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摘要：设置不同的处理温度和干热处理时间，利用干热空气热处理方法，筛选出对辣椒种子内的辣椒轻斑驳病毒灭活效果好且具有较高的发芽率的灭菌条件。结果表明，75 ℃处理48 h对辣椒种子内的辣椒轻斑驳病毒具有较好的灭活效果，同时辣椒种子仍具有较高的发芽率，发芽率为95.6%。
关键词：辣椒轻斑驳病毒；加热灭菌；检测
辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus，PMMoV)是一种严重危害辣椒生产的种传病毒[1-3]。辣椒轻斑驳病毒侵染辣椒后，使辣椒呈现叶片皱缩、生长抑制、落花、果实变小等症状，对辣椒生产危害极大[4]。辣椒轻斑驳病毒能够通过种子进行传毒，种子内病毒可长时间存活并能随种子远距离传播。
人们通过对种子进行处理来控制一些病原体的措施已应用了很多年，黄瓜种子处理方式主要包括温汤浸种、干热空气处理和化学药剂处理(不同浓度盐酸、磷酸钠、病毒唑、高锰酸钾等)[5]。在各处理方式中，干热空气处理、磷酸钠处理是最常用的处理方式，国内外研究显示其可对病毒起到一定的灭活作用，但不同病毒处理效果不同，且较多处理措施影响种子发芽率。Rast和Stijger利用热空气处理、10%磷酸钠处理带有辣椒花叶病毒(Capsicum mosaic virs)的胡椒种子[6]，结果显示76 ℃处理3 d并储存3个月后，可有效灭活种子中的病毒，但严重影响种子萌发；而磷酸钠(100 g/L)处理2 h可基本灭活种子中的病毒且不影响种子萌发。与此类似，在灭活番茄中的凤果花叶病毒（Pepino mosaic virus）研究中，磷酸钠起到了基本脱除病毒的作用，而干热空气处理(74℃处理48 h或80℃处理24 h)在控制病毒的同时，也影响到了种子萌发[7]。本研究以干热空气处理方法为基础，对辣椒种子设置不同的处理温度和干热处理时间，筛选出对辣椒种子内的辣椒轻斑驳病毒具有较好的灭活效果，同时辣椒种子仍具有较高的发芽率的灭菌条件，为进一步控制种子内辣椒轻斑驳病毒的危害体提供重要参考。
1材料和方法
1.1辣椒种子的干热处理
将辣椒种子称量适量放于铝盒中，打开盖子放在烘箱中40 ℃温度下处理24 h，达到规定时间后取出，分别在70 ℃、75 ℃、80 ℃条件下做三组处理，每组处理种子100粒。处理1：24 h干热处理；处理2：48 h干热处理；处理3：72 h干热处理。以不处理的种子为对照组CK。
1.2病毒检测
采用RT-PCR技术，将处理后的每种种子各取出10粒，对每粒种子进行研磨提取RNA、再用特异性引物进行RT-PCR反应检测特异性条带，分析不同温度下，不同处理时间后种子的病毒率。根据文献[8-9]，合成引物Wup-F：5'-ATGGCGGAATTTGACCTATG-3'；Wdow-R：5'-TTAGTTCCATCTGCCCATCC-3'，PCR扩增证实是否为辣椒轻斑驳病毒，引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反应总体积25 μL，包括ddH2O 10 μL，Premix PrimeSTAR Hs 12.5 μL(TaKaRa公司)，引物各0.5 μL(10 μmol/L)，反转录产物30 ng。PCR反应程序：94 °C预变性5 min；98 °C，15 s；55°C，15 s；72°C，1 min，40循环；最后72 ℃ 延伸10 min。扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳，EB 染色，紫外灯下观察。
1.3 种子催芽萌发
先将种子用纱布包好并做好标记，浸泡在常温水中2 h后取出用棉布包好，保持湿润，使之处于常温催芽状态，每天洗种1次，4 d后开始每天记载发芽粒数，第7 d计算发芽总数，统计各处理发芽率。整个试验期间的室温为25～34 ℃。
2 研究和分析
2.1 种子带毒率分析
将带病毒种子经40℃度下处理24 h，取出后再分别在70℃、75℃、80℃条件下做三组处理（每组种子100粒）。处理1为24 h干热处理；处理2为48 h干热处理；处理3为72 h干热处理。以不处理的种子为对照组（CK）。经上述处理后，采用改进的CTAB方法提取单种子总RNA，并利用特异引物进行RT-PCR反应检测病毒。检测结果见图1，从该图中可以看出，RT-PCR检测扩增出一条大小为576 bp的单一条带，表明辣椒种子内带有辣椒轻斑驳病毒。同时，70 ℃处理对种子内辣椒轻斑驳病毒影响很小，75 ℃和80 ℃处理对种子内辣椒轻斑驳病毒影响较大，可将多数种子内病毒灭活。
图1 辣椒种子内辣椒轻斑驳病毒的RT-PCR检测
M; Marker DL 2000; 1-3：70 ℃( 24 h、48 h和72 h干热处理) ; 4-7: 75 ℃（24 h、48 h和72 h干热处理）; 7-9: 80 ℃(24 h、48 h和72 h干热处理) ; 10: 对照组CK
2.2 不用温度处理对种子发茅率的影响
不同温度处理队辣椒种子发芽率的影响纯在差异。从表1中可看出：(1)干热处理后马上进行发芽试验，70 ℃处理24 h的发芽率较对照高，其他几个处理的发芽率较对照低；(2)干热处理一个月后进行发芽试验，70 ℃处理24 h和75 ℃处理48 h的发芽率最高，但各处理及对照间的差异均不大；(3)从各处理在不同时间的发芽率来看，75 ℃处理72 h的发芽率降得最快，其次是80 ℃处理72 h及75 ℃处理48 h。其它辣椒种子经干热处理后，发芽率无明显下降，说明辣椒种子有一定的耐干热能力。
因此，结合病毒加热灭活效果及种子发芽率综合分析显示，75℃处理48 h对辣椒种子内的辣椒轻斑驳病毒具有较好的灭活效果，同时辣椒种子仍具有较高的发芽率。
表1 不同种子处理方法对病毒灭活及种子发芽的影晌
温度/种子数 70℃/45 75℃/45 80℃/45 CK
时间 24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h
病毒率％ 100 80 90 50 30 30 70 50 30 100
发芽率％ 处理后两天
97.8
91.1
84.4
88.9
86.7
68.9
82.2
88.9
73.3
95.6
处理后一个月
95.6
88.9
91.1
91.1
95.6
84.4
86.7
91.1
82.2
93.3
3 讨论
近两年在东北地区进行辣椒病害田间调查过程中，发现了大量辣椒受辣椒轻斑驳病毒危害并减产的情况，目前有关此类病毒的研究已有一定的进展[10]，但是仍面临着辣椒轻斑驳病毒已经在世界范围内广泛分布和传播的这种现状，危害农业生产以及食品安全等问题，因此迫切需要对该病毒进行控制。本研究主要是筛选出了对辣椒种子内的辣椒轻斑驳病毒灭活效果较好，好且具有较高的发芽率的灭菌条件，为辣椒农业生产提供有效的理论依据，为其他受辣椒轻斑驳病毒危害的经济作物椒的大规模脱毒生产提供参考价值。
参考文献：
[1] Tsuda S, Kirita M, Watanabe Y. Characterization of a Pepper mild mottle tobamovirus strain cable of cvercoming the L3 gene-mediated resistance, distinct from the resistance-breaking Italian isolate [J]. MPMI, 1998,11: 327-331.
[2] 王小平.辣椒病毒病及其防治药剂[J]. 长江蔬菜, 2002, 6: 23-24.
[3] 王亚南, 王锡锋, 周广和. 辣椒轻斑驳病毒与烟草花叶病毒症状差异相关因子研究[J]. 2009, 12(6): 24-25.
[4] 李明福, 张振择, 陈艳芳 等. 引起辣椒上一种新病害的病原鉴定[J]. 云南农业大学学报, 2003, 18(4): 96-96.
[5] 岳瑾, 王伟青, 董洁 等. 不同处理方法对黄瓜种子带多主棒孢霉菌及发芽率的影响[J]. 中国植保导刊, 2014, 1: 39-41.
[6] 王健华. 海南黄灯笼辣椒病毒病病原学及RNAi防控策略研究[D]. 海南大学, 2012.
[7] Sempere RN, Gómez P, Truniger V, et al. Development of expression vectors based on pepino mosaic virus[J]. Plant methods, 2011, 7: 6-20.
[8] Hawkes R. A dot-immunobinding assay for monoclonal and other antibodies[J]. Analytieal Bioehemistry, 1982, 119: 142-147.
[9] 施曼玲, 周雪平. 植物病毒的诊断技术[J]. 微生物学通报, 2000, 27(2): 149-151.
[10] 张永江, 李桂芳, 马洁 等. 辣椒种子种辣椒轻斑驳病毒检测[J]. 安徽农业科学, 2007, 35(14): 4228-4229.
排版时把基金项目和通讯地址都加上去
基金项目：中央高校基本科研业务费(DL13EA06-3)资助。
通讯作者：杨洪一(1978-)，男，吉林九台，博士，副教授，主要从事微生物学研究
关键词：辣椒轻斑驳病毒；加热灭菌；检测
辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus，PMMoV)是一种严重危害辣椒生产的种传病毒[1-3]。辣椒轻斑驳病毒侵染辣椒后，使辣椒呈现叶片皱缩、生长抑制、落花、果实变小等症状，对辣椒生产危害极大[4]。辣椒轻斑驳病毒能够通过种子进行传毒，种子内病毒可长时间存活并能随种子远距离传播。
人们通过对种子进行处理来控制一些病原体的措施已应用了很多年，黄瓜种子处理方式主要包括温汤浸种、干热空气处理和化学药剂处理(不同浓度盐酸、磷酸钠、病毒唑、高锰酸钾等)[5]。在各处理方式中，干热空气处理、磷酸钠处理是最常用的处理方式，国内外研究显示其可对病毒起到一定的灭活作用，但不同病毒处理效果不同，且较多处理措施影响种子发芽率。Rast和Stijger利用热空气处理、10%磷酸钠处理带有辣椒花叶病毒(Capsicum mosaic virs)的胡椒种子[6]，结果显示76 ℃处理3 d并储存3个月后，可有效灭活种子中的病毒，但严重影响种子萌发；而磷酸钠(100 g/L)处理2 h可基本灭活种子中的病毒且不影响种子萌发。与此类似，在灭活番茄中的凤果花叶病毒（Pepino mosaic virus）研究中，磷酸钠起到了基本脱除病毒的作用，而干热空气处理(74℃处理48 h或80℃处理24 h)在控制病毒的同时，也影响到了种子萌发[7]。本研究以干热空气处理方法为基础，对辣椒种子设置不同的处理温度和干热处理时间，筛选出对辣椒种子内的辣椒轻斑驳病毒具有较好的灭活效果，同时辣椒种子仍具有较高的发芽率的灭菌条件，为进一步控制种子内辣椒轻斑驳病毒的危害体提供重要参考。
1材料和方法
1.1辣椒种子的干热处理
将辣椒种子称量适量放于铝盒中，打开盖子放在烘箱中40 ℃温度下处理24 h，达到规定时间后取出，分别在70 ℃、75 ℃、80 ℃条件下做三组处理，每组处理种子100粒。处理1：24 h干热处理；处理2：48 h干热处理；处理3：72 h干热处理。以不处理的种子为对照组CK。
1.2病毒检测
采用RT-PCR技术，将处理后的每种种子各取出10粒，对每粒种子进行研磨提取RNA、再用特异性引物进行RT-PCR反应检测特异性条带，分析不同温度下，不同处理时间后种子的病毒率。根据文献[8-9]，合成引物Wup-F：5'-ATGGCGGAATTTGACCTATG-3'；Wdow-R：5'-TTAGTTCCATCTGCCCATCC-3'，PCR扩增证实是否为辣椒轻斑驳病毒，引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反应总体积25 μL，包括ddH2O 10 μL，Premix PrimeSTAR Hs 12.5 μL(TaKaRa公司)，引物各0.5 μL(10 μmol/L)，反转录产物30 ng。PCR反应程序：94 °C预变性5 min；98 °C，15 s；55°C，15 s；72°C，1 min，40循环；最后72 ℃ 延伸10 min。扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳，EB 染色，紫外灯下观察。
1.3 种子催芽萌发
先将种子用纱布包好并做好标记，浸泡在常温水中2 h后取出用棉布包好，保持湿润，使之处于常温催芽状态，每天洗种1次，4 d后开始每天记载发芽粒数，第7 d计算发芽总数，统计各处理发芽率。整个试验期间的室温为25～34 ℃。
2 研究和分析
2.1 种子带毒率分析
将带病毒种子经40℃度下处理24 h，取出后再分别在70℃、75℃、80℃条件下做三组处理（每组种子100粒）。处理1为24 h干热处理；处理2为48 h干热处理；处理3为72 h干热处理。以不处理的种子为对照组（CK）。经上述处理后，采用改进的CTAB方法提取单种子总RNA，并利用特异引物进行RT-PCR反应检测病毒。检测结果见图1，从该图中可以看出，RT-PCR检测扩增出一条大小为576 bp的单一条带，表明辣椒种子内带有辣椒轻斑驳病毒。同时，70 ℃处理对种子内辣椒轻斑驳病毒影响很小，75 ℃和80 ℃处理对种子内辣椒轻斑驳病毒影响较大，可将多数种子内病毒灭活。
图1 辣椒种子内辣椒轻斑驳病毒的RT-PCR检测
M; Marker DL 2000; 1-3：70 ℃( 24 h、48 h和72 h干热处理) ; 4-7: 75 ℃（24 h、48 h和72 h干热处理）; 7-9: 80 ℃(24 h、48 h和72 h干热处理) ; 10: 对照组CK
2.2 不用温度处理对种子发茅率的影响
不同温度处理队辣椒种子发芽率的影响纯在差异。从表1中可看出：(1)干热处理后马上进行发芽试验，70 ℃处理24 h的发芽率较对照高，其他几个处理的发芽率较对照低；(2)干热处理一个月后进行发芽试验，70 ℃处理24 h和75 ℃处理48 h的发芽率最高，但各处理及对照间的差异均不大；(3)从各处理在不同时间的发芽率来看，75 ℃处理72 h的发芽率降得最快，其次是80 ℃处理72 h及75 ℃处理48 h。其它辣椒种子经干热处理后，发芽率无明显下降，说明辣椒种子有一定的耐干热能力。
因此，结合病毒加热灭活效果及种子发芽率综合分析显示，75℃处理48 h对辣椒种子内的辣椒轻斑驳病毒具有较好的灭活效果，同时辣椒种子仍具有较高的发芽率。
表1 不同种子处理方法对病毒灭活及种子发芽的影晌
温度/种子数 70℃/45 75℃/45 80℃/45 CK
时间 24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h
病毒率％ 100 80 90 50 30 30 70 50 30 100
发芽率％ 处理后两天
97.8
91.1
84.4
88.9
86.7
68.9
82.2
88.9
73.3
95.6
处理后一个月
95.6
88.9
91.1
91.1
95.6
84.4
86.7
91.1
82.2
93.3
3 讨论
近两年在东北地区进行辣椒病害田间调查过程中，发现了大量辣椒受辣椒轻斑驳病毒危害并减产的情况，目前有关此类病毒的研究已有一定的进展[10]，但是仍面临着辣椒轻斑驳病毒已经在世界范围内广泛分布和传播的这种现状，危害农业生产以及食品安全等问题，因此迫切需要对该病毒进行控制。本研究主要是筛选出了对辣椒种子内的辣椒轻斑驳病毒灭活效果较好，好且具有较高的发芽率的灭菌条件，为辣椒农业生产提供有效的理论依据，为其他受辣椒轻斑驳病毒危害的经济作物椒的大规模脱毒生产提供参考价值。
参考文献：
[1] Tsuda S, Kirita M, Watanabe Y. Characterization of a Pepper mild mottle tobamovirus strain cable of cvercoming the L3 gene-mediated resistance, distinct from the resistance-breaking Italian isolate [J]. MPMI, 1998,11: 327-331.
[2] 王小平.辣椒病毒病及其防治药剂[J]. 长江蔬菜, 2002, 6: 23-24.
[3] 王亚南, 王锡锋, 周广和. 辣椒轻斑驳病毒与烟草花叶病毒症状差异相关因子研究[J]. 2009, 12(6): 24-25.
[4] 李明福, 张振择, 陈艳芳 等. 引起辣椒上一种新病害的病原鉴定[J]. 云南农业大学学报, 2003, 18(4): 96-96.
[5] 岳瑾, 王伟青, 董洁 等. 不同处理方法对黄瓜种子带多主棒孢霉菌及发芽率的影响[J]. 中国植保导刊, 2014, 1: 39-41.
[6] 王健华. 海南黄灯笼辣椒病毒病病原学及RNAi防控策略研究[D]. 海南大学, 2012.
[7] Sempere RN, Gómez P, Truniger V, et al. Development of expression vectors based on pepino mosaic virus[J]. Plant methods, 2011, 7: 6-20.
[8] Hawkes R. A dot-immunobinding assay for monoclonal and other antibodies[J]. Analytieal Bioehemistry, 1982, 119: 142-147.
[9] 施曼玲, 周雪平. 植物病毒的诊断技术[J]. 微生物学通报, 2000, 27(2): 149-151.
[10] 张永江, 李桂芳, 马洁 等. 辣椒种子种辣椒轻斑驳病毒检测[J]. 安徽农业科学, 2007, 35(14): 4228-4229.
排版时把基金项目和通讯地址都加上去
基金项目：中央高校基本科研业务费(DL13EA06-3)资助。
通讯作者：杨洪一(1978-)，男，吉林九台，博士，副教授，主要从事微生物学研究