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摘要：【目的】鑒定坛紫菜（Pyropia haitanensis）HSP20基因家族成员（PhHSP20s），并进行生物信息学及表达谱分析，为揭示PhHSP20s基因在坛紫菜生长发育和非生物胁迫下的调控机理提供理论依据。【方法】对坛紫菜基因组序列进行基因结构预测，利用隐马尔可夫模型在坛紫菜蛋白序列中搜索含有ACD结构域且分子量为12～43 kD的HSP20家族蛋白，并对其理化性质、系统进化及编码基因启动子顺式作用元件和表达特性进行分析。【结果】从坛紫菜全基因组鉴定出8个PhHSP20s基因，其不均匀地分布在5条Scaffolds上，均只含有1个外显子，无内含子，开放阅读框（ORF）长度为402～930 bp，其编码蛋白的氨基酸残基数量为133～309个，分子量为13.7～31.9 kD，理论等电点（pI）为5.50～10.49，多数蛋白呈酸性。系统发育进化树分析结果显示，陆生植物（拟南芥）、红藻（脐形紫菜和坛紫菜）和细菌（大肠杆菌）HSP20分别聚类为独立的一支，但绿藻（莱茵衣藻）HSP20聚类为2个分支，分别与陆生植物和红藻HSP20聚类在一起;红藻（脐形紫菜和坛紫菜）HSP20蛋白高度相似，亲缘关系近，可分为2个小分支，均与陆生植物HSP20的亲缘关系较远，不属于陆生植物中已报道过的任何HSP20亚族。PhHSP20s基因启动子上除了含有保守的通用元件外，还含有非生物胁迫响应元件。在PhHSP20s基因中，除PhHSP32基因几乎不在任何条件下表达外，其余PhHSP20s基因至少在1种条件下高表达，且部分PhHSP20s基因表现出相似的表达模式;部分PhHSP20s基因在不同生长阶段、光质培养条件、失水胁迫和盐胁迫下具有表达特异性，即在生殖细胞发育阶段和单性生殖孢子发育期高表达，在低盐胁迫下高表达。【结论】坛紫菜HSP20家族基因在基因数目、基因结构及系统进化上明显不同于陆生植物HSP20家族基因，推测HSP20基因复制事件在红藻和陆生植物分化之后独立发生，且在坛紫菜生长发育和非生物胁迫应答中发挥作用。
关键词： 坛紫菜;HSP20基因家族;系统发育进化;表达谱;启动子;RNA-Seq
Abstract：【Objective】This paper aimed to identify HSP20 family members of Pyropia haitanensis（PhHSP20s），analyze their bioinformatic characteristics and expression profiles，and provide a theoretical basis for future exploring the function of PhHSP20s gene in development and biotic stress of P. haitanensis. 【Method】Gene structures of P. haitanensis genomic sequences were predicted. The HSP20 proteins containing ACD domain were scanned in the protein amino acid sequences of P. haitanensis and molecular weight was 12-43 kD with a hidden Markov model by HMMER. Their physicochemical properties，gene structures，phylogeny，cis-acting elements in promoter，and expression profiles were analyzed. 【Result】A total of 8 PhHSP20s genes were identified from the genome of P. haitanensis，which were unevenly distributed on 5 scaffolds. All 8 genes were composed of one exon and had no introns. The open reading frames（ORF） of PhHSP20s were 402-930 bp，encoding 133-309 amino acid residues， molecular weight was 13.7-31.9 kD with theoretical isoelectric points of 5.50-10.49. Most proteins were acidic. The phylogenetic tree analysis showed that the land plant（Arabidopsis thaliana），red algae（Porphyra umbilicalis and P. haitanensis） and bacteria（Escherichia coli） HSP20s were clustered as an independent branch，respectively，but the green algae（Chlamydomonas reinhardtii） HSP20s were clustered as two branches，which were clustered with the land plant and red algae HSP20s，respectively. The HSP20 proteins of red algae （P. umbilicalis and P. haitanensis） were highly similar and closely related，and could be divided into two small branches. The two branchesshowed a relatively distant relationship with terrestrial plants HSP20s，and were distinct from the HSP20 subgroups previously reported in terrestrial plants. The promoters of PhHSP20 genes contained both general cis-elements and abiotic stress response elements. Except for PhHSP32 gene，other PhHSP20s genes were highly expressed under at least one condition. Part of PhHSP20s genes showed similar expression patterns，and some of them had specific expression in different growth stages，light culture conditions，water loss stress and salt stress，that was，some PhHSP20s were highly expressed during reproductive cell development stage，parthenospore development stage，and under low salt stress. 【Conclusion】P. haitanensis HSP20 family genes are distinct from terrestrial plants HSP20 family genes in gene number， gene structure and phylogeny，indicating the HSP20 gene duplication events take place independently in the branches of red alga and terrestrial plants，and PhHSP20s are involved in both developmental regulation and abiotic stress response. Key words： Pyropia haitanensis; HSP20 gene family; phylogeny evolution; expression profile; promoter; RNA-Seq
0 引言
【研究意义】坛紫菜（Pyropia haitanensis）是红毛菜科（Bangiaceae）法紫菜属（Pyropia）的一类大型海洋红藻（Blouin et al.，2011），具有较高的营养和药用价值（张全斌等，2005），是我国重要的海水栽培藻类（Yang et al.，2017）。坛紫菜叶状体生长于潮间带的中高潮区，每天的潮汐使其周期性经历低潮失水（干出）与高潮复水（覆水）的环境变化。干出时紫菜叶状体常遭遇烈日或暴雨天气，藻体面临温度、水分、高光和盐胁迫，在覆水后又能迅速恢复正常生理和生长（Davison and Pearson，1996;Blouin et al.，2011），说明坛紫菜在长期的自然选择中演化出快速应对突变极端环境的抗逆应答能力（张晗晗，2016;陈天翔，2019）。这种抗逆能力促使坛紫菜成为了研究植物抗逆机制的理想材料。热激蛋白（Heat shock protein，HSP）是生物体遭受环境胁迫时诱导产生的一类普遍且极为重要的保护性蛋白，其表达量与植物的逆境胁迫抗性呈正相关（Al-Whaibi，2011;杨诚等，2018）。其中，HSP20（Heat shock protein 20）作为重要的分子伴侣，广泛参与植物的发育调控及胁迫响应（张宁和姜晶，2017）。因此，开展坛紫菜HSP20基因家族成员的全基因组鉴定及其生物信息学和表达谱分析，不仅有利于揭示HSP20基因的调控机理，还能为坛紫菜的抗逆应答研究提供理论依据。【前人研究进展】面对环境逆境，植物在形态、生理和分子水平上采用多种机制来抵御逆境胁迫，如积累渗透调节分子、维持生物大分子和膜结构稳定、清除活性氧自由基及表达抗逆基因等（杨献光等，2006;刘铃等，2018）。在抗逆基因表达的抗逆机制中，HSP的表达和积累是抗逆的关键环节（Al-Whaibi，2011;徐海等，2020），主要表现为在胁迫条件下，HSP参与稳定蛋白结构，防止蛋白凝聚、变性及修复受损伤蛋白，进而增强植物对逆境的抵御能力（Al-Whaibi，2011;栗振义等，2016;Jacob et al.，2017）。HSP是一个庞大的基因家族，成员众多，依据分子量的不同，可将其分成5个家族：HSP100、HSP90、HSP70、HSP60和小分子HSP（Gupta et al.，2010）。其中，HSP100在HSP70的辅助下能清除错误折叠或变性的多肽;HSP90参与信号转导及蛋白转运和降解;HSP70能防止蛋白发生错误折叠和聚集，辅助蛋白折叠;HSP60引导新生肽的折叠与再折叠;小分子HSP包括HSP40和HSP20，参与防止蛋白的大量聚集，促进蛋白的正确折叠与转运（李广隆等，2019）。这些HSP在高温、冷害、干旱胁迫、盐胁迫、高光胁迫、氧化胁迫及病原侵染等多种胁迫下参与维持植物细胞的稳态（Jacob et al.，2017）。其中，HSP20家族成员含量最丰富、分布最广泛，不仅参与胁迫响应，还参与植物正常的生长发育调控过程（张宁和姜晶，2017）。在拟南芥（Arabidopsis thaliana）等模式生物中，HSP20的种类、结构和功能已研究得较透彻（Al-Whaibi，2011）。已从拟南芥中鉴定出19个HSP20家族成员，13个位于细胞质，6个位于细胞器（Scharf et al.，2001）。其中，HSP17.4和HSP17.6II基因受热胁迫的诱导，并与HSP101基因共同保护翻译因子（McLoughlin et al.，2001）;HSP17.4基因参与种子发育和干旱胁迫的耐受性（Wehmeyer and Vierling，2000）;HSP17.6A基因在热胁迫、渗透胁迫及种子发育过程中被诱导过表达，以增强植株对盐胁迫和干旱胁迫的耐受性（Sun et al.，2001）。相比之下，坛紫菜HSP基因家族仅有少量报道，从坛紫菜克隆获得2个HSP90基因（代真真等，2014）、1个HSP40基因（陈玉婷等，2015）、1个HSP20基因（陈玉婷等，2015）和5个HSP70成员（Ji et al.，2015），且发现这些基因在部分胁迫诱导下高效表达，说明HSP基因家族成员参与坛紫菜植株的抗逆应答。【本研究切入点】虽然坛紫菜抗逆能力强，是研究植物抗逆机制的理想材料，但有关坛紫菜HSP20家族基因的研究相对较薄弱，鲜见针对坛紫菜HSP20家族成员数目、基因结构、系统进化和表达谱进行系统研究。【拟解决的关键问题】采用生物信息学方法分析坛紫菜基因组的基因结构，搜索含有ACD结构域的HSP20蛋白，并对其理化性质、结构域、基因结构、系统进化、启动子顺式作用元件及表达特性进行分析，为揭示HSP家族成员在坛紫菜发育调控和逆境应答中的作用机制提供参考。
1 材料与方法
1. 1 数据来源
从NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）下载坛紫菜全基因组数据（GCA_008729055.1）（Cao et al.，2020）及不同生長阶段和不同生长环境下的坛紫菜RNA-Seq数据（GenBank登录号为PRJNA572558、PRJNA566193、PRJNA283027、PRJNA510222、PRJNA428906、PRJNA386620和PRJNA503796）。
1. 2 HSP20基因家族成员鉴定
由于目前GenBank中尚缺乏相应的基因组注释信息和完整的蛋白序列，因此为了鉴定坛紫菜基因组中的HSP蛋白家族成员，首先须对坛紫菜基因组序列进行注释。使用EDTA分析流程找出基因组中转座元件等重复序列，并在基因组中标识出来（Ou et al.，2019），然后使用BRAKER2分析流程解析基因组，从中找出HSP20基因及其对应的蛋白序列（Hoff et al.，2019）。为了增加BRAKER2解析的准确性，利用不同生长阶段和不同生长环境下的坛紫菜RNA-Seq数据及OrthoDB数据库中所有红藻的直系同源蛋白进行基因结构信息解析（Kriventseva et al.，2019）。 获得坛紫菜所有蛋白氨基酸序列后，首先使用隐马尔可夫模型识别坛紫菜HSP20候选蛋白。以Pfam蛋白家族数据库中HSP20的HMM Profile（PF00011）作为查询序列（Punta et al.，2011），使用HMMER在坛紫菜的蛋白序列进行搜索（Eddy，2011）。然后使用BLASTp以拟南芥HSP20蛋白序列为参考序列在坛紫菜的蛋白序列进行搜索。从中筛选出E值≤1e-5的坛紫菜蛋白序列，去除冗余序列后，将蛋白序列提交至InterProScan进行结构域分析（Jones et al.，2014）。同时将蛋白序列提交至ExPASy（https：//web.expasy.org/compute_pi/）确定其分子量。将没有ACD（α-crystallin domain）结构域或分子量在12～43 kD范围之外的蛋白序列剔除，剩余序列即判定为坛紫菜HSP20蛋白（PhHSP20s）。
1. 3 HSP20家族蛋白系统进化分析
下载拟南芥、莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）、脐形紫菜（Porphyra umbilicalis）和大肠杆菌（Escherichia coli）的HSP20蛋白序列，结合鉴定出的PhHSP20s蛋白序列进行系统进化分析。其中，莱茵衣藻归属于绿藻，脐形紫菜归属于红藻。采用Clustal Omega进行多序列比对分析（Sievers et al.，2011），以FastTree的最大似然法（Maximum Likelihood）构建系统发育进化树（Price et al.，2010），并进行1000次的Bootstrap检验。
1. 4 HSP20家族基因启动子顺式作用元件分析
为了进一步研究PhHSP20s基因在非生物胁迫反应中的潜在调控机制，根据基因组注释结果，提取PhHSP20s基因的上游1.5 kb序列，然后提交至PlantCARE在线网站，以分析PhHSP20s基因启动子的顺式作用元件（Lescot et al.，2002）。
1. 5 HSP20家族基因表达分析
从GenBank中下载不同生长阶段和不同生长环境下的坛紫菜Illumina RNA-Seq数据，以研究PhHSP20s基因的表达模式。首先使用STAR进行有参比对（Dobin et al.，2013），获得全部转录本的表达量TPM值（Transcripts per million），然后提取PhHSP20s基因的表达量数据，并以log2进行转换，再使用MeV绘制聚类热图（Howe et al.，2011）。
2 结果与分析
2. 1 坛紫菜HSP20基因家族成员的鉴定结果
经HMMER和BLASTp搜索初步得到9个坛紫菜HSP20家族候选蛋白，从中剔除无ACD结构域或分子量在12～43 kD范围之外的候选成员，最终鉴定出8个PhHSP20s蛋白，根据分子量对其对应的编码基因进行命名，并综合基因组注释结果，提取PhHSP20s基因在基因组上的位置和内含子数目，结果如表1所示。坛紫菜基因组包含194条Scaffolds，有8个PhHSP20s基因不均匀地分布在其中的5条Scaffolds上。其中，有3个PhHSP20s基因（PhHSP19-1、PhHSP 19-2和PhHSP26）分布在SDUX01000006.1（Super-Scaffold 27）上，且这3个PhHSP20s基因位于相邻的基因间区域，具有成簇分布现象，推测串联重复是PhHSP20s基因家族扩展的因素之一。8个PhHSP20s基因的开放阅读框（ORF）长度为402～930 bp，均只含有1个外显子，无内含子，其编码蛋白的氨基酸残基数量为133～309个，分子量为13.7～31.9 kD，理论等电点（pI）为5.50～10.49，除PhHSP14、PhHSP28和PhHSP32蛋白外，其余5个PhHSP20s蛋白的pI均小于7.00，说明多数PhHSP20s蛋白为酸性。
2. 2 坛紫菜HSP20家族蛋白的系统进化分析结果
为了分析坛紫菜HSP20家族成员的亲缘关系和明确藻类与其他生物HSP20的亲缘关系，将8个PhHSP20s与5个脐形紫菜HSP20（PuHSP20s）、7个莱茵衣藻HSP20（CrHSP20s）、19个拟南芥HSP20（At-HSP20s）和2个大肠杆菌HSP20（E.coliHSP20s）蛋白的氨基酸序列构建系统发育进化树，结果（图1）显示大部分HSP20蛋白按物种分类地位聚类在一起，即陆生植物（拟南芥）、红藻（脐形紫菜和坛紫菜）和细菌（大肠杆菌）HSP20分别聚类为独立的一支，绿藻（莱茵衣藻）HSP20未聚类为独立的一支，而是聚类为2个分支，分别与陆生植物和红藻的HSP20聚类在一起;红藻HSP20蛋白（PhHSP20s和PuHSP20s）高度相似，亲缘关系最近，可分为2个小分支，每个小分支均含有PhHSP20s和PuHSP20s蛋白。PhHSP20s和PuHSP20s均與陆生植物HSP20的亲缘关系较远，二者不属于陆生植物中已报道过的任何HSP20亚族，故推测PhHSP20s和PuHSP20s构成HSP20家族的新亚族，其三维结构和功能尚待深入研究。
2. 3 HSP20家族基因启动子顺式作用元件分析结果
为了明确PhHSP20s基因潜在的调控机理，将其上游的1.5 kb序列提交至PlantCARE网站进行启动子顺式作用元件分析，结果显示，PhHSP20s基因启动子均含有CAAT-box、GC-motif和Sp1等通用作用元件。除这些通用作用元件外，PhHSP20s基因启动子区还含有一些非生物胁迫响应元件，如表2所示。所有PhHSP20s基因启动子均含有ABRE（脱落酸响应元件）、STRE（胁迫响应元件）和WRE3（损伤和防御响应元件），且大多数PhHSP20s基因启动子还含有DRE（干旱响应元件）、G-box（光调控元件）和MYB（MYB结合元件），表明PhHSP20s基因在坛紫菜生长发育和环境胁迫响应过程中发挥重要作用。 2. 4 坛紫菜HSP20家族基因的表达谱分析结果
基于RNA-Seq数据，用Mev绘制8个PhHSP20s基因在不同发育阶段、光质培养条件、失水胁迫和盐胁迫下的表达热图（图2）。除PhHSP32基因几乎在任何条件下均不表达外，其余的PhHSP20s基因至少在1种条件下高表达，且部分PhHSP20s基因表现出相似的表达模式。PhHSP19-2、PhHSP32、PhHSP14和PhHSP21基因在不同发育阶段的表达水平均较低，且无明显差异，PhHSP26、PhHSP28、PhHSP19-1和PhHSP16基因在生殖细胞发育阶段和单性生殖孢子发育期的表达水平较高（图2-A）。除PhHSP16和PhHSP19-1基因在红光下高表达外，不同光质对其余PhHSP20s基因表达无明显影响（图2-B）。除PhHSP32基因外，其余PhHSP20s基因在失水胁迫下的表达量均降低，复水后其表达水平恢复至胁迫前水平（图2-C）。此外，除PhHSP32基因外，其余PhHSP20s基因在低盐胁迫下高表达，而在高盐胁迫下低表达（图2-D）。综上所述，PhHSP20s基因參与坛紫菜的生长发育和非生物胁迫应答过程。
3 讨论
HSP20是一个古老蛋白家族，广泛分布于从细菌到高等动植物的绝大多数生物中，且成员众多。尽管远缘物种间HSP20蛋白序列及分子量（12～42 kD）差异明显，但均含有保守结构域ACD（张宁和姜晶，2017）。这些保守特征可用于不同物种HSP20家族新成员的鉴定，已从拟南芥中鉴定出19个成员（Scharf et al.，2001），从水稻（Oryza sativa）中鉴定出39个成员（Ouyang et al.，2009），从马铃薯（Solanum tuberosum）中鉴定出48个成员（Zhao et al.，2018）。本研究利用HSP20保守特征和高灵敏度的隐马尔可夫模型，从坛紫菜基因组中鉴定出8个PhHSP20s基因，明显少于上述陆生植物的HSP20基因家族成员数量。导致坛紫菜HSP20基因家族成员数量较少的原因可能是：（1）坛紫菜配子体有5条染色体（严兴洪等，2008），但组装出来的坛紫菜基因组有194条Scaffolds（Cao et al.，2020），即坛紫菜基因组组装不完整性，导致少量HSP20基因家族成员遗漏;（2）与坛紫菜的进化地位有关，通常生物越低等，其基因家族成员数量越少（Waters and Vierling，2020）。类似的现象在条斑紫菜（Pyropia yezoensis）、脐形紫菜、莱茵衣藻和温泉红藻（Cyanidioschyzon merolae）等藻类中也有发现，进一步证明其HSP20基因家族成员数量明显少于陆生植物的HSP20基因家族成员数量（Schroda，2004;Uji et al.，2019;Waters and Vierling，2020）。可见，坛紫菜HSP20基因家族成员数量与其进化地位相一致。
大量研究表明，陆生植物HSP20基因家族成员至少可划分为11个亚族，且不同陆生植物的同一亚族HSP20在系统发育进化树上形成单系群，同一陆生植物的不同亚族HSP20在系统发育进化树上形成旁系群，暗示不同物种同一亚族HSP20成员的亲缘关系较同一物种不同亚族HSP20成员的亲缘关系更近（Ouyang et al.，2009;张宁和姜晶，2017;Zhao et al.，2018;何福林和张斌，2019）。本研究也发现，红藻HSP20蛋白可分成2个分支，不同红藻同一分支HSP20蛋白的亲缘关系比同一红藻不同分支HSP20蛋白的亲缘关系更近。推测这2个分支的红藻HSP20蛋白不同于陆生植物HSP20亚族成员，与Uji等（2019）的研究结果一致，其原因可能是红藻HSP20基因复制事件发生在红藻与陆生植物分化事件之后，即HSP20基因复制事件独立地发生于陆生植物早期祖先和红藻早期祖先，且陆生植物早期祖先发生了更多次数的HSP20基因复制事件（Waters and Vierling，2020）。
HSP20是一类重要的蛋白，不仅参与胁迫响应，还参与植物正常的发育调控过程（张宁和姜晶，2017;李广隆等，2019）。为了预测坛紫菜HSP20家族基因可能参与的生物学过程，本研究分析PhHSP20s基因启动子的顺式作用元件，结果显示8个PhHSP20s基因启动子不仅含有保守的通用元件，还含有非生物胁迫响应元件，但不同启动子上所含元件不尽相同，说明PhHSP20s基因参与的生物学过程既有重叠又有区分。此外，本研究通过序列比对和表达谱分析发现，虽然PhHSP19-1和PhHSP19-2基因的核苷酸序列高度相似，且在基因组上紧密串联排列，但二者在不同生长阶段和非生物胁迫下表达水平差异明显，其原因可能是二者启动子所含的顺式作用元件存在差异所致。
尽管大量研究证实，HSP20广泛参与生物的胁迫响应过程，但本研究发现PhHSP20s基因在高盐胁迫和失水胁迫下呈下调表达或表达水平不变。类似的现象在番茄（Solanum lycopersicum）中也有发现，即在高盐和干旱胁迫下多数番茄HSP20基因（Sl-HSP20s）下调表达（俞佳虹，2017）。在高盐胁迫和失水胁迫下PhHSP20s基因下调表达，推测坛紫菜还具备其他的防御应答机制，比如隐生（Cryptobiosis）（周向红等，2013）等。可见，坛紫菜防御应答机理十分复杂，具体机理尚有待进一步探究。
4 结论
坛紫菜HSP20家族基因在基因数目、基因结构及系统进化上明显不同于陆生植物，推测HSP20基因复制事件在红藻和陆生植物分化之后独立发生，且在坛紫菜生长发育和非生物胁迫应答中发挥作用。
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（責任编辑 陈 燕）
关键词： 坛紫菜;HSP20基因家族;系统发育进化;表达谱;启动子;RNA-Seq
Abstract：【Objective】This paper aimed to identify HSP20 family members of Pyropia haitanensis（PhHSP20s），analyze their bioinformatic characteristics and expression profiles，and provide a theoretical basis for future exploring the function of PhHSP20s gene in development and biotic stress of P. haitanensis. 【Method】Gene structures of P. haitanensis genomic sequences were predicted. The HSP20 proteins containing ACD domain were scanned in the protein amino acid sequences of P. haitanensis and molecular weight was 12-43 kD with a hidden Markov model by HMMER. Their physicochemical properties，gene structures，phylogeny，cis-acting elements in promoter，and expression profiles were analyzed. 【Result】A total of 8 PhHSP20s genes were identified from the genome of P. haitanensis，which were unevenly distributed on 5 scaffolds. All 8 genes were composed of one exon and had no introns. The open reading frames（ORF） of PhHSP20s were 402-930 bp，encoding 133-309 amino acid residues， molecular weight was 13.7-31.9 kD with theoretical isoelectric points of 5.50-10.49. Most proteins were acidic. The phylogenetic tree analysis showed that the land plant（Arabidopsis thaliana），red algae（Porphyra umbilicalis and P. haitanensis） and bacteria（Escherichia coli） HSP20s were clustered as an independent branch，respectively，but the green algae（Chlamydomonas reinhardtii） HSP20s were clustered as two branches，which were clustered with the land plant and red algae HSP20s，respectively. The HSP20 proteins of red algae （P. umbilicalis and P. haitanensis） were highly similar and closely related，and could be divided into two small branches. The two branchesshowed a relatively distant relationship with terrestrial plants HSP20s，and were distinct from the HSP20 subgroups previously reported in terrestrial plants. The promoters of PhHSP20 genes contained both general cis-elements and abiotic stress response elements. Except for PhHSP32 gene，other PhHSP20s genes were highly expressed under at least one condition. Part of PhHSP20s genes showed similar expression patterns，and some of them had specific expression in different growth stages，light culture conditions，water loss stress and salt stress，that was，some PhHSP20s were highly expressed during reproductive cell development stage，parthenospore development stage，and under low salt stress. 【Conclusion】P. haitanensis HSP20 family genes are distinct from terrestrial plants HSP20 family genes in gene number， gene structure and phylogeny，indicating the HSP20 gene duplication events take place independently in the branches of red alga and terrestrial plants，and PhHSP20s are involved in both developmental regulation and abiotic stress response. Key words： Pyropia haitanensis; HSP20 gene family; phylogeny evolution; expression profile; promoter; RNA-Seq
0 引言
【研究意义】坛紫菜（Pyropia haitanensis）是红毛菜科（Bangiaceae）法紫菜属（Pyropia）的一类大型海洋红藻（Blouin et al.，2011），具有较高的营养和药用价值（张全斌等，2005），是我国重要的海水栽培藻类（Yang et al.，2017）。坛紫菜叶状体生长于潮间带的中高潮区，每天的潮汐使其周期性经历低潮失水（干出）与高潮复水（覆水）的环境变化。干出时紫菜叶状体常遭遇烈日或暴雨天气，藻体面临温度、水分、高光和盐胁迫，在覆水后又能迅速恢复正常生理和生长（Davison and Pearson，1996;Blouin et al.，2011），说明坛紫菜在长期的自然选择中演化出快速应对突变极端环境的抗逆应答能力（张晗晗，2016;陈天翔，2019）。这种抗逆能力促使坛紫菜成为了研究植物抗逆机制的理想材料。热激蛋白（Heat shock protein，HSP）是生物体遭受环境胁迫时诱导产生的一类普遍且极为重要的保护性蛋白，其表达量与植物的逆境胁迫抗性呈正相关（Al-Whaibi，2011;杨诚等，2018）。其中，HSP20（Heat shock protein 20）作为重要的分子伴侣，广泛参与植物的发育调控及胁迫响应（张宁和姜晶，2017）。因此，开展坛紫菜HSP20基因家族成员的全基因组鉴定及其生物信息学和表达谱分析，不仅有利于揭示HSP20基因的调控机理，还能为坛紫菜的抗逆应答研究提供理论依据。【前人研究进展】面对环境逆境，植物在形态、生理和分子水平上采用多种机制来抵御逆境胁迫，如积累渗透调节分子、维持生物大分子和膜结构稳定、清除活性氧自由基及表达抗逆基因等（杨献光等，2006;刘铃等，2018）。在抗逆基因表达的抗逆机制中，HSP的表达和积累是抗逆的关键环节（Al-Whaibi，2011;徐海等，2020），主要表现为在胁迫条件下，HSP参与稳定蛋白结构，防止蛋白凝聚、变性及修复受损伤蛋白，进而增强植物对逆境的抵御能力（Al-Whaibi，2011;栗振义等，2016;Jacob et al.，2017）。HSP是一个庞大的基因家族，成员众多，依据分子量的不同，可将其分成5个家族：HSP100、HSP90、HSP70、HSP60和小分子HSP（Gupta et al.，2010）。其中，HSP100在HSP70的辅助下能清除错误折叠或变性的多肽;HSP90参与信号转导及蛋白转运和降解;HSP70能防止蛋白发生错误折叠和聚集，辅助蛋白折叠;HSP60引导新生肽的折叠与再折叠;小分子HSP包括HSP40和HSP20，参与防止蛋白的大量聚集，促进蛋白的正确折叠与转运（李广隆等，2019）。这些HSP在高温、冷害、干旱胁迫、盐胁迫、高光胁迫、氧化胁迫及病原侵染等多种胁迫下参与维持植物细胞的稳态（Jacob et al.，2017）。其中，HSP20家族成员含量最丰富、分布最广泛，不仅参与胁迫响应，还参与植物正常的生长发育调控过程（张宁和姜晶，2017）。在拟南芥（Arabidopsis thaliana）等模式生物中，HSP20的种类、结构和功能已研究得较透彻（Al-Whaibi，2011）。已从拟南芥中鉴定出19个HSP20家族成员，13个位于细胞质，6个位于细胞器（Scharf et al.，2001）。其中，HSP17.4和HSP17.6II基因受热胁迫的诱导，并与HSP101基因共同保护翻译因子（McLoughlin et al.，2001）;HSP17.4基因参与种子发育和干旱胁迫的耐受性（Wehmeyer and Vierling，2000）;HSP17.6A基因在热胁迫、渗透胁迫及种子发育过程中被诱导过表达，以增强植株对盐胁迫和干旱胁迫的耐受性（Sun et al.，2001）。相比之下，坛紫菜HSP基因家族仅有少量报道，从坛紫菜克隆获得2个HSP90基因（代真真等，2014）、1个HSP40基因（陈玉婷等，2015）、1个HSP20基因（陈玉婷等，2015）和5个HSP70成员（Ji et al.，2015），且发现这些基因在部分胁迫诱导下高效表达，说明HSP基因家族成员参与坛紫菜植株的抗逆应答。【本研究切入点】虽然坛紫菜抗逆能力强，是研究植物抗逆机制的理想材料，但有关坛紫菜HSP20家族基因的研究相对较薄弱，鲜见针对坛紫菜HSP20家族成员数目、基因结构、系统进化和表达谱进行系统研究。【拟解决的关键问题】采用生物信息学方法分析坛紫菜基因组的基因结构，搜索含有ACD结构域的HSP20蛋白，并对其理化性质、结构域、基因结构、系统进化、启动子顺式作用元件及表达特性进行分析，为揭示HSP家族成员在坛紫菜发育调控和逆境应答中的作用机制提供参考。
1 材料与方法
1. 1 数据来源
从NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）下载坛紫菜全基因组数据（GCA_008729055.1）（Cao et al.，2020）及不同生長阶段和不同生长环境下的坛紫菜RNA-Seq数据（GenBank登录号为PRJNA572558、PRJNA566193、PRJNA283027、PRJNA510222、PRJNA428906、PRJNA386620和PRJNA503796）。
1. 2 HSP20基因家族成员鉴定
由于目前GenBank中尚缺乏相应的基因组注释信息和完整的蛋白序列，因此为了鉴定坛紫菜基因组中的HSP蛋白家族成员，首先须对坛紫菜基因组序列进行注释。使用EDTA分析流程找出基因组中转座元件等重复序列，并在基因组中标识出来（Ou et al.，2019），然后使用BRAKER2分析流程解析基因组，从中找出HSP20基因及其对应的蛋白序列（Hoff et al.，2019）。为了增加BRAKER2解析的准确性，利用不同生长阶段和不同生长环境下的坛紫菜RNA-Seq数据及OrthoDB数据库中所有红藻的直系同源蛋白进行基因结构信息解析（Kriventseva et al.，2019）。 获得坛紫菜所有蛋白氨基酸序列后，首先使用隐马尔可夫模型识别坛紫菜HSP20候选蛋白。以Pfam蛋白家族数据库中HSP20的HMM Profile（PF00011）作为查询序列（Punta et al.，2011），使用HMMER在坛紫菜的蛋白序列进行搜索（Eddy，2011）。然后使用BLASTp以拟南芥HSP20蛋白序列为参考序列在坛紫菜的蛋白序列进行搜索。从中筛选出E值≤1e-5的坛紫菜蛋白序列，去除冗余序列后，将蛋白序列提交至InterProScan进行结构域分析（Jones et al.，2014）。同时将蛋白序列提交至ExPASy（https：//web.expasy.org/compute_pi/）确定其分子量。将没有ACD（α-crystallin domain）结构域或分子量在12～43 kD范围之外的蛋白序列剔除，剩余序列即判定为坛紫菜HSP20蛋白（PhHSP20s）。
1. 3 HSP20家族蛋白系统进化分析
下载拟南芥、莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）、脐形紫菜（Porphyra umbilicalis）和大肠杆菌（Escherichia coli）的HSP20蛋白序列，结合鉴定出的PhHSP20s蛋白序列进行系统进化分析。其中，莱茵衣藻归属于绿藻，脐形紫菜归属于红藻。采用Clustal Omega进行多序列比对分析（Sievers et al.，2011），以FastTree的最大似然法（Maximum Likelihood）构建系统发育进化树（Price et al.，2010），并进行1000次的Bootstrap检验。
1. 4 HSP20家族基因启动子顺式作用元件分析
为了进一步研究PhHSP20s基因在非生物胁迫反应中的潜在调控机制，根据基因组注释结果，提取PhHSP20s基因的上游1.5 kb序列，然后提交至PlantCARE在线网站，以分析PhHSP20s基因启动子的顺式作用元件（Lescot et al.，2002）。
1. 5 HSP20家族基因表达分析
从GenBank中下载不同生长阶段和不同生长环境下的坛紫菜Illumina RNA-Seq数据，以研究PhHSP20s基因的表达模式。首先使用STAR进行有参比对（Dobin et al.，2013），获得全部转录本的表达量TPM值（Transcripts per million），然后提取PhHSP20s基因的表达量数据，并以log2进行转换，再使用MeV绘制聚类热图（Howe et al.，2011）。
2 结果与分析
2. 1 坛紫菜HSP20基因家族成员的鉴定结果
经HMMER和BLASTp搜索初步得到9个坛紫菜HSP20家族候选蛋白，从中剔除无ACD结构域或分子量在12～43 kD范围之外的候选成员，最终鉴定出8个PhHSP20s蛋白，根据分子量对其对应的编码基因进行命名，并综合基因组注释结果，提取PhHSP20s基因在基因组上的位置和内含子数目，结果如表1所示。坛紫菜基因组包含194条Scaffolds，有8个PhHSP20s基因不均匀地分布在其中的5条Scaffolds上。其中，有3个PhHSP20s基因（PhHSP19-1、PhHSP 19-2和PhHSP26）分布在SDUX01000006.1（Super-Scaffold 27）上，且这3个PhHSP20s基因位于相邻的基因间区域，具有成簇分布现象，推测串联重复是PhHSP20s基因家族扩展的因素之一。8个PhHSP20s基因的开放阅读框（ORF）长度为402～930 bp，均只含有1个外显子，无内含子，其编码蛋白的氨基酸残基数量为133～309个，分子量为13.7～31.9 kD，理论等电点（pI）为5.50～10.49，除PhHSP14、PhHSP28和PhHSP32蛋白外，其余5个PhHSP20s蛋白的pI均小于7.00，说明多数PhHSP20s蛋白为酸性。
2. 2 坛紫菜HSP20家族蛋白的系统进化分析结果
为了分析坛紫菜HSP20家族成员的亲缘关系和明确藻类与其他生物HSP20的亲缘关系，将8个PhHSP20s与5个脐形紫菜HSP20（PuHSP20s）、7个莱茵衣藻HSP20（CrHSP20s）、19个拟南芥HSP20（At-HSP20s）和2个大肠杆菌HSP20（E.coliHSP20s）蛋白的氨基酸序列构建系统发育进化树，结果（图1）显示大部分HSP20蛋白按物种分类地位聚类在一起，即陆生植物（拟南芥）、红藻（脐形紫菜和坛紫菜）和细菌（大肠杆菌）HSP20分别聚类为独立的一支，绿藻（莱茵衣藻）HSP20未聚类为独立的一支，而是聚类为2个分支，分别与陆生植物和红藻的HSP20聚类在一起;红藻HSP20蛋白（PhHSP20s和PuHSP20s）高度相似，亲缘关系最近，可分为2个小分支，每个小分支均含有PhHSP20s和PuHSP20s蛋白。PhHSP20s和PuHSP20s均與陆生植物HSP20的亲缘关系较远，二者不属于陆生植物中已报道过的任何HSP20亚族，故推测PhHSP20s和PuHSP20s构成HSP20家族的新亚族，其三维结构和功能尚待深入研究。
2. 3 HSP20家族基因启动子顺式作用元件分析结果
为了明确PhHSP20s基因潜在的调控机理，将其上游的1.5 kb序列提交至PlantCARE网站进行启动子顺式作用元件分析，结果显示，PhHSP20s基因启动子均含有CAAT-box、GC-motif和Sp1等通用作用元件。除这些通用作用元件外，PhHSP20s基因启动子区还含有一些非生物胁迫响应元件，如表2所示。所有PhHSP20s基因启动子均含有ABRE（脱落酸响应元件）、STRE（胁迫响应元件）和WRE3（损伤和防御响应元件），且大多数PhHSP20s基因启动子还含有DRE（干旱响应元件）、G-box（光调控元件）和MYB（MYB结合元件），表明PhHSP20s基因在坛紫菜生长发育和环境胁迫响应过程中发挥重要作用。 2. 4 坛紫菜HSP20家族基因的表达谱分析结果
基于RNA-Seq数据，用Mev绘制8个PhHSP20s基因在不同发育阶段、光质培养条件、失水胁迫和盐胁迫下的表达热图（图2）。除PhHSP32基因几乎在任何条件下均不表达外，其余的PhHSP20s基因至少在1种条件下高表达，且部分PhHSP20s基因表现出相似的表达模式。PhHSP19-2、PhHSP32、PhHSP14和PhHSP21基因在不同发育阶段的表达水平均较低，且无明显差异，PhHSP26、PhHSP28、PhHSP19-1和PhHSP16基因在生殖细胞发育阶段和单性生殖孢子发育期的表达水平较高（图2-A）。除PhHSP16和PhHSP19-1基因在红光下高表达外，不同光质对其余PhHSP20s基因表达无明显影响（图2-B）。除PhHSP32基因外，其余PhHSP20s基因在失水胁迫下的表达量均降低，复水后其表达水平恢复至胁迫前水平（图2-C）。此外，除PhHSP32基因外，其余PhHSP20s基因在低盐胁迫下高表达，而在高盐胁迫下低表达（图2-D）。综上所述，PhHSP20s基因參与坛紫菜的生长发育和非生物胁迫应答过程。
3 讨论
HSP20是一个古老蛋白家族，广泛分布于从细菌到高等动植物的绝大多数生物中，且成员众多。尽管远缘物种间HSP20蛋白序列及分子量（12～42 kD）差异明显，但均含有保守结构域ACD（张宁和姜晶，2017）。这些保守特征可用于不同物种HSP20家族新成员的鉴定，已从拟南芥中鉴定出19个成员（Scharf et al.，2001），从水稻（Oryza sativa）中鉴定出39个成员（Ouyang et al.，2009），从马铃薯（Solanum tuberosum）中鉴定出48个成员（Zhao et al.，2018）。本研究利用HSP20保守特征和高灵敏度的隐马尔可夫模型，从坛紫菜基因组中鉴定出8个PhHSP20s基因，明显少于上述陆生植物的HSP20基因家族成员数量。导致坛紫菜HSP20基因家族成员数量较少的原因可能是：（1）坛紫菜配子体有5条染色体（严兴洪等，2008），但组装出来的坛紫菜基因组有194条Scaffolds（Cao et al.，2020），即坛紫菜基因组组装不完整性，导致少量HSP20基因家族成员遗漏;（2）与坛紫菜的进化地位有关，通常生物越低等，其基因家族成员数量越少（Waters and Vierling，2020）。类似的现象在条斑紫菜（Pyropia yezoensis）、脐形紫菜、莱茵衣藻和温泉红藻（Cyanidioschyzon merolae）等藻类中也有发现，进一步证明其HSP20基因家族成员数量明显少于陆生植物的HSP20基因家族成员数量（Schroda，2004;Uji et al.，2019;Waters and Vierling，2020）。可见，坛紫菜HSP20基因家族成员数量与其进化地位相一致。
大量研究表明，陆生植物HSP20基因家族成员至少可划分为11个亚族，且不同陆生植物的同一亚族HSP20在系统发育进化树上形成单系群，同一陆生植物的不同亚族HSP20在系统发育进化树上形成旁系群，暗示不同物种同一亚族HSP20成员的亲缘关系较同一物种不同亚族HSP20成员的亲缘关系更近（Ouyang et al.，2009;张宁和姜晶，2017;Zhao et al.，2018;何福林和张斌，2019）。本研究也发现，红藻HSP20蛋白可分成2个分支，不同红藻同一分支HSP20蛋白的亲缘关系比同一红藻不同分支HSP20蛋白的亲缘关系更近。推测这2个分支的红藻HSP20蛋白不同于陆生植物HSP20亚族成员，与Uji等（2019）的研究结果一致，其原因可能是红藻HSP20基因复制事件发生在红藻与陆生植物分化事件之后，即HSP20基因复制事件独立地发生于陆生植物早期祖先和红藻早期祖先，且陆生植物早期祖先发生了更多次数的HSP20基因复制事件（Waters and Vierling，2020）。
HSP20是一类重要的蛋白，不仅参与胁迫响应，还参与植物正常的发育调控过程（张宁和姜晶，2017;李广隆等，2019）。为了预测坛紫菜HSP20家族基因可能参与的生物学过程，本研究分析PhHSP20s基因启动子的顺式作用元件，结果显示8个PhHSP20s基因启动子不仅含有保守的通用元件，还含有非生物胁迫响应元件，但不同启动子上所含元件不尽相同，说明PhHSP20s基因参与的生物学过程既有重叠又有区分。此外，本研究通过序列比对和表达谱分析发现，虽然PhHSP19-1和PhHSP19-2基因的核苷酸序列高度相似，且在基因组上紧密串联排列，但二者在不同生长阶段和非生物胁迫下表达水平差异明显，其原因可能是二者启动子所含的顺式作用元件存在差异所致。
尽管大量研究证实，HSP20广泛参与生物的胁迫响应过程，但本研究发现PhHSP20s基因在高盐胁迫和失水胁迫下呈下调表达或表达水平不变。类似的现象在番茄（Solanum lycopersicum）中也有发现，即在高盐和干旱胁迫下多数番茄HSP20基因（Sl-HSP20s）下调表达（俞佳虹，2017）。在高盐胁迫和失水胁迫下PhHSP20s基因下调表达，推测坛紫菜还具备其他的防御应答机制，比如隐生（Cryptobiosis）（周向红等，2013）等。可见，坛紫菜防御应答机理十分复杂，具体机理尚有待进一步探究。
4 结论
坛紫菜HSP20家族基因在基因数目、基因结构及系统进化上明显不同于陆生植物，推测HSP20基因复制事件在红藻和陆生植物分化之后独立发生，且在坛紫菜生长发育和非生物胁迫应答中发挥作用。
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（責任编辑 陈 燕）