评估胸椎黄韧带骨化患者韧带细胞的成骨潜能,并采用转录组高通量测序进一步分析差异基因表达。
方法选择2015年10月至2016年4月入院的10例胸椎黄韧带骨化患者(骨化组)与10例不伴胸椎黄韧带骨化的胸椎疾病患者(非骨化组),术中收集黄韧带标本行细胞培养,采用Flexcell FX-4000细胞应力加载系统对细胞施加周期性牵张应力来诱导成骨并检测两组细胞成骨指标的表达,再各纳入3例样本进行基因测序分析。
结果碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性染色镜下观察染色细胞数和面积半定量分析,以及ALP活性定量检测结果显示骨化组表达在0 h明显高于非骨化组(t=5.757,5.141,2.358,P<0.05),且随诱导成骨而增加,其中定量检测及染色面积的差异有统计学意义(F=6.464,P=0.003;F=17.35,P=0.000)。Real-time PCR结果显示骨化组ALP、骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein-2, BMP-2)及骨钙素(Osteocalcin,OCN)的表达水平在0 h、12 h和24 h几乎均高于非骨化组,且随诱导成骨而增加,除BMP-2和OCN在12 h外差异均有统计学意义。Western Blot结果显示各指标在两组的表达与Real-time PCR结果类似。而在各项检测中非骨化组各指标的表达均无明显变化。高通量测序结果显示骨化组出现671个上调基因和314个下调基因。在得到的基因本体功能分析(gene ontology terms, GO terms)中可发现22个上调基因富集到的与成骨相关的GO terms。
结论胸椎黄韧带骨化韧带细胞具有较高的成骨潜能,并明显表达成骨相关基因。差异表达基因L1RL1、PTHLH、DKK1、BMP6、SPP1和FGF1等可能与TOLF的成骨紧密相关。