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摘要[目的]制备琥乙红霉素纳米乳，并对其进行体外抑菌活性研究。[方法]利用伪三元相图法筛选琥乙红霉素纳米乳处方；采用微量肉汤稀释法，检测琥乙红霉素纳米乳对致病性大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、肺炎球菌和变形杆菌的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌质量浓度（MBC）。[结果]琥乙红霉素纳米乳中各组分的质量分数如下：琥乙红霉素2.8%、乳酸甲氧苄啶 0.6%、EL-40 35.2%、肉桂醛7.5%、蒸馏水 53.9%。体外抑菌试验表明，琥乙红霉素纳米乳对致病性大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、肺炎球菌和变形杆菌的最小抑菌浓度（MIC）分别为4、1、2和4 μg/mL，其抑菌效果明显优于其他对照药物组。[结论]该研究成功研制了琥乙红霉素纳米乳，其体外抑菌效果明显。
关键词头孢克肟；纳米乳；伪三元相图；最小抑菌浓度
中图分类号S859.5+3文献标识码A文章编号0517-6611（2016）13-183-03
琥乙红霉素，英文名 Erythromycin，属于大环内酯类抗生素，为红霉素的琥珀酸乙酯，在胃酸中较红霉素稳定。对葡萄球菌属（ 耐甲氧西林菌株除外 ）、各组链球菌和革兰阳性杆菌均具有抗菌活性。奈瑟菌属、流感嗜血杆菌和百日咳鲍特氏菌等也对本品敏感[1]。本品对除脆弱拟杆菌和梭杆菌属以外的各种厌氧菌亦具有抗菌作用，对军团菌属、胎儿弯曲菌、某些螺旋体、肺炎支原体、立克次体属和衣原体属也有抑制作用。本品可透过细菌细胞膜，在接近供位（P 位）与细菌核糖体的 50S 亚基形成可逆性结合，阻断转移核糖核酸（t-RNA）结合至 “P” 位上，同时也阻断多肽链自受位（“A” 位）至 “P” 位的位移，从而抑制细菌的蛋白质合成[2]。本品为含矫味剂的颗粒，味甜而芳香。乳酸甲氧苄啶是许多抗生素通用的增效剂，与琥乙红霉素合用时能大大提高其抗菌活性。
纳米乳（Nanoemulsion）也称为微乳（Microemulsion），粒径一般为1～100 nm，是由油相、水相和表面活性剂按适当比例混合而成的一种透明或半透明、低黏度的动力学和热力学稳定体系[3]。纳米乳作为药物载体，具有以下优点：提高难溶性药物的溶解度，增强不稳定药物的稳定性，黏度低、粒径小且均匀，使被包容的药物分散度提高，具有缓释和靶向作用，促进药物在体内的吸收，提高其生物利用度，降低其毒副作用[4]。
笔者根据琥乙红霉素的理化性质将其制成纳米乳，并考察其体外抑菌效果，以期为该纳米乳药物在人类和兽医临床上的应用提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1主要试剂和药品。琥乙红霉素，购自湖北恒硕化工有限公司，纯度99%；肉桂醛，购自武汉远成共创科技有限公司；肉豆蔻酸异丙酯，购自国药集团化学试剂有限公司；三乙酸甘油酯，购自国药集团化学试剂有限公司；吐温-80、EL-40、RH-40均为化学纯，购自天津市恒兴化学试剂制造有限公司；琥乙红霉素片，批号为国药准字H37020815，购自山东仁和堂药业有限公司；琥乙红霉素颗粒，批号为国药准字H6102171，购自西安利君制药有限责任公司。
1.1.2菌株。①临床菌株。致病性大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、肺炎球菌、变形杆菌，由榆林农业学校兽医微生物实验室提供。②质控菌株。大肠埃希氏菌 ATCC25922，购自中国药品生物制品检定所。
1.1.3主要仪器。DS224S电子天平，为德国Sartorius公司产品；SKP02.420电热恒温培养箱，为黄山市恒丰医疗器械有限公司产品。
1.2琥乙红霉素纳米乳的制备
1.2.1油相的确定。将琥乙红霉素溶于油脂中，作为油相部分，测定琥乙红霉素在常用的油相肉豆蔻酸异丙酯（IPM）、肉桂醛、三乙酸甘油酯中的溶解度，选择溶解度最大的作为油相。将乳酸甲氧苄啶加入到蒸馏水中，搅拌使其充分溶解，作为水相。
1.2.2表面活性剂的确定。油相确定后，选择3种常见的非离子型表面活性剂吐温-80、EL-40、RH-40，分别与“1.2.1”中筛选出的油相按质量比9.8∶0.2、9.5∶0.5、9∶1、875∶1.25、8.5∶1.5、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9混匀，边搅拌边逐滴加入水相，直至形成透明、澄清的乳液。记录当体系由黏稠突然变稀时的临界加水相量，并计算体系中各成分的质量分数。分别以表面活性剂、油相、水相作为相图的3个顶点，使用Origin Pro 8.0软件绘制伪三元相图，根据纳米乳区域面积的大小筛选出最佳表面活性剂[5-6]。
1.2.3琥乙红霉素纳米乳的制备。根据上述筛选的油相和表面活性剂，确定琥乙红霉素纳米乳的配方。在室温下，将所述的琥乙红霉素溶于油中，再加入表面活性剂混合均匀，最后一边搅拌一边滴加适量的水相，即可制备出澄清透明的琥乙红霉素纳米乳。
1.3琥乙红霉素纳米乳体外抑菌活性的测定
采用美国国家临床实验标准委员会（NCCLs）制定的微量肉汤稀释法[7]，检测琥乙红霉素纳米乳对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、肺炎球菌、变形杆菌的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌质量浓度（MBC），试验设置琥乙红霉素纳米乳组、琥乙红霉素颗粒组、琥乙红霉素片组。制备各受试抗菌药物溶液质量浓度为2 560 μg/mL，然后进行倍比稀释成一系列浓度梯度，使药物质量浓度为0.25～128.00 μg/mL，过滤除菌后于4 ℃下保存备用。将生长后的菌液用生理盐水校正浓度至0.5麦氏比浊标准，再用营养肉汤培养基稀释浓度成105～106 个/mL，备用。将96孔平底U型微量板在紫外灯灭菌30 min后，在每排第1孔至第10孔按照高浓度至低浓度分别加入受试药液各100 μL，第11孔不添加菌液（只添加200 μL药液）作为药物对照，第12孔只添加200 μL菌液作为菌液对照。分别吸取100 μL稀释好的菌液，加入第1～10孔内。将微孔板置于微型振荡器上振荡1 min，使各孔内溶液混匀，将其置于培养箱内，35～37 ℃下孵育16～20 h后进行观察。肉眼观察各孔，以无细菌生长药液的最低质量浓度为MIC。试验所用质控菌为大肠埃希菌ATCC25922，CLSI推荐的琥乙红霉素的MIC参考值为1～8 μg/mL，只有当琥乙红霉素对质控菌的MIC值处于该范围，才可接受试验结果，否则该批数据作废，找出原因后进行重复试验。将所有完全清晰无细菌生长孔的培养液，分别接种于不含抗菌药物的琼脂平板中，最低药物质量浓度即为该药物的MBC。所有试验至少重复3次。 2结果与分析
2.1琥乙红霉素纳米乳配方的确定及制备
2.1.1
油相的确定。琥乙红霉素在IPM、肉桂醛、三乙酸甘油酯中的溶解度分别为0.05、0.28和0.16 g/mL，考虑到纳米乳的载药量，最后确定油相为肉桂醛。
2.1.2表面活性剂的确定。从图1可以看出，3种表面活性剂形成的纳米乳区域从大到小依序为EL-40、吐温-80、RH-40。因此，选择EL-40作为本体系的表面活性剂。
2.1.3琥乙红霉素纳米乳配方的确定。
琥乙红霉素纳米乳中各组分的质量分数如下：琥乙红霉素2.8%、乳酸甲氧苄啶 0.6%，EL-40 35.2%、肉桂醛7.5%、蒸馏水 53.9%。
2.2琥乙红霉素纳米乳的体外抑菌活性
试验中质控菌株结果稳定，琥乙红霉素对质控菌株的MIC值在CLSI规定的标准范围内，而且菌液对照孔中菌株生长状况良好，说明此次试验结果准确，数据可靠。从表1可以看出，琥乙红霉素纳米乳的体外抑菌效果明显优于琥乙红霉素颗粒和琥乙红霉素片，值得在临床上进行推广应用。
3讨论与结论
纳米乳是一种极具开发前途的新型药物载体，近年来已在生物医药、食品、日用化工、有机合成等领域开展了广泛的研究应用。纳米乳作为药物载体，具有其他药物载体所无法比拟的优点[8-9]：①稳定性好；②能提高药物的载药量；③大大促进在体内的吸收[10]；④具有缓释和靶向作用[11]；⑤给药途径多样。纳米乳配方设计要求严格，不仅要求能够在较大配方范围内形成稳定的纳米乳，而且要符合纳米乳作为药物载体的特殊要求，如无毒、无刺激、无不良作用，具有良好的生物相容性。同时，要求纳米乳既能够增加药物的溶解能力，又不能影响药物的药效和稳定性。
为了提高药物在油相中溶解度，增大纳米乳形成区域，应尽可能选择溶解度大且无毒无刺激的短链油相，笔者通过筛选发现琥乙红霉素在肉桂醛中的溶解度最大；在选择表面活性剂时，通过绘制伪三元相图发现EL-40作为表面活性剂时形成的乳区最大；经过筛选确定的琥乙红霉素纳米乳各组分的质量分数为：琥乙红霉素2.8%、乳酸甲氧苄啶 06%，EL-40 35.2%、肉桂醛7.5%、蒸馏水 53.9%。
该研究不仅成功研制了琥乙红霉素纳米乳，并对其体外抑菌活性进行了研究，结果表明琥乙红霉素纳米乳对致病性大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、肺炎球菌和变形杆菌的最小抑菌浓度（MIC）分别为4、1、2和4 μg/mL，其抑菌效果明显优于琥乙红霉素颗粒和琥乙红霉素片组。究其原因，可能是因为琥乙红霉素纳米乳粒径很小，特别容易附着在细菌上，具有很强的穿透力，能够更好地穿过细菌的细胞壁从而起到杀菌作用；此外，纳米乳制剂发挥了一定的缓释作用，从而延长了药物的有效杀菌浓度和时间，增强了杀菌效果[12]，因此值得进行进一步研究和在临床上推广应用。
参考文献
[1] 储小曼，刘敏，周燕，等.琥乙红霉素咀嚼片的相对生物利用度研究[J].中国临床药理学杂志，2000（3）：195-197.
[2] 乔海灵，张莉蓉，贾琳静，等.琥乙红霉素的健康人体药代动力学研究[J].中国抗生素杂志，1998（4）：300-302.
[3] 奉建芳.我国纳米给药系统的研究与应用[J].中南药学，2004，2（1）：29-33.
[4] 陆彬.药物新剂型与新技术[M].北京：人民卫生出版社，2005：74-76.
[5] 陆彬，张正全.用三角相图法研究药用微乳的形成条件[J].药学学报，2001，36（1）：58-62.
[6] ZHU W W，YU A H，WANG W H，et al.Formulation design of microemulsion for dermal delivery of penciclovir[J].International journal of pharmaceutics，2008，360（1/2）：184-190.
[7] National Committee for Clinical Laboratory Standards.Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically[M].6th ed.NCCLS，Wayne，PA，USA：Approved standard M7-A6，2003.
[8] LAWRENCE M J，REES G D.Microemulsion-based media as novel drug delivery system [J].Advanced drug delivery reviews，2000，45（1）：89-121.
[9] GHOSH P K，MURTHY R S R.Microemulsions：A potential drug delivery system[J].Current drug delivery，2006，3（2）：167-180.
[10] 何欣，欧阳五庆，赵兴华，等.纳米乳对雷公藤多苷增效减毒作用研究[J].浙江大学学报（农业与生命科学版），2008，34（3）：261-265.
[11] 朱晓亮，李国锋，陈志良，等.纳米乳的皮肤刺激性研究[J].中国医药工业杂志，2007，38（2）：105-108.
[12] 刘丽芳，张阳德，伍参荣.矾冰纳米乳对临床常见病原菌体外抗菌活性的研究[J].微生物学杂志，2010（5）：25-28.
关键词头孢克肟；纳米乳；伪三元相图；最小抑菌浓度
中图分类号S859.5+3文献标识码A文章编号0517-6611（2016）13-183-03
琥乙红霉素，英文名 Erythromycin，属于大环内酯类抗生素，为红霉素的琥珀酸乙酯，在胃酸中较红霉素稳定。对葡萄球菌属（ 耐甲氧西林菌株除外 ）、各组链球菌和革兰阳性杆菌均具有抗菌活性。奈瑟菌属、流感嗜血杆菌和百日咳鲍特氏菌等也对本品敏感[1]。本品对除脆弱拟杆菌和梭杆菌属以外的各种厌氧菌亦具有抗菌作用，对军团菌属、胎儿弯曲菌、某些螺旋体、肺炎支原体、立克次体属和衣原体属也有抑制作用。本品可透过细菌细胞膜，在接近供位（P 位）与细菌核糖体的 50S 亚基形成可逆性结合，阻断转移核糖核酸（t-RNA）结合至 “P” 位上，同时也阻断多肽链自受位（“A” 位）至 “P” 位的位移，从而抑制细菌的蛋白质合成[2]。本品为含矫味剂的颗粒，味甜而芳香。乳酸甲氧苄啶是许多抗生素通用的增效剂，与琥乙红霉素合用时能大大提高其抗菌活性。
纳米乳（Nanoemulsion）也称为微乳（Microemulsion），粒径一般为1～100 nm，是由油相、水相和表面活性剂按适当比例混合而成的一种透明或半透明、低黏度的动力学和热力学稳定体系[3]。纳米乳作为药物载体，具有以下优点：提高难溶性药物的溶解度，增强不稳定药物的稳定性，黏度低、粒径小且均匀，使被包容的药物分散度提高，具有缓释和靶向作用，促进药物在体内的吸收，提高其生物利用度，降低其毒副作用[4]。
笔者根据琥乙红霉素的理化性质将其制成纳米乳，并考察其体外抑菌效果，以期为该纳米乳药物在人类和兽医临床上的应用提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1主要试剂和药品。琥乙红霉素，购自湖北恒硕化工有限公司，纯度99%；肉桂醛，购自武汉远成共创科技有限公司；肉豆蔻酸异丙酯，购自国药集团化学试剂有限公司；三乙酸甘油酯，购自国药集团化学试剂有限公司；吐温-80、EL-40、RH-40均为化学纯，购自天津市恒兴化学试剂制造有限公司；琥乙红霉素片，批号为国药准字H37020815，购自山东仁和堂药业有限公司；琥乙红霉素颗粒，批号为国药准字H6102171，购自西安利君制药有限责任公司。
1.1.2菌株。①临床菌株。致病性大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、肺炎球菌、变形杆菌，由榆林农业学校兽医微生物实验室提供。②质控菌株。大肠埃希氏菌 ATCC25922，购自中国药品生物制品检定所。
1.1.3主要仪器。DS224S电子天平，为德国Sartorius公司产品；SKP02.420电热恒温培养箱，为黄山市恒丰医疗器械有限公司产品。
1.2琥乙红霉素纳米乳的制备
1.2.1油相的确定。将琥乙红霉素溶于油脂中，作为油相部分，测定琥乙红霉素在常用的油相肉豆蔻酸异丙酯（IPM）、肉桂醛、三乙酸甘油酯中的溶解度，选择溶解度最大的作为油相。将乳酸甲氧苄啶加入到蒸馏水中，搅拌使其充分溶解，作为水相。
1.2.2表面活性剂的确定。油相确定后，选择3种常见的非离子型表面活性剂吐温-80、EL-40、RH-40，分别与“1.2.1”中筛选出的油相按质量比9.8∶0.2、9.5∶0.5、9∶1、875∶1.25、8.5∶1.5、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9混匀，边搅拌边逐滴加入水相，直至形成透明、澄清的乳液。记录当体系由黏稠突然变稀时的临界加水相量，并计算体系中各成分的质量分数。分别以表面活性剂、油相、水相作为相图的3个顶点，使用Origin Pro 8.0软件绘制伪三元相图，根据纳米乳区域面积的大小筛选出最佳表面活性剂[5-6]。
1.2.3琥乙红霉素纳米乳的制备。根据上述筛选的油相和表面活性剂，确定琥乙红霉素纳米乳的配方。在室温下，将所述的琥乙红霉素溶于油中，再加入表面活性剂混合均匀，最后一边搅拌一边滴加适量的水相，即可制备出澄清透明的琥乙红霉素纳米乳。
1.3琥乙红霉素纳米乳体外抑菌活性的测定
采用美国国家临床实验标准委员会（NCCLs）制定的微量肉汤稀释法[7]，检测琥乙红霉素纳米乳对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、肺炎球菌、变形杆菌的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌质量浓度（MBC），试验设置琥乙红霉素纳米乳组、琥乙红霉素颗粒组、琥乙红霉素片组。制备各受试抗菌药物溶液质量浓度为2 560 μg/mL，然后进行倍比稀释成一系列浓度梯度，使药物质量浓度为0.25～128.00 μg/mL，过滤除菌后于4 ℃下保存备用。将生长后的菌液用生理盐水校正浓度至0.5麦氏比浊标准，再用营养肉汤培养基稀释浓度成105～106 个/mL，备用。将96孔平底U型微量板在紫外灯灭菌30 min后，在每排第1孔至第10孔按照高浓度至低浓度分别加入受试药液各100 μL，第11孔不添加菌液（只添加200 μL药液）作为药物对照，第12孔只添加200 μL菌液作为菌液对照。分别吸取100 μL稀释好的菌液，加入第1～10孔内。将微孔板置于微型振荡器上振荡1 min，使各孔内溶液混匀，将其置于培养箱内，35～37 ℃下孵育16～20 h后进行观察。肉眼观察各孔，以无细菌生长药液的最低质量浓度为MIC。试验所用质控菌为大肠埃希菌ATCC25922，CLSI推荐的琥乙红霉素的MIC参考值为1～8 μg/mL，只有当琥乙红霉素对质控菌的MIC值处于该范围，才可接受试验结果，否则该批数据作废，找出原因后进行重复试验。将所有完全清晰无细菌生长孔的培养液，分别接种于不含抗菌药物的琼脂平板中，最低药物质量浓度即为该药物的MBC。所有试验至少重复3次。 2结果与分析
2.1琥乙红霉素纳米乳配方的确定及制备
2.1.1
油相的确定。琥乙红霉素在IPM、肉桂醛、三乙酸甘油酯中的溶解度分别为0.05、0.28和0.16 g/mL，考虑到纳米乳的载药量，最后确定油相为肉桂醛。
2.1.2表面活性剂的确定。从图1可以看出，3种表面活性剂形成的纳米乳区域从大到小依序为EL-40、吐温-80、RH-40。因此，选择EL-40作为本体系的表面活性剂。
2.1.3琥乙红霉素纳米乳配方的确定。
琥乙红霉素纳米乳中各组分的质量分数如下：琥乙红霉素2.8%、乳酸甲氧苄啶 0.6%，EL-40 35.2%、肉桂醛7.5%、蒸馏水 53.9%。
2.2琥乙红霉素纳米乳的体外抑菌活性
试验中质控菌株结果稳定，琥乙红霉素对质控菌株的MIC值在CLSI规定的标准范围内，而且菌液对照孔中菌株生长状况良好，说明此次试验结果准确，数据可靠。从表1可以看出，琥乙红霉素纳米乳的体外抑菌效果明显优于琥乙红霉素颗粒和琥乙红霉素片，值得在临床上进行推广应用。
3讨论与结论
纳米乳是一种极具开发前途的新型药物载体，近年来已在生物医药、食品、日用化工、有机合成等领域开展了广泛的研究应用。纳米乳作为药物载体，具有其他药物载体所无法比拟的优点[8-9]：①稳定性好；②能提高药物的载药量；③大大促进在体内的吸收[10]；④具有缓释和靶向作用[11]；⑤给药途径多样。纳米乳配方设计要求严格，不仅要求能够在较大配方范围内形成稳定的纳米乳，而且要符合纳米乳作为药物载体的特殊要求，如无毒、无刺激、无不良作用，具有良好的生物相容性。同时，要求纳米乳既能够增加药物的溶解能力，又不能影响药物的药效和稳定性。
为了提高药物在油相中溶解度，增大纳米乳形成区域，应尽可能选择溶解度大且无毒无刺激的短链油相，笔者通过筛选发现琥乙红霉素在肉桂醛中的溶解度最大；在选择表面活性剂时，通过绘制伪三元相图发现EL-40作为表面活性剂时形成的乳区最大；经过筛选确定的琥乙红霉素纳米乳各组分的质量分数为：琥乙红霉素2.8%、乳酸甲氧苄啶 06%，EL-40 35.2%、肉桂醛7.5%、蒸馏水 53.9%。
该研究不仅成功研制了琥乙红霉素纳米乳，并对其体外抑菌活性进行了研究，结果表明琥乙红霉素纳米乳对致病性大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、肺炎球菌和变形杆菌的最小抑菌浓度（MIC）分别为4、1、2和4 μg/mL，其抑菌效果明显优于琥乙红霉素颗粒和琥乙红霉素片组。究其原因，可能是因为琥乙红霉素纳米乳粒径很小，特别容易附着在细菌上，具有很强的穿透力，能够更好地穿过细菌的细胞壁从而起到杀菌作用；此外，纳米乳制剂发挥了一定的缓释作用，从而延长了药物的有效杀菌浓度和时间，增强了杀菌效果[12]，因此值得进行进一步研究和在临床上推广应用。
参考文献
[1] 储小曼，刘敏，周燕，等.琥乙红霉素咀嚼片的相对生物利用度研究[J].中国临床药理学杂志，2000（3）：195-197.
[2] 乔海灵，张莉蓉，贾琳静，等.琥乙红霉素的健康人体药代动力学研究[J].中国抗生素杂志，1998（4）：300-302.
[3] 奉建芳.我国纳米给药系统的研究与应用[J].中南药学，2004，2（1）：29-33.
[4] 陆彬.药物新剂型与新技术[M].北京：人民卫生出版社，2005：74-76.
[5] 陆彬，张正全.用三角相图法研究药用微乳的形成条件[J].药学学报，2001，36（1）：58-62.
[6] ZHU W W，YU A H，WANG W H，et al.Formulation design of microemulsion for dermal delivery of penciclovir[J].International journal of pharmaceutics，2008，360（1/2）：184-190.
[7] National Committee for Clinical Laboratory Standards.Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically[M].6th ed.NCCLS，Wayne，PA，USA：Approved standard M7-A6，2003.
[8] LAWRENCE M J，REES G D.Microemulsion-based media as novel drug delivery system [J].Advanced drug delivery reviews，2000，45（1）：89-121.
[9] GHOSH P K，MURTHY R S R.Microemulsions：A potential drug delivery system[J].Current drug delivery，2006，3（2）：167-180.
[10] 何欣，欧阳五庆，赵兴华，等.纳米乳对雷公藤多苷增效减毒作用研究[J].浙江大学学报（农业与生命科学版），2008，34（3）：261-265.
[11] 朱晓亮，李国锋，陈志良，等.纳米乳的皮肤刺激性研究[J].中国医药工业杂志，2007，38（2）：105-108.
[12] 刘丽芳，张阳德，伍参荣.矾冰纳米乳对临床常见病原菌体外抗菌活性的研究[J].微生物学杂志，2010（5）：25-28.