【摘 要】
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目的 建立基于汉滩病毒(HTNV)84FLi株L片段的RNA聚合酶Ⅰ微基因组拯救体系.方法 将含有氯霉素乙酰转移酶(CAT)编码区的cDNA插入含有HTNV 84FLi株L片段5端和3端非编码区的质粒
【机 构】
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第四军医大学唐都医院全军感染病诊疗中心,西安,710038;
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目的 建立基于汉滩病毒(HTNV)84FLi株L片段的RNA聚合酶Ⅰ微基因组拯救体系.方法 将含有氯霉素乙酰转移酶(CAT)编码区的cDNA插入含有HTNV 84FLi株L片段5端和3端非编码区的质粒内的两个非编码区之间,将此eDNA嵌合体(polⅠ表达盒)克隆人人polⅠ肩动子和终止子之间,分别获得正义和反义方向的RNA polⅠ转录报告质粒.用报告质粒转染293T细胞或等量293T和HTNV感染的Vero混合培养细胞,在HTNV的L蛋白和核衣壳蛋白表达质粒共转染后48 h收获细胞,检测CAT活性.用上清液感染293T细胞,了解CAT活性的传代能力.结果 构建了正义和反义方向的HTNV 84FLi株L片段微基因组RNA聚合酶Ⅰ报告质粒pLvRNA-CAT和pLcRNA-CAT,用此质粒转染细胞后能检测到CAT的表达,且CAT活性能在拯救病毒微基因组中传代.结论 应用RNA聚合酶Ⅰ反向遗传操作技术成功拯救了HTNV 84FLi株微基冈组.
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