【摘 要】
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为了探究铁皮石斛阿拉伯吡喃糖变位酶(UAM)基因的功能,本研究采用RT-PCR技术从铁皮石斛叶片中克隆出阿拉伯吡喃糖变位酶基因,获得1 104 bp的ORF序列并命名为DoUAM,编码367个
【机 构】
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云南农业大学中药材研究所,昆明,650201;云南农业大学植物保护学院,昆明,650201
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为了探究铁皮石斛阿拉伯吡喃糖变位酶(UAM)基因的功能,本研究采用RT-PCR技术从铁皮石斛叶片中克隆出阿拉伯吡喃糖变位酶基因,获得1 104 bp的ORF序列并命名为DoUAM,编码367个氨基酸,分子量大小为41.433 kD.生物信息学预测表明:DoUAM蛋白与模式植物拟南芥(AtRGP1和AtRGP2)和水稻(OsUAM1)的同源序列高度保守.Motif预测表明DoUAM含有DXD-Motif、KKXX-Like基序和一个RGP基序,三个糖基转移酶基序.系统发育分析结果显示,DoUAM与PeUAM1亲缘关系最近,并将其归类到具有自我糖基化功能的Class Ⅰ RGPs亚族中.蛋白三维结构预测显示,DoUAM蛋白的Ile27,Gly51,Asp88,Aspl08,I1e239等残基可能与底物UDP-Sugars的糖基相互作用,Asp108、Asp109和Asp110残基可能为二价金属离子的结合位点,以提高酶的活性.通过DNA同源重组技术(Clone expressⅡ,Vazyme)将其连接到pBI121s载体上,成功构建植物表达载体pBI 121 s-DoUAM.利用农杆菌介导的浸花法转化到拟南芥(Col-0)中,经筛选获得6株具有卡那霉素(kan)抗性的T2代阳性转基因拟南芥植株,对6株再生植株进行PCR检测表明,目的基因已经成功整合到拟南芥基因组中.表型观察发现T2代转DoUAM基因拟南芥植株生长较对照组(WT)缓慢,尤其是根生长缓慢,叶片瘦小,分析表明DoUAM可能与植物的发育有关.对转基因拟南芥植株的总多糖含量进行检测发现,转DoUAM植株多糖含量明显高于对照组(WT),进一步分析表明铁皮石斛DoUAM基因与植物细胞多糖的合成有关.本研究结果为深入研究DoUAM基因在铁皮石斛发育过程以及多糖合成过程中可能发挥的功能和作用机制提供了帮助.
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