具有良好的线性关系，其回归方程和相关系数分别为：多菌灵Y=2.0×10-5X 0.013 2，r=0.999 3；噻菌灵Y=1.0×10-5X 0.009 4，r=0.999 9；甲基硫菌灵Y= 3.0×10-5X 0.009 3，r=0.999 0。最低检出限是以仪器基线噪声3倍所对应的质量浓度值计[13]，在所确定的试验条件下，多菌灵、噻菌灵和甲基硫菌灵的最低检出限分别为0.045 5mg/kg、0.042 1mg/kg和0.068 6 mg/kg。
2.6添加回收率试验
水果种类繁多，不同水果其水分、糖、酸、色素等物质有较大的差异，本试验选择苹果、梨、葡萄、香蕉、芒果、柑橘等6种代表性水果为试材，进行3个水平(0.2mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg)的添加回收试验，每个水平各设3次重复，结果见表1。多菌灵、噻菌灵和甲基硫菌灵在6种水果中的平均添加回收率分別为82.0%～102.4%、87.6%～104.8%和79.6%～112.5%，RSD均在10%以下。方法的准确度和精密度均符合残留分析的要求[13]。
3结论与讨论
本方法采用乙腈为提取剂，PSA吸附剂和ODS吸附剂与无水硫酸镁组合的提取、净化方法，不仅可除去提取液中水分、色素、蛋白质、脂肪、腊质等干扰物，而且有助于去除对色谱柱性能有影响的杂质，延长色谱柱使用寿命。提取液净化后不需浓缩处理，过滤膜后直接进样检测，操作简便、快速，大大简化了样品前处理步骤，节约了时间。以乙腈/0.02moL/L磷酸盐(pH值7.4)＝28/72体系作为流动相，多菌灵、噻菌灵和甲基硫菌灵在6种代表性水果中均有较好的峰形和分离度，杂质干扰少，平均回收率在79.6%～112.5%，RSD均在10%以下，最低检出限为0.042 1～0.068 6mg/kg。本方法操作简便、快速，对水果中多菌灵、噻菌灵、甲基硫菌灵等3种苯并咪唑类农药残留量能同时进行测定，结果准确可靠，灵敏度高，方法的准确度和精密度均符合残留分析的要求。
4参考文献
[1] OREELLID，EEDDER，PATREC.Pesticide residues survey in citrus fruits[J].Food Additives and Contaminant，2005，22(5)：423-428.
[2] ATTILIOV，GIVANNIV，SWIZLYSA. Determination of carbendazim，thiabendazole and thiophanate-methyl in banana(Musa acuminate)sam-ples imported to Italy[J].Food chemistry，2004，87(3)：383-386.
[3] TORRESCM，PICOY，MARIESJ. Determination of pesticide residues in fruit and vegetables[J]. Journal of chromatography：A，1996(754)：301-331.
[4] RIAL O R，CANCHO G B，SIMAL G J. Multiresidue method for fourteen fungicides in white grapes by liquid—liquid and solid phase extraction followed by liquid chromatography—diode array detection[J].Journal of chromatography：A，2003(992)：121-131.
[5] RODNEY J B，HEATHER L H，JASOTHA K，et al. Determination carbendazim in blue berries by reversed phase high-performance liquid chromatography[J].Journal of chromatography，1991(587)：321-324.
[6] RODRYGUEZ R，PICO Y，FONT G，et al. Analysis of post—harvest fungicides by micellar electrokinetie chromatography[J].Journal of chromatography：A，200l(924)：387-396.
[7] RODRYGUEZ R，PICO Y，FONT G，et al. Analysis of thiabendazole and procymidone in fruits and vegetables by eapillary eleetrophoresis-eleetrospray mass spectrometry[J]. Journal of chromatography：A，2002(949)：359-366.
[8] CARLO BICCHI. 高效液相色谱法同时测定苹果、梨及其果肉中苯并咪唑类杀菌剂[J].农药，1989，28(5)：39-40.
[9] HUR W，HENNION B，URRUTY L，et al.Solid phase microextraction of pesticide residues from strawberries[J].Food Additives and Contaminant，1999(16)：111-116.
[10] NAVAAAO M，PICO Y，MARYN R，et al. Application of matrix solid-phase dispersion to the determination of a new generation of fungicides in fruits and vegetables[J]. Journal of chromatography：A，2002(968)：201-209.
[11] BLASCO C，PICO Y，FONT G，et al. Determination of fungicide residues in fruits and vegetables by liquid chromatography atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry[J]. Journal of chromato-graphy：A，2002(947)：227-235.
[12] 孔祥虹，何学文，张妮华.高效液相色谱法测定浓缩苹果汁中的多菌灵残留量[J].化学分析计量，2003，12(1)：13-14.
[13] 李本昌.农药残留量实用检测方法手册[M].北京：化学工业出版社，2001.
关键词苯并咪唑类农药；水果；高效液相色谱仪；残留；测定
中图分类号S66；S482.2 文献标识码A 文章编号 1007-5739(2009)01-0114-03
苯并咪唑类杀菌剂是一类高效、低毒和广谱的内吸性杀菌剂，兼具预防和治疗作用。该类杀菌剂常用于作物生长后期或采后的病害防治，在农产品中检出率较高，蔬菜、水果中尤为突出[1，2]。残留于果蔬中的苯并咪唑类杀菌剂对人体有一定的毒性。因此，检测其在果蔬中残留量，对保证人体健康有重要意义。多菌灵、噻菌灵是苯并咪唑类杀菌剂中的代表性农药，尤其是多菌灵，是苯菌灵、氰菌灵、硫菌灵及醚菌灵等多种农药的共同降解产物。实际上，在pH值接近中性时，果实上的苯菌灵在分析过程中几乎完全转化成多菌灵，而甲基硫菌灵仅有少量转化成多菌灵，故分析苯并咪唑类杀菌剂残留时，只需测定多菌灵、噻菌灵和甲基硫菌灵即可[3]。近年来，关于苯并咪唑类杀菌剂在不同作物中的残留测定已有报道[4-10]，但样品前处理均需经过液—液萃取或固相萃取富集、净化，比较复杂。据统计，在农药残留分析中，有2/3的时间都花在提取和净化等预处理上，因此研究快速、有效的样品预处理方法在农药残留分析中具有重要的意义。笔者以苹果、梨、柑橘、葡萄、香蕉、芒果等6种代表性水果为试材，以多菌灵、噻菌灵和甲基硫菌灵等3种主要苯并咪唑类农药为对象，探索建立一种操作步骤较为简单、快速，结果准确、可靠，能满足水果中多菌灵、噻菌灵和甲基硫菌灵同时测定的分析方法。
1.5净化
从离心管中准确吸取2.0mL乙腈溶液到盛有50mg PSA、50mg ODS、100mg无水MgSO4的10mL离心管中，在旋涡混合器上混匀后，上清液用0.45μm滤膜过滤，待测。
2结果与分析
2.1检测波长的确立
经二极管阵列检测器波长扫描，多菌灵在225nm和285nm处有较大吸收峰，甲基硫菌灵在210nm和265nm处有较大吸收峰，噻菌灵在200nm和300nm处有较大吸收峰。但多菌灵在285nm、甲基硫菌灵在265nm、噻菌灵在300nm处杂质峰少，基线稳定，因此选择其为检测波长。
2.2流动相的选择
流动相的组成对样品中组分的分离有一定的影响。采用传统的甲醇/水作为流动相体系时，苹果、梨、香蕉、芒果等样品中多菌灵、噻菌灵和甲基硫菌灵与杂质峰基本可分开，但对于柑橘样品，无论采用何种比例的甲醇/水为流动相，多菌灵和噻菌灵峰均被杂质峰掩盖。采用乙腈/0.02moL/L磷酸缓冲盐(pH值7.4)= 28/72作为流动相体系，6种水果中多菌灵、噻菌灵和甲基硫菌灵与杂质峰的分离效果较好，均无杂质峰干扰，且峰形较好。流动相pH值影响被分析物的分离效果。考虑到多菌灵在酸性条件下会形成盐，故采用碱性的二乙胺调节流动相的pH值。分别调节流动相pH值为6.0、6.4、6.8、7.0、7.2、7.4，结果表明，pH值在7.0以下时，多菌灵响应值偏低，噻菌灵和甲基硫菌灵峰形较宽且有明显的拖尾现象；pH值在7.2~7.4时，多菌灵、噻菌灵和甲基硫菌灵的灵敏度高，峰形尖锐且对称性好。
2.3色谱分离
在所确定的试验条件下，多菌灵、噻菌灵和甲基硫菌灵三者分离良好，保留时间分别为5.710min、7.255min和17.255min。即使基质较为复杂的柑橘样品，也获得了良好的分离效果。标准样品色谱图和柑橘添加标样色谱图见图1。
2.4提取与净化
考虑到综合提取效率、选择性、与样品混合性以及溶剂化作用和渗透能力等因素，本方法采用乙腈作为苯并咪唑类农药残留量的提取剂，提取速度快，易于操作。对于蔬菜和水果类的农残分析，PSA吸附剂具有弱的阴离子交换能力，有利于吸附样品基质中的有机酸、糖及色素，并且对各种性能差异较大的农药具有较高的回收率。为更好地去除对色谱柱性能有影响的杂质，本方法采用前处理中在PSA加入一定量ODS和硫酸镁的净化方法，在去除水分、色素、蛋白质、脂肪、腊质等干扰物的同时又对色谱柱起到一定保护作用。
2.5线性关系与检测限
以0.1mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L等4个标准系列绘制标准曲线，以浓度Y对峰面积X进行回归。结果表明，在0.1~2.0mg/L浓度范围内，苯并咪唑类农药的浓度与峰面积具有良好的线性关系，其回归方程和相关系数分别为：多菌灵Y=2.0×10-5X 0.013 2，r=0.999 3；噻菌灵Y=1.0×10-5X 0.009 4，r=0.999 9；甲基硫菌灵Y= 3.0×10-5X 0.009 3，r=0.999 0。最低检出限是以仪器基线噪声3倍所对应的质量浓度值计[13]，在所确定的试验条件下，多菌灵、噻菌灵和甲基硫菌灵的最低检出限分别为0.045 5mg/kg、0.042 1mg/kg和0.068 6 mg/kg。
2.6添加回收率试验
水果种类繁多，不同水果其水分、糖、酸、色素等物质有较大的差异，本试验选择苹果、梨、葡萄、香蕉、芒果、柑橘等6种代表性水果为试材，进行3个水平(0.2mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg)的添加回收试验，每个水平各设3次重复，结果见表1。多菌灵、噻菌灵和甲基硫菌灵在6种水果中的平均添加回收率分別为82.0%～102.4%、87.6%～104.8%和79.6%～112.5%，RSD均在10%以下。方法的准确度和精密度均符合残留分析的要求[13]。
3结论与讨论
本方法采用乙腈为提取剂，PSA吸附剂和ODS吸附剂与无水硫酸镁组合的提取、净化方法，不仅可除去提取液中水分、色素、蛋白质、脂肪、腊质等干扰物，而且有助于去除对色谱柱性能有影响的杂质，延长色谱柱使用寿命。提取液净化后不需浓缩处理，过滤膜后直接进样检测，操作简便、快速，大大简化了样品前处理步骤，节约了时间。以乙腈/0.02moL/L磷酸盐(pH值7.4)＝28/72体系作为流动相，多菌灵、噻菌灵和甲基硫菌灵在6种代表性水果中均有较好的峰形和分离度，杂质干扰少，平均回收率在79.6%～112.5%，RSD均在10%以下，最低检出限为0.042 1～0.068 6mg/kg。本方法操作简便、快速，对水果中多菌灵、噻菌灵、甲基硫菌灵等3种苯并咪唑类农药残留量能同时进行测定，结果准确可靠，灵敏度高，方法的准确度和精密度均符合残留分析的要求。
4参考文献
[1] OREELLID，EEDDER，PATREC.Pesticide residues survey in citrus fruits[J].Food Additives and Contaminant，2005，22(5)：423-428.
[2] ATTILIOV，GIVANNIV，SWIZLYSA. Determination of carbendazim，thiabendazole and thiophanate-methyl in banana(Musa acuminate)sam-ples imported to Italy[J].Food chemistry，2004，87(3)：383-386.
[3] TORRESCM，PICOY，MARIESJ. Determination of pesticide residues in fruit and vegetables[J]. Journal of chromatography：A，1996(754)：301-331.
[4] RIAL O R，CANCHO G B，SIMAL G J. Multiresidue method for fourteen fungicides in white grapes by liquid—liquid and solid phase extraction followed by liquid chromatography—diode array detection[J].Journal of chromatography：A，2003(992)：121-131.
[5] RODNEY J B，HEATHER L H，JASOTHA K，et al. Determination carbendazim in blue berries by reversed phase high-performance liquid chromatography[J].Journal of chromatography，1991(587)：321-324.
[6] RODRYGUEZ R，PICO Y，FONT G，et al. Analysis of post—harvest fungicides by micellar electrokinetie chromatography[J].Journal of chromatography：A，200l(924)：387-396.
[7] RODRYGUEZ R，PICO Y，FONT G，et al. Analysis of thiabendazole and procymidone in fruits and vegetables by eapillary eleetrophoresis-eleetrospray mass spectrometry[J]. Journal of chromatography：A，2002(949)：359-366.
[8] CARLO BICCHI. 高效液相色谱法同时测定苹果、梨及其果肉中苯并咪唑类杀菌剂[J].农药，1989，28(5)：39-40.
[9] HUR W，HENNION B，URRUTY L，et al.Solid phase microextraction of pesticide residues from strawberries[J].Food Additives and Contaminant，1999(16)：111-116.
[10] NAVAAAO M，PICO Y，MARYN R，et al. Application of matrix solid-phase dispersion to the determination of a new generation of fungicides in fruits and vegetables[J]. Journal of chromatography：A，2002(968)：201-209.
[11] BLASCO C，PICO Y，FONT G，et al. Determination of fungicide residues in fruits and vegetables by liquid chromatography atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry[J]. Journal of chromato-graphy：A，2002(947)：227-235.
[12] 孔祥虹，何学文，张妮华.高效液相色谱法测定浓缩苹果汁中的多菌灵残留量[J].化学分析计量，2003，12(1)：13-14.
[13] 李本昌.农药残留量实用检测方法手册[M].北京：化学工业出版社，2001.