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[摘要] 目的 研究直腸癌的不同病理分型、分化程度、肿瘤分期、预后与前体mRNA剪辑蛋白-2β基因（Trα-2β）之间的关系，分析其在直肠癌发生发展中的作用。 方法 选择未进行过放化疗的直肠癌患者，术中切除肿瘤与周围正常肠管，通过PCR法比较Trα-2β基因在直肠癌组织中与癌旁正常组织中的差异，比较不同的直肠癌病理分型、分化程度、肿瘤分期中此基因是否有差异，并作统计学分析。 结果 Trα-2β表达水平在直肠癌组织中较癌旁正常组织明显增高（P<0.05）；Ⅰ期直肠癌Trα-2β的转录水平明显较Ⅱ期直肠癌低（P=0.0006）；而Ⅱ、Ⅲ期之间Trα-2β的转录水平无明显差异（P=0.2725）；Ⅱ期与Ⅳ期间（P=0.3912）、Ⅲ期与Ⅳ期间Trα-2β的转录水平均无明显差异（P=0.1697）；Trα-2β的转录水平与直肠癌的高、中、低分化程度有关，各个分化程度间均有差异（P=0.0006）；Trα-2β的转录水平与直肠癌的病理分型无关（P=0.2254）。 结论 直肠组织中Trα-2β的表达水平升高提示倾向于恶性肿瘤，或者恶性程度更高，对直肠癌的预后有一定的临床指导意义。
[关键词] 直肠癌；病理分型；TNM分期；前体mRNA剪辑蛋白-2β基因
[中图分类号] R735.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）33-0031-04
[Abstract] Objective To study the relationship between different pathological types， differentiation degree， tumor staging，prognosis and the precursory mRNA clipping protein-2β gene（Trα-2β） in rectal cancer， and to analyze its role in the development and progression of rectal cancer. Methods The patients with rectal cancer who had not undergone radiotherapy and chemotherapy were selected. And the tumor and surrounding normal bowel were resected during surgery. The difference of Trα-2β gene in rectal cancer tissues and adjacent normal tissues was compared by PCR. The differences of the gene in pathological type， differentiation degree， tumor staging in different rectal cancers were compared. And the statistical analysis was performed. Results The expression level of Trα-2β in rectal cancer tissues was significantly higher than that in adjacent normal tissues（P<0.05）. The transcriptional level of Trα-2β in stage Ⅰrectal cancer was significantly lower than that in stage Ⅱ rectal cancer（P=0.0006）. There was no significant difference in the transcription level of Trα-2β between stage Ⅱand stage Ⅲ（P=0.2725）. There was no significant difference in the transcription level of Trα-2β between stage Ⅱand Ⅳ（P=0.3912） and between the stage Ⅲ and Ⅳ（P=0.1697）. The transcription level of Trα-2β was correlated with the high， medium and low differentiation degree of rectal cancer， and there was significant difference in the different differentiation degrees （P=0.0006）. The transcription level of Trα-2β was not correlated with the pathological type of rectal cancer（P=0.2254）. Conclusion Elevated expression of Trα-2β in rectal tissue suggests a tendency to malignant tumor or a higher degree of malignancy， which may be of clinical guidance significance in the prognosis of rectal cancer.
[Key words] Rectal cancer；Pathological type；TNM stage；Precursor mRNA clipping protein-2β gene Trα-2β是一种前体mRNA剪接蛋白亚型，是一个富含丝氨酸/精氨酸样的蛋白，参与前体mRNA的选择性切割[1]。其分为Trα-2β1、2、3、4、5五种亚型和Tra-2α，在人体全身各处均有表达，但其各亚型的表达在机体发育的各个阶段和不同的组织中受到不同的调控。有些文献[2-4]报道，Trα-2β参与多种生理、病理过程，包括平滑肌细胞的增殖、神经前体的存活等。此外，其还被报道参与肿瘤的发生发展过程，不同的器官组织和发育阶段，机体对不同的Trα-2β蛋白选择性剪接功能有着不同的需求[5]。最近的研究发现，Trα-2β所作用的基因位點的改变，如MDM2、Bin1、FGFR-2等，已经在乳腺癌、皮肤癌、前列腺癌中被发现[6]。而这些基因所转录的蛋白，如HER2/neu（c-erbB2）、ER、PR及EGFR等都已被证实在肿瘤的发生和转移中起到重要的作用，是重要的临床预后指标[7]。现今国内外仅见Trα-2β基因在胃肠道肿瘤的相关性分析，Trα-2β与其下游的结直肠癌细胞侵袭性表位基因的关系却未见相关性报道[8，9]，Trα-2β在侵袭性直肠癌血管与正常血管间的比较也未见报道。故本文从结直肠癌中Trα-2β基因为入手点，观察其mRNA与所表达的蛋白在直肠腺癌和正常组织间有何差异，找到该基因的表达与直肠腺癌的分期和术后生存期的相关性，旨在探讨它们在直肠癌进展中的作用及其潜在的临床应用价值。
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集2015年1月～2017年4月来湖州市第一人民医院手术且未进行过放化疗的直肠癌患者，术前病理确诊为原发性直肠癌，且经肠镜、CT、MRI或PET-CT术前检查，确诊TNM分期为Ⅰ～Ⅳ期的直肠癌患者共103例，取其病灶、病灶周围组织、周围淋巴结标本。其中男78例，女25例；年龄37～81岁，平均（62.5±3.5）岁；乳头状腺癌67例、管状腺癌35例、黏液腺癌1例；低位直肠癌（肿瘤下缘距齿状线5 cm以内）19例，高位直肠癌（肿瘤下缘距齿状线5 cm以上）84例；Ⅰ期18例、Ⅱ期38例、ⅢA期41例、ⅢB～Ⅳ期6例。本试验通过医院伦理委员会批准，采取标本及进行试验前与患者签订知情选择同意书。
1.2 主要试剂
RNA提取液（TRIzol reagent，美国Invitrogen Life Technologies公司），逆转录试剂盒（Reverse-transcription 试剂盒，日本TOYOBO公司），Real-Time PCR（SYBR Green试剂盒，日本TOYOBO公司）。DEPC水购自上海生工生物工程股份有限公司。Trα-2β 引物序列上游5’-AGTAAAGACTGGGTTTCACCATGTTGGCCAGG-3’，下游5’-GACTCCTGGCTGCTGTCG CCGGT CGAT-3’；人β-actin引物序列上游5’-CAGGGCGTGATGGTGGGCA-3’，下游：5’-CAAACATCATCTGGGTCATCTTCTC-3’（由上海生工生物工程股份有限公司合成）。
1.3 试验器材
-80℃冰箱Thermo Scientific Forma Sreies900购自赛默飞世尔科技有限公司，超净工作台购自安泰科技股份有限公司，微量移液器、低温高速离心机购自德国Eppendorf公司，高温高压灭菌锅购自上海博讯实业有限公司医疗设备厂，纯水仪购自Millipore公司，S1000 ThermalCycler PCR仪、Master Cycler PCR仪、凝胶成像分析系统、DNA电泳仪均购自美国BIO-RAD公司，核酸蛋白分析仪购自Beckman公司，电子天秤购自上海上天公司，多功能纯水系统购自锐思捷科学仪器有限公司。
1.4实验方法
移液器枪头及存储RNA、DNA的EP管均为一次性去酶物品。
1.4.1 RNA的提取 ①匀浆：取1.5 mL无酶EP管，每管加入0.4 mL Trizol液，再称取50 mg组织放入其中，研磨至悬浊液，再加入0.6 mL Trizol液，混匀。②两相分离：匀浆后样品室温静置10 min，每1mL Trizol试剂匀浆样品中加入0.2 mL的氯仿，盖紧管盖。震荡15 s，待充分乳化呈乳白色且无分层现象后，室温放置5 min，4℃下12000 rpm离心15 min，使得样品分为3层：底层粉红有机相，中间白色蛋白质相，上层透明水相，RNA主要在水相中。③RNA沉淀：小心吸取上层无色透明水相600 μL至新的无酶EP管中，加入等体积的异丙醇，混匀。-20℃放置2 h以上，4℃离心机中12000 rpm离心20 min，离心后在管侧和管底出现白色沉淀，小心弃去上清，缓缓沿离心管壁加入预冷为4℃的80%乙醇1 mL。4℃ 8000 rpm离心5 min。小心弃掉乙醇后，4℃，7500 rpm离心30 s，微量移液器吸尽残余乙醇，保留沉淀。④溶解RNA沉淀：室温放置约5～10 min至干（不可全干），即可加入20 μL DEPC水溶解沉淀，并用微量移液器轻轻吹打至完全溶解。⑤RNA的浓度和纯度鉴定：每次取1 μL DEPC水洗净核酸蛋白分析仪测量孔，设置为RNA模式，调零。取1 μL RNA溶液置于测量孔中，记录样品名称后测量，OD260/OD280在1.8～2.2范围为合格标本，可用于后续试验。结果导出为EXCEL文档。⑥RNA完整性的鉴定：将RNA提取液5 μL 与上样缓冲液1 μL混合，1%琼脂糖凝胶，150V，40 mA，电泳20 min，凝胶成像系统观察结果。所有用于后续RNA分析的RNA标本均显示28S、18S两条带，28S：18S的亮度比约1.5～2.0倍，说明RNA没有降解，有较好的完整性。提取的RNA保存于-80℃超低温冰箱中，或立即用于逆转录。
1.4.2 RNA的逆转录（逆转录试剂盒） ①根据所测得的RNA浓度，把所有样本全部稀释至1000 ng/μL。②预变性：在无酶的200 μL EP管中加入RNA 1 μg（即1 μL），用RNase free水补足到14 μL。PCR仪设定为65℃ 5 min，所有过程全部在冰上完成。③拿出后每管中加入Primer Mix 1 μL、Enzyme Mix 1 μL、5×Buffer 4 μL，得到20 μL反应体系。PCR仪设定为37℃ 1 h，98℃ 5 min。-20℃保存。 1.4.3 RNA的检测 把逆转录所得的1000 ng/μL的cDNA1 μL加入100 μL的Ep管中，再加入SYBR Green试剂盒中的DNA转录酶（2×Taq酶Mix）10 μL及超纯水12.8 μL，再加入上海生工生物工程股份有限公司合成的Trα-2β和人β-actin引物，进行PCR试验（表1）。所有EP管中的试剂均在PCR仪中反应，95℃反应5 min，95℃反应30s，61℃反应30 s，72℃反应1 min，72℃再反应5 min，再返回步骤2，步骤2～5再循环34次后12℃保存（表2）。
1.5结果阅读
使用凝胶成像分析系统紫外透射分析扫描各条带的光密度，以Trα-2β的光密度值与β-actin基因的光密度值之比为相互间进行比较的参数。以癌旁正常组织参数的平均值为标准，未出现条带为基因缺失。用去离子水做为阴性对照。使用Quantity-One软件，计算各个样本Trα-2β的转录水平，各个组织中Trα-2β的相对值=目的扩增条带的灰度值/β-actin基因扩增条带的灰度值。
1.6统计学方法
实验数据采用SPSS 20.0统计学软件进行统计分析，计数资料进行χ2检验；P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
通过Quantity-One软件比较发现：直肠癌中Trα-2β的转录水平比癌旁正常组织明显增高（P<0.05）；Ⅰ期直肠癌Trα-2β的转录水平明显较Ⅱ期直肠癌低（P=0.0006）；而Ⅱ、Ⅲ期之间Trα-2β的转录水平无明显差异（P=0.2725）；Ⅱ期与Ⅳ期间（P=0.3912）、Ⅲ期与Ⅳ期间（P=0.1697）Trα-2β的转录水平均无明显差异；Trα-2β的转录水平与肿瘤的分化程度（低分化、中分化、高分化）有关，低分化与中分化比较（P=0.0182），中分化与高分化比较（P=0.0193），低分化与高分化比较（P=0.0002），每种分化程度间表达均有差异（P=0.0006）；Trα-2β的转录水平与肿瘤的病理分型（腺癌、鳞癌、未分化癌等）无关（P=0.6305）；转移淋巴结与未转移淋巴结Trα-2β的转录水平无统计学差异（P=0.2254）。见表3。
3讨论
在生物学上，选择性前体mRNA剪接对于蛋白多样性是一个不可或缺的因素，人体大部分转录物都会被选择性调控。研究证实，人类基因组共包含31 000到39 000左右个基因，但是人体内的蛋白种类、数量远远多于此，已知的可能原因主要还是选择性剪接的多样性[9]。在人类中，人体的大脑呈现出最高水平的选择性剪接过程，实验证明在大脑中有数目最多的占位外显子[10]，其次是肝脏、睾丸等器官[11]。研究表明，90%的基因经历了选择性剪接，超过50%的疾病突变要作用于前体mRNA选择性剪接过程[12]，Trα-2β无论是在生理方面还是在病理过程中都发挥着许多重要作用。Hierarchy学说发现肿瘤细胞株内有极少数具有无限增殖能力的细胞，被称为“肿瘤中的干细胞”，它是肿瘤增大、转移、复发及耐药的来源，而选择性前体mRNA剪辑蛋白或许是其中不可或缺的一环[13]。德国弗莱堡大学的Dirk O. Watermann在乳腺癌的研究中发现Trα-2β可调控肿瘤表位的表达，其作用机制为Trα-2β可调节CD44基因的可变外显子剪接位点（v4-v6段），而此段外显子基因又证明与乳腺癌的发生与转移有关[14]。Shukla S等[15]还发现Trα-2β基因亚型在血管的快、慢收缩平滑肌中，表达量存在明显差异，现今国内外仅见Trα-2β基因与结肠癌的相关性分析，Trα-2β与其下游的结直肠癌细胞侵袭性表位基因的关系却未见相关性报道[16，17]，Trα-2β在侵袭性直肠癌血管与正常血管间的比较也未见报道。而在子宫内膜癌中，Trα-2β1的蛋白表达水平上调，并且统计学分析表明，在低分化的病例中，Trα-2β的核表达水平较高，Trα-2β1甚至可以作为一个独立的预后的指标[18]。
Best A等[19]研究发现，Trα-2β参与肿瘤的发病机制可能通过以下三条途径。第一，通过Trα-2β与NASP（细胞核自身抗原精子蛋白）的tNASP（睾丸型）的外显子特异性结合。通过 NASP转运参与核小体的形成，当NASP表达不充分时，将会使DNA的复制停止并且细胞分裂停止。第二，通过选择性剪接肿瘤细胞CD44前体RNA的特异性调节，影响肿瘤进展和转移[20，21]。第三，在肿瘤细胞中，HIPK3基因的转录调控和凋亡调控。Trα-2β有可能主要通过参与HIPK3-T的选择性剪接，进而影响肿瘤的进展。已有研究表明，结肠癌HTC116细胞中Trα-2β过表达，通过沉默Trα-2β基因，发现结肠癌细胞可以胱天蛋白酶依赖方式凋亡[22]。
本次研究主要探讨Trα-2β在直肠癌组织与周围正常组织中的转录情况，比较了该基因与肿瘤分期、病理分型、分化程度之间的关联。前期研究发现在肿瘤组织中Trα-2β的转录显著高于其癌旁非肿瘤组织；另外，Trα-2β的转录与直肠癌的分期具有一定相关性，但此次可能因样本量过小，在Ⅰ期与其他几期有差异，Ⅱ期与Ⅳ期间可见差异，Ⅲ期与Ⅳ期间存在差异，而在Ⅱ、Ⅲ期间未发现有统计学差异，也未找到Trα-2β在不同病理类型的直肠癌组织中的差异。尽管试验结果未能与其他肿瘤的研究结果保持高度一致，但考虑到本实验研究样本量太少，结果出现一定偏差也在合理范围内，有待后续加大样本量来进行深入研究。但通过此试验结果趋势，我们仍不难发现，Trα-2β在直肠癌中主要调节细胞增殖与凋亡作用，其表达上调提示預后不佳，而Trα-2β转录量减少或缺失可以影响肿瘤的进程。本课题研究希望通过后续大量Realtime qPCR试验做出关于直肠癌Trα-2β的标准曲线，通过门诊或病房直肠镜下活检测定基因来预测患者直肠癌TNM分期、分化程度。但Trα-2β在直肠癌中发挥的促进肿瘤细胞增殖或抑制凋亡的作用是如何实现的，有待进一步的研究来阐明。 [參考文献]
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[17] Kajita K，Kuwano Y，Kitamura N， et al. Ets1 and heat shock factor 1 regulate transcription of the Transformer 2β gene in human colon cancer cells[J]. Journal of Gastroenterology，2013，48（11）：1222-1233.
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（收稿日期：2017-09-06）
[关键词] 直肠癌；病理分型；TNM分期；前体mRNA剪辑蛋白-2β基因
[中图分类号] R735.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）33-0031-04
[Abstract] Objective To study the relationship between different pathological types， differentiation degree， tumor staging，prognosis and the precursory mRNA clipping protein-2β gene（Trα-2β） in rectal cancer， and to analyze its role in the development and progression of rectal cancer. Methods The patients with rectal cancer who had not undergone radiotherapy and chemotherapy were selected. And the tumor and surrounding normal bowel were resected during surgery. The difference of Trα-2β gene in rectal cancer tissues and adjacent normal tissues was compared by PCR. The differences of the gene in pathological type， differentiation degree， tumor staging in different rectal cancers were compared. And the statistical analysis was performed. Results The expression level of Trα-2β in rectal cancer tissues was significantly higher than that in adjacent normal tissues（P<0.05）. The transcriptional level of Trα-2β in stage Ⅰrectal cancer was significantly lower than that in stage Ⅱ rectal cancer（P=0.0006）. There was no significant difference in the transcription level of Trα-2β between stage Ⅱand stage Ⅲ（P=0.2725）. There was no significant difference in the transcription level of Trα-2β between stage Ⅱand Ⅳ（P=0.3912） and between the stage Ⅲ and Ⅳ（P=0.1697）. The transcription level of Trα-2β was correlated with the high， medium and low differentiation degree of rectal cancer， and there was significant difference in the different differentiation degrees （P=0.0006）. The transcription level of Trα-2β was not correlated with the pathological type of rectal cancer（P=0.2254）. Conclusion Elevated expression of Trα-2β in rectal tissue suggests a tendency to malignant tumor or a higher degree of malignancy， which may be of clinical guidance significance in the prognosis of rectal cancer.
[Key words] Rectal cancer；Pathological type；TNM stage；Precursor mRNA clipping protein-2β gene Trα-2β是一种前体mRNA剪接蛋白亚型，是一个富含丝氨酸/精氨酸样的蛋白，参与前体mRNA的选择性切割[1]。其分为Trα-2β1、2、3、4、5五种亚型和Tra-2α，在人体全身各处均有表达，但其各亚型的表达在机体发育的各个阶段和不同的组织中受到不同的调控。有些文献[2-4]报道，Trα-2β参与多种生理、病理过程，包括平滑肌细胞的增殖、神经前体的存活等。此外，其还被报道参与肿瘤的发生发展过程，不同的器官组织和发育阶段，机体对不同的Trα-2β蛋白选择性剪接功能有着不同的需求[5]。最近的研究发现，Trα-2β所作用的基因位點的改变，如MDM2、Bin1、FGFR-2等，已经在乳腺癌、皮肤癌、前列腺癌中被发现[6]。而这些基因所转录的蛋白，如HER2/neu（c-erbB2）、ER、PR及EGFR等都已被证实在肿瘤的发生和转移中起到重要的作用，是重要的临床预后指标[7]。现今国内外仅见Trα-2β基因在胃肠道肿瘤的相关性分析，Trα-2β与其下游的结直肠癌细胞侵袭性表位基因的关系却未见相关性报道[8，9]，Trα-2β在侵袭性直肠癌血管与正常血管间的比较也未见报道。故本文从结直肠癌中Trα-2β基因为入手点，观察其mRNA与所表达的蛋白在直肠腺癌和正常组织间有何差异，找到该基因的表达与直肠腺癌的分期和术后生存期的相关性，旨在探讨它们在直肠癌进展中的作用及其潜在的临床应用价值。
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集2015年1月～2017年4月来湖州市第一人民医院手术且未进行过放化疗的直肠癌患者，术前病理确诊为原发性直肠癌，且经肠镜、CT、MRI或PET-CT术前检查，确诊TNM分期为Ⅰ～Ⅳ期的直肠癌患者共103例，取其病灶、病灶周围组织、周围淋巴结标本。其中男78例，女25例；年龄37～81岁，平均（62.5±3.5）岁；乳头状腺癌67例、管状腺癌35例、黏液腺癌1例；低位直肠癌（肿瘤下缘距齿状线5 cm以内）19例，高位直肠癌（肿瘤下缘距齿状线5 cm以上）84例；Ⅰ期18例、Ⅱ期38例、ⅢA期41例、ⅢB～Ⅳ期6例。本试验通过医院伦理委员会批准，采取标本及进行试验前与患者签订知情选择同意书。
1.2 主要试剂
RNA提取液（TRIzol reagent，美国Invitrogen Life Technologies公司），逆转录试剂盒（Reverse-transcription 试剂盒，日本TOYOBO公司），Real-Time PCR（SYBR Green试剂盒，日本TOYOBO公司）。DEPC水购自上海生工生物工程股份有限公司。Trα-2β 引物序列上游5’-AGTAAAGACTGGGTTTCACCATGTTGGCCAGG-3’，下游5’-GACTCCTGGCTGCTGTCG CCGGT CGAT-3’；人β-actin引物序列上游5’-CAGGGCGTGATGGTGGGCA-3’，下游：5’-CAAACATCATCTGGGTCATCTTCTC-3’（由上海生工生物工程股份有限公司合成）。
1.3 试验器材
-80℃冰箱Thermo Scientific Forma Sreies900购自赛默飞世尔科技有限公司，超净工作台购自安泰科技股份有限公司，微量移液器、低温高速离心机购自德国Eppendorf公司，高温高压灭菌锅购自上海博讯实业有限公司医疗设备厂，纯水仪购自Millipore公司，S1000 ThermalCycler PCR仪、Master Cycler PCR仪、凝胶成像分析系统、DNA电泳仪均购自美国BIO-RAD公司，核酸蛋白分析仪购自Beckman公司，电子天秤购自上海上天公司，多功能纯水系统购自锐思捷科学仪器有限公司。
1.4实验方法
移液器枪头及存储RNA、DNA的EP管均为一次性去酶物品。
1.4.1 RNA的提取 ①匀浆：取1.5 mL无酶EP管，每管加入0.4 mL Trizol液，再称取50 mg组织放入其中，研磨至悬浊液，再加入0.6 mL Trizol液，混匀。②两相分离：匀浆后样品室温静置10 min，每1mL Trizol试剂匀浆样品中加入0.2 mL的氯仿，盖紧管盖。震荡15 s，待充分乳化呈乳白色且无分层现象后，室温放置5 min，4℃下12000 rpm离心15 min，使得样品分为3层：底层粉红有机相，中间白色蛋白质相，上层透明水相，RNA主要在水相中。③RNA沉淀：小心吸取上层无色透明水相600 μL至新的无酶EP管中，加入等体积的异丙醇，混匀。-20℃放置2 h以上，4℃离心机中12000 rpm离心20 min，离心后在管侧和管底出现白色沉淀，小心弃去上清，缓缓沿离心管壁加入预冷为4℃的80%乙醇1 mL。4℃ 8000 rpm离心5 min。小心弃掉乙醇后，4℃，7500 rpm离心30 s，微量移液器吸尽残余乙醇，保留沉淀。④溶解RNA沉淀：室温放置约5～10 min至干（不可全干），即可加入20 μL DEPC水溶解沉淀，并用微量移液器轻轻吹打至完全溶解。⑤RNA的浓度和纯度鉴定：每次取1 μL DEPC水洗净核酸蛋白分析仪测量孔，设置为RNA模式，调零。取1 μL RNA溶液置于测量孔中，记录样品名称后测量，OD260/OD280在1.8～2.2范围为合格标本，可用于后续试验。结果导出为EXCEL文档。⑥RNA完整性的鉴定：将RNA提取液5 μL 与上样缓冲液1 μL混合，1%琼脂糖凝胶，150V，40 mA，电泳20 min，凝胶成像系统观察结果。所有用于后续RNA分析的RNA标本均显示28S、18S两条带，28S：18S的亮度比约1.5～2.0倍，说明RNA没有降解，有较好的完整性。提取的RNA保存于-80℃超低温冰箱中，或立即用于逆转录。
1.4.2 RNA的逆转录（逆转录试剂盒） ①根据所测得的RNA浓度，把所有样本全部稀释至1000 ng/μL。②预变性：在无酶的200 μL EP管中加入RNA 1 μg（即1 μL），用RNase free水补足到14 μL。PCR仪设定为65℃ 5 min，所有过程全部在冰上完成。③拿出后每管中加入Primer Mix 1 μL、Enzyme Mix 1 μL、5×Buffer 4 μL，得到20 μL反应体系。PCR仪设定为37℃ 1 h，98℃ 5 min。-20℃保存。 1.4.3 RNA的检测 把逆转录所得的1000 ng/μL的cDNA1 μL加入100 μL的Ep管中，再加入SYBR Green试剂盒中的DNA转录酶（2×Taq酶Mix）10 μL及超纯水12.8 μL，再加入上海生工生物工程股份有限公司合成的Trα-2β和人β-actin引物，进行PCR试验（表1）。所有EP管中的试剂均在PCR仪中反应，95℃反应5 min，95℃反应30s，61℃反应30 s，72℃反应1 min，72℃再反应5 min，再返回步骤2，步骤2～5再循环34次后12℃保存（表2）。
1.5结果阅读
使用凝胶成像分析系统紫外透射分析扫描各条带的光密度，以Trα-2β的光密度值与β-actin基因的光密度值之比为相互间进行比较的参数。以癌旁正常组织参数的平均值为标准，未出现条带为基因缺失。用去离子水做为阴性对照。使用Quantity-One软件，计算各个样本Trα-2β的转录水平，各个组织中Trα-2β的相对值=目的扩增条带的灰度值/β-actin基因扩增条带的灰度值。
1.6统计学方法
实验数据采用SPSS 20.0统计学软件进行统计分析，计数资料进行χ2检验；P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
通过Quantity-One软件比较发现：直肠癌中Trα-2β的转录水平比癌旁正常组织明显增高（P<0.05）；Ⅰ期直肠癌Trα-2β的转录水平明显较Ⅱ期直肠癌低（P=0.0006）；而Ⅱ、Ⅲ期之间Trα-2β的转录水平无明显差异（P=0.2725）；Ⅱ期与Ⅳ期间（P=0.3912）、Ⅲ期与Ⅳ期间（P=0.1697）Trα-2β的转录水平均无明显差异；Trα-2β的转录水平与肿瘤的分化程度（低分化、中分化、高分化）有关，低分化与中分化比较（P=0.0182），中分化与高分化比较（P=0.0193），低分化与高分化比较（P=0.0002），每种分化程度间表达均有差异（P=0.0006）；Trα-2β的转录水平与肿瘤的病理分型（腺癌、鳞癌、未分化癌等）无关（P=0.6305）；转移淋巴结与未转移淋巴结Trα-2β的转录水平无统计学差异（P=0.2254）。见表3。
3讨论
在生物学上，选择性前体mRNA剪接对于蛋白多样性是一个不可或缺的因素，人体大部分转录物都会被选择性调控。研究证实，人类基因组共包含31 000到39 000左右个基因，但是人体内的蛋白种类、数量远远多于此，已知的可能原因主要还是选择性剪接的多样性[9]。在人类中，人体的大脑呈现出最高水平的选择性剪接过程，实验证明在大脑中有数目最多的占位外显子[10]，其次是肝脏、睾丸等器官[11]。研究表明，90%的基因经历了选择性剪接，超过50%的疾病突变要作用于前体mRNA选择性剪接过程[12]，Trα-2β无论是在生理方面还是在病理过程中都发挥着许多重要作用。Hierarchy学说发现肿瘤细胞株内有极少数具有无限增殖能力的细胞，被称为“肿瘤中的干细胞”，它是肿瘤增大、转移、复发及耐药的来源，而选择性前体mRNA剪辑蛋白或许是其中不可或缺的一环[13]。德国弗莱堡大学的Dirk O. Watermann在乳腺癌的研究中发现Trα-2β可调控肿瘤表位的表达，其作用机制为Trα-2β可调节CD44基因的可变外显子剪接位点（v4-v6段），而此段外显子基因又证明与乳腺癌的发生与转移有关[14]。Shukla S等[15]还发现Trα-2β基因亚型在血管的快、慢收缩平滑肌中，表达量存在明显差异，现今国内外仅见Trα-2β基因与结肠癌的相关性分析，Trα-2β与其下游的结直肠癌细胞侵袭性表位基因的关系却未见相关性报道[16，17]，Trα-2β在侵袭性直肠癌血管与正常血管间的比较也未见报道。而在子宫内膜癌中，Trα-2β1的蛋白表达水平上调，并且统计学分析表明，在低分化的病例中，Trα-2β的核表达水平较高，Trα-2β1甚至可以作为一个独立的预后的指标[18]。
Best A等[19]研究发现，Trα-2β参与肿瘤的发病机制可能通过以下三条途径。第一，通过Trα-2β与NASP（细胞核自身抗原精子蛋白）的tNASP（睾丸型）的外显子特异性结合。通过 NASP转运参与核小体的形成，当NASP表达不充分时，将会使DNA的复制停止并且细胞分裂停止。第二，通过选择性剪接肿瘤细胞CD44前体RNA的特异性调节，影响肿瘤进展和转移[20，21]。第三，在肿瘤细胞中，HIPK3基因的转录调控和凋亡调控。Trα-2β有可能主要通过参与HIPK3-T的选择性剪接，进而影响肿瘤的进展。已有研究表明，结肠癌HTC116细胞中Trα-2β过表达，通过沉默Trα-2β基因，发现结肠癌细胞可以胱天蛋白酶依赖方式凋亡[22]。
本次研究主要探讨Trα-2β在直肠癌组织与周围正常组织中的转录情况，比较了该基因与肿瘤分期、病理分型、分化程度之间的关联。前期研究发现在肿瘤组织中Trα-2β的转录显著高于其癌旁非肿瘤组织；另外，Trα-2β的转录与直肠癌的分期具有一定相关性，但此次可能因样本量过小，在Ⅰ期与其他几期有差异，Ⅱ期与Ⅳ期间可见差异，Ⅲ期与Ⅳ期间存在差异，而在Ⅱ、Ⅲ期间未发现有统计学差异，也未找到Trα-2β在不同病理类型的直肠癌组织中的差异。尽管试验结果未能与其他肿瘤的研究结果保持高度一致，但考虑到本实验研究样本量太少，结果出现一定偏差也在合理范围内，有待后续加大样本量来进行深入研究。但通过此试验结果趋势，我们仍不难发现，Trα-2β在直肠癌中主要调节细胞增殖与凋亡作用，其表达上调提示預后不佳，而Trα-2β转录量减少或缺失可以影响肿瘤的进程。本课题研究希望通过后续大量Realtime qPCR试验做出关于直肠癌Trα-2β的标准曲线，通过门诊或病房直肠镜下活检测定基因来预测患者直肠癌TNM分期、分化程度。但Trα-2β在直肠癌中发挥的促进肿瘤细胞增殖或抑制凋亡的作用是如何实现的，有待进一步的研究来阐明。 [參考文献]
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（收稿日期：2017-09-06）