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摘 要：本文主要通过对实践工作中遇到的14例白骨化尸体牙齿的DNA检验分析，阐述了该类案件中提取牙齿作DNA检验的优势，以及总结了运用简易砸牙器和硅胶模柱手工纯化技术作牙齿DNA检验的实用方法。
关键词：白骨化；牙齿；砸牙器；DNA检验
中图分类号：D919 文献标识码：A 文章编号：2095-4379-（2015）26-0175-02
作者简介：张晓宇（1981-），男，汉族，内蒙古包头人，大学本科，广州市公安局花都区分局刑事警察大队，主检法医师，研究方向：法医病理学。
在白骨化尸体案件中，尸体大多暴露在野外，环境较为恶劣，存放时间长，通常能进行个体识别和亲子鉴定的生物检材只有骨骼和牙齿。由于此类检材运用的提取、纯化方法较为复杂，成功检出STR分型存在一定的难度，因此被归类为疑难生物检材；另外，在检验过程中往往要借助如液氮研磨仪等价格昂贵的辅助设备，因此在一般DNA实验室都不开展这项工作。本文介绍在工作实践中提取的14宗白骨化尸体案件中的牙齿，运用简易的砸牙器进行预处理，采用QIAampR DNA Invesstigator Kit试剂盒手工法进行提取、纯化，均成功地检出STR基因分型，此方法实用，供同行借鉴参考。
一、材料和方法
（一）样本
在工作实践中遇到的白骨化尸体案件14宗，均在现场提取到牙齿。其中：死亡时间在两年以上的1宗，一年以上的6宗，半年左右的7宗；尸骨存放在室内的1宗，暴露在山上树林或草丛的9宗，水中的3宗，土埋的1宗。
（二）样本预处理
在各宗案件现场提取到的牙齿中，磨牙选取1颗，尖牙或切牙选取2颗；将选取的牙齿放置在干净的小烧杯中，倒入蒸馏水浸泡，使牙齿表层的污垢变疏松，然后用手术刀刮净牙齿表面的污垢物，用蒸馏水反复冲洗多次至牙齿表面干净；将洗好的牙齿放入干净的小烧杯中，倒入适量的5%的次氯酸钠溶液浸泡15分钟后弃去液体，用蒸馏水冲洗5次，然后加入去离子水浸泡5分钟，以去除次氯酸钠，再用无水乙醇泡洗2次，取出牙齿用滤纸擦干待用。
（三）DNA提取
将上述处理过的牙齿放置在简易的砸牙器中，用铁锤将牙齿砸成粉末状，将粉末分成两份分别加入到1.5ml的离心管中；然后往离心管中加入适量的EDTA脱钙液，常温下震荡脱钙12小时以上，期间震荡3-5次，每次震荡后确保离心管的盖子盖紧；脱钙完毕后，13000rpm离心5分钟，弃去上清液，向含有牙齿粉末的离心管中加入300-500ul骨骼裂解液（Promega公司）、20ulDTT溶液（1mol/L）、20ulPK溶液（20mg/ml），于56℃消化12小时以上，期间震荡几次，每次震荡后确保离心管的盖子盖紧；再按前量补加DTT及PK溶液，消化6小时以上，期间震荡多次；裂解完毕后，震荡，13000rpm离心5分钟，分别将两个离心管中的上清液转移至同一个干净的1.5ml的离心管中进行纯化。
运用QIAampR DNA Invesstigator Kit试剂盒，参照该试剂盒操作手册中《从骨头和牙齿中分离总DNA》的方法步骤，利用手工法纯化上述预处理后的上清液。选取DNA洗脱液的体积为30ul。
（四）STR分型检测
上述DNA提取产物均用9700型PCR扩增仪（AB公司，美国）按PowerPlex_21试剂盒（Promega公司，美国）操作手册的程序进行PCR复合扩增，反应体系为10ul体系，模板DNA量为4ul。扩增产物采用3130XL型基因分析仪（AB公司，美国）进行分型检测。用GeneMapper v3.21进行DNA片段分析，观察该样本的STR分型结果。
二、结果
经GeneMapper v3.21进行DNA片段分析，其中有11宗案件的牙齿均一次就检出21个基因座的完整STR图谱，另3宗死亡时间较长的案件检出的STR图谱出现较大位点等位基因峰低和1-3个基因座位点缺失的情况，通过改变扩增体系和增加DNA模板量均检出21个基因座的完整STR图谱，如图1所示。
三、讨论
牙齿是有高度钙化组织构成的器官，是人体最坚硬的组织和保存时间最长的器官，由于牙齿的特殊结构，用作DNA检验的牙本质和牙髓组织外层都有牙釉质或牙骨质包裹，不易受环境和理化因素的影响，这种稳定性使牙齿成为DNA检验很好的生物检材。本文所做的14宗案件的牙齿很好的证明了这点，不管是暴露在野外、土埋还是浸泡在水中的牙齿，均成检出完整的STR分型，死亡时间在两年以上的也是如此。但实验图谱也显示，随着死亡时间的延长，也出现的DNA降解的情况，具体的影响因素及降解速度则需要更多的实验来研究。
在白骨化尸体的案件现场，大多提取牙齿或四肢长骨进行DNA检验，而相对于长骨，牙齿的提取保存更为方便，并且在检验过程中，四肢长骨一般得运用价格昂贵的液氮研磨器进行研磨，而牙齿则可以运用简易的砸牙器砸成粉末状进行脱钙处理，对于区、县一级或经济状况较差的DNA实验室，牙齿的DNA检验更符合实际工作。在实验中，最好选取磨牙进行检验，因为相关报道称磨牙的DNA获得量比尖牙或切牙高很多倍，更容易检出完整STR分型，并且由于磨牙不容易从牙槽骨中脱落，在案件现场更容易提取到。
此外，在牙齿DNA检验过程中，我们应该注意以下几点问题：1、白骨化尸体现场提取到的牙齿大多暴露在恶劣的环境中，表层都附着一层污垢，在预处理过程中一定要将污垢刮干净，以免造成扩增的抑制；2、在牙齿粉末的脱钙及裂解过程中，震荡后一定要确保裂解管盖子盖紧，以免造成液体的挥发；3、对存放时间较长的牙齿，可运用较大扩增体系，选择不同的浓度梯度进行扩增，选取较好的结果；4、用GeneMapper v3.21进行DNA片段分析时，特别要注意存放时间较长的牙齿样本，较大位点基因座容易出现峰低现象，在峰值较低且检出纯合子的基因座需注意是否出现漏扩增，出现这样情况可以运用Minifiler试剂盒扩增进行补充。
[ 参 考 文 献 ]
[1]张志愿主编.口腔科学[M].北京：人民卫生出版社，2004.
[2]侯一平主编.法医物证学[M].北京：人民卫生出版社，2004.
[3]吴梅筠主编.法庭生物学[M].成都：四川大学出版社，2006.
[4]凃政，刘志芳，陈松等.牙齿的DNA提取及STR分型研究[J].刑事技术，2007（05）.
关键词：白骨化；牙齿；砸牙器；DNA检验
中图分类号：D919 文献标识码：A 文章编号：2095-4379-（2015）26-0175-02
作者简介：张晓宇（1981-），男，汉族，内蒙古包头人，大学本科，广州市公安局花都区分局刑事警察大队，主检法医师，研究方向：法医病理学。
在白骨化尸体案件中，尸体大多暴露在野外，环境较为恶劣，存放时间长，通常能进行个体识别和亲子鉴定的生物检材只有骨骼和牙齿。由于此类检材运用的提取、纯化方法较为复杂，成功检出STR分型存在一定的难度，因此被归类为疑难生物检材；另外，在检验过程中往往要借助如液氮研磨仪等价格昂贵的辅助设备，因此在一般DNA实验室都不开展这项工作。本文介绍在工作实践中提取的14宗白骨化尸体案件中的牙齿，运用简易的砸牙器进行预处理，采用QIAampR DNA Invesstigator Kit试剂盒手工法进行提取、纯化，均成功地检出STR基因分型，此方法实用，供同行借鉴参考。
一、材料和方法
（一）样本
在工作实践中遇到的白骨化尸体案件14宗，均在现场提取到牙齿。其中：死亡时间在两年以上的1宗，一年以上的6宗，半年左右的7宗；尸骨存放在室内的1宗，暴露在山上树林或草丛的9宗，水中的3宗，土埋的1宗。
（二）样本预处理
在各宗案件现场提取到的牙齿中，磨牙选取1颗，尖牙或切牙选取2颗；将选取的牙齿放置在干净的小烧杯中，倒入蒸馏水浸泡，使牙齿表层的污垢变疏松，然后用手术刀刮净牙齿表面的污垢物，用蒸馏水反复冲洗多次至牙齿表面干净；将洗好的牙齿放入干净的小烧杯中，倒入适量的5%的次氯酸钠溶液浸泡15分钟后弃去液体，用蒸馏水冲洗5次，然后加入去离子水浸泡5分钟，以去除次氯酸钠，再用无水乙醇泡洗2次，取出牙齿用滤纸擦干待用。
（三）DNA提取
将上述处理过的牙齿放置在简易的砸牙器中，用铁锤将牙齿砸成粉末状，将粉末分成两份分别加入到1.5ml的离心管中；然后往离心管中加入适量的EDTA脱钙液，常温下震荡脱钙12小时以上，期间震荡3-5次，每次震荡后确保离心管的盖子盖紧；脱钙完毕后，13000rpm离心5分钟，弃去上清液，向含有牙齿粉末的离心管中加入300-500ul骨骼裂解液（Promega公司）、20ulDTT溶液（1mol/L）、20ulPK溶液（20mg/ml），于56℃消化12小时以上，期间震荡几次，每次震荡后确保离心管的盖子盖紧；再按前量补加DTT及PK溶液，消化6小时以上，期间震荡多次；裂解完毕后，震荡，13000rpm离心5分钟，分别将两个离心管中的上清液转移至同一个干净的1.5ml的离心管中进行纯化。
运用QIAampR DNA Invesstigator Kit试剂盒，参照该试剂盒操作手册中《从骨头和牙齿中分离总DNA》的方法步骤，利用手工法纯化上述预处理后的上清液。选取DNA洗脱液的体积为30ul。
（四）STR分型检测
上述DNA提取产物均用9700型PCR扩增仪（AB公司，美国）按PowerPlex_21试剂盒（Promega公司，美国）操作手册的程序进行PCR复合扩增，反应体系为10ul体系，模板DNA量为4ul。扩增产物采用3130XL型基因分析仪（AB公司，美国）进行分型检测。用GeneMapper v3.21进行DNA片段分析，观察该样本的STR分型结果。
二、结果
经GeneMapper v3.21进行DNA片段分析，其中有11宗案件的牙齿均一次就检出21个基因座的完整STR图谱，另3宗死亡时间较长的案件检出的STR图谱出现较大位点等位基因峰低和1-3个基因座位点缺失的情况，通过改变扩增体系和增加DNA模板量均检出21个基因座的完整STR图谱，如图1所示。
三、讨论
牙齿是有高度钙化组织构成的器官，是人体最坚硬的组织和保存时间最长的器官，由于牙齿的特殊结构，用作DNA检验的牙本质和牙髓组织外层都有牙釉质或牙骨质包裹，不易受环境和理化因素的影响，这种稳定性使牙齿成为DNA检验很好的生物检材。本文所做的14宗案件的牙齿很好的证明了这点，不管是暴露在野外、土埋还是浸泡在水中的牙齿，均成检出完整的STR分型，死亡时间在两年以上的也是如此。但实验图谱也显示，随着死亡时间的延长，也出现的DNA降解的情况，具体的影响因素及降解速度则需要更多的实验来研究。
在白骨化尸体的案件现场，大多提取牙齿或四肢长骨进行DNA检验，而相对于长骨，牙齿的提取保存更为方便，并且在检验过程中，四肢长骨一般得运用价格昂贵的液氮研磨器进行研磨，而牙齿则可以运用简易的砸牙器砸成粉末状进行脱钙处理，对于区、县一级或经济状况较差的DNA实验室，牙齿的DNA检验更符合实际工作。在实验中，最好选取磨牙进行检验，因为相关报道称磨牙的DNA获得量比尖牙或切牙高很多倍，更容易检出完整STR分型，并且由于磨牙不容易从牙槽骨中脱落，在案件现场更容易提取到。
此外，在牙齿DNA检验过程中，我们应该注意以下几点问题：1、白骨化尸体现场提取到的牙齿大多暴露在恶劣的环境中，表层都附着一层污垢，在预处理过程中一定要将污垢刮干净，以免造成扩增的抑制；2、在牙齿粉末的脱钙及裂解过程中，震荡后一定要确保裂解管盖子盖紧，以免造成液体的挥发；3、对存放时间较长的牙齿，可运用较大扩增体系，选择不同的浓度梯度进行扩增，选取较好的结果；4、用GeneMapper v3.21进行DNA片段分析时，特别要注意存放时间较长的牙齿样本，较大位点基因座容易出现峰低现象，在峰值较低且检出纯合子的基因座需注意是否出现漏扩增，出现这样情况可以运用Minifiler试剂盒扩增进行补充。
[ 参 考 文 献 ]
[1]张志愿主编.口腔科学[M].北京：人民卫生出版社，2004.
[2]侯一平主编.法医物证学[M].北京：人民卫生出版社，2004.
[3]吴梅筠主编.法庭生物学[M].成都：四川大学出版社，2006.
[4]凃政，刘志芳，陈松等.牙齿的DNA提取及STR分型研究[J].刑事技术，2007（05）.