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摘 要 聚合酶链反应(PCR)技术已广泛应用于临床诊断、公共卫生监测和动植物检验检疫等领域，因此建立PCR实验室，必须要按照相关的法规进行严格科学的管理。本文对疾病控制中心的PCR实验室的基因扩增检验实验室区域的设置、人员的管理和培训、污染及处理污染的措施、质量管理体系的建立及质量控制、样本的采集与处理、仪器设备的校准及保养维护、实验室安全等几方面的管理要素进行了分析，其目的是为临床检测和诊断提供更加科学和准确的报告。
关键词 聚合酶链反应 实验室 质量管理
doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2009.11.222
基因扩增检验实验室区域的设置
荧光PCR实验室设置是一个很规范的要求，应遵守相关法规进行实验室的设置。总的方针是各区独立，注意风向，因地制宜，方便工作。实验室装修应方便清洁，不应出现死角。荧光PCR实验室应分为：试剂储存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制和扩增区、扩增产物分析区。如使用全自动分析仪，区域可适当合并。各工作区域必须要有明确的标记，进入各工作区域严格按照单一方向进行，只能从试剂储存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制和扩增区、扩增产物分析区这样一个行程进行。最好做到专区专人，区内物品专用。各区应具备的设备配置：屋顶紫外灯、近台紫外灯、一次性手套、一次性鞋套、工作服、废液缸、扫帚、拖把、废纸篓、微量加样器覆盖1～1000L、经高压处理过的离心管和加样器吸头、笔、纸等，注意避免不同工作区域内的设备、物品混用。
人员的管理和培训
从事PCR实验室工作人员，应具备医学检验和微生物检验的基本知识，且是受过临床基因扩增实验室基础知识和技能的培训并获得上岗证书的人员。中心主任要亲自负责实验室全面管理、技术指导、解决与沟通技术疑难等问题。同时为了加强专业知识和技能的训练，中心要不定期外请专业人员进行培训和派送相关人员外出学习，做好后备人员的培养。要求PCR实验室人员定期写学术综述或经验总结，能够顺利地通过國家设立的定期考核。对PCR的原理、应用范围、局限性及发生污染的每一个环节要有充分的了解，熟悉操作规程，善于分析试验结果。要建立技术人员档案，做好对本室人员的管理。
污染及处理污染的措施
荧光PCR的污染分为实验前的污染和实验进行中的污染。实验前的污染是指实验材料的污染，主要是病人标本来源的核酸；而实验进行中的污染，通常实验过程中的每一步骤都可能发生对样本的污染。核酸的制备是较常产生污染的过程，荧光PCR反应进行过程中所涉及到的实验设备的任何部位，也是可能的污染源。而PCR产物是个高度危险的污染源，通常的阳性PCR产物含有大量的目标模板分子，极易泄露产生气溶胶污染整个实验室。在日常工作中需要加强对污染的监测，每次PCR实验务必做各种阴阳性对照。①阳性对照：阳性对照要选择扩增度中等、重复性好的模板进行，监测PCR反应是否成功且是否合乎理论要求。②标本对照：被检测的标本是血清就用鉴定后的正常血清作对照。③试剂对照：在PCR试剂中不加模板DNA或RNA，进行PCR扩增，以监测试剂及环境是否污染。有时轻微的气溶胶污染还需要复管试验、重复性试验等。所以实验室所有人员应充分认识预防污染的重要性，了解产生污染的原因，如：①标本间交叉污染。在核酸提取过程中一定要小心操作，防止飞溅，做好标记，避免样本间的交叉污染。配好反应液并加入待测核酸后，必须盖好反应管，要有明确的样品处理程序。②PCR试剂的污染。主要是由于在PCR试剂的配置过程中加样枪、容器、双蒸水及其他溶液被PCR核酸模板污染。③PCR扩增产物污染。主要是气溶胶污染，一定要选用质量好的离心管和反应管，避免试剂飞溅、外泄。同时必须要有高度的责任感，反应完毕后应及时把反应物清理掉，避免荧光PCR后的产物反应管在工作区内打开。
要避免污染，首先应是预防而不是排除污染。实验室工作区的严格划分的目的就是为了预防污染，工作区之间传递窗的设置，一方面方便了试剂、样品等在不同实验室区间的传递；另一方面也增加了交叉污染的危险，因此要定期对传递窗进行处理或用移动紫外灯照射。工作结束后必须立即对工作区进行清洁，用10%次氯酸钠擦拭，再用70%乙醇擦拭，然后再用可移动紫外灯调至实验台上60～90cm内过夜照射，可有效打断扩增产物。一旦污染发生，应立即进行清洁卫生、稀盐酸液擦拭或浸泡、通风疏散、紫外灯照射、酸雾处理等措施，尽快消除污染。也可选用不同区域的引物进行PCR扩增，尽快恢复正常工作状态。造成荧光PCR污染的原因很多也较复杂的，因此必须对荧光PCR实验室进行严格的科学管理。
质量管理体系的建立及质量控制
实验室质量管理体系包括三部分：即质量方针与宗旨、工作制度、标准操作文件(SOP)。基本内容也可概括为四句话“写你所应做的，做你所写的，记录你所做的和分析你所做的”。就是要写质量管理文件，并把实验室的工作文件化，写的要具体一些，让第一次接触该SOP的人，也能够按其完成相关操作。文件的编写是实验室验收工作最重的一个环节，所以在编写文件时要让每一个实验室的人员都参与，对所写的内容、程序和要求都知道，并能遵守执行。要做到这一点，除了严格的实验室管理制度外，关键是实验室负责人和实验技术人员的观念，要认识到SOP文件对质量保障的重要性。质量管理精髓是所有与实验室检验质量有关的环节全部要有章可循，按章进行。
质量控制包括两个方面，即室内质量控制和室间质量评价。室内质量控制(IQC)的目的是确保临床测定过程及结果在偏差和精密度方面达到预定的标准；室间质量控制(EQC)是将实验室测定情况与一室间和客观标准进行回顾性比较的数据。所有开展临床基因扩增实验的实验室，都必须参加由卫生部组织的全国临床基因扩增检验项目的室间质量评价，评价结果将作为其开展临床基因扩增实验的依据之一。临床标本制备处理和核酸提取方法的标准化、检测试剂和方法的标准化是室间控制的关键。应在常规工作的基础上，进行IQC以监测方法或者检测系统的稳定性，通过室内质控系统，使用质控品，确定质控标准，可以评价检验结果的精密度，结合室间质量评价(EQA)可以评价检验结果的准确性。通过有效的质量控制，充分运用实时荧光PCR技术的灵敏性、特异性和高效性，为临床检测和诊断提供科学和准确的报告，真正实现为患者及社会公共卫生监测服务的宗旨。
样本的采集与处理
常用于基因扩增检测的临床标本包括EDTA或者是枸橼酸钠抗凝全血或骨髓、血清或血浆、痰、CSF、尿及分泌物、各种食品样本等。标本的收集应在实验室工作区域之外进行，样本采集后应及时进行分离、微生物细菌培养等处理，暂不进行试验的样本应处于合适的温度条件下保存并明确保存期限，及时检测。对样本编号应有明确规定，保证编码的惟一性，不能有重复编号，样本资料信息登记要完整，方便查找。采血液样本时，应用一次性密闭容器。非密闭采集样本时，必须防止来自采样者的皮屑或分泌物的污染，采样时必须戴一次性手套、帽子。玻璃器皿在使用前应高压处理，可使核酸酶永久性失活。进行抗凝处理时，不能使用肝素抗凝，因肝素是Taq酶的强抑制剂。
仪器设备的校准及保养维护
仪器性能稳定调试校准，是试验操作的前提条件，加样枪应及时的校准及保养维护，PCR检测仪每年应由仪器厂家对仪器进行检修和校准；对冰箱和加热模板应每日记录其温度，有效地控制实验的条件；其他设备要经常清洁卫生，避免尘埃或核酸分子沉积。尘埃分子等对荧光反射有一定得影响，最好应避免在尘埃数过高的实验室内操作。及时升级或更新已老化的仪器设备，保证PCR检测实验结果的准确。
实验室安全
PCR实验室的安全包括实验室的生物防护、实验室的清洁、实验室污染的处理、实验废弃物的处理等。生物防护除了必备的口罩、帽子、手套、工作服外，还应具备洗眼瓶、75%酒精、眼罩、生物安全柜等设施，并制定紧急情况处理方案。如不慎将血液标本、体液标本或其他病原微生物溅到皮肤上，应立即用清水反复冲洗，接着用75%酒精棉签或含碘消毒棉签擦拭消毒，最后再用清水冲洗干净。要防止污物处理不规范、检验人员自我防护措施不严、日常消毒灭菌不能坚持、人员通行混乱、工作记录不全、实验方法未按SOP文件程序操作、质量控制未按要求执行等等。
基因扩增检验实验室的建设，不仅需要健全的实验室制度与实验室质量管理体系的建立，而且需要对各种有关条例、规范等的贯彻和实施，从而做到真正意义上的基因扩增检验实验室，这不仅可为公共卫生、临床及患者提供准确、公正、及时、有效的检测报告，也为今后实验室的发展打下了坚实的基础。
参考文献
1 申子瑜,李金明.临床基因扩增检验技术.北京:人民卫生出版社,2002:52.
2 李金明.临床PCR实验室的设计及质量管理体系的建立.标记免疫分析与临床,2007,14(增刊):24-26.
3 李金明.临床基因扩增检验实验室的规范化.解放军检验医学杂志.2002,1(2):99-100.
4 张伟民,王伯昌,夏晓华.82所临床基因扩增实验室复审结果和现状分析.浙江检验医学,2006,4(30):19-20.
关键词 聚合酶链反应 实验室 质量管理
doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2009.11.222
基因扩增检验实验室区域的设置
荧光PCR实验室设置是一个很规范的要求，应遵守相关法规进行实验室的设置。总的方针是各区独立，注意风向，因地制宜，方便工作。实验室装修应方便清洁，不应出现死角。荧光PCR实验室应分为：试剂储存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制和扩增区、扩增产物分析区。如使用全自动分析仪，区域可适当合并。各工作区域必须要有明确的标记，进入各工作区域严格按照单一方向进行，只能从试剂储存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制和扩增区、扩增产物分析区这样一个行程进行。最好做到专区专人，区内物品专用。各区应具备的设备配置：屋顶紫外灯、近台紫外灯、一次性手套、一次性鞋套、工作服、废液缸、扫帚、拖把、废纸篓、微量加样器覆盖1～1000L、经高压处理过的离心管和加样器吸头、笔、纸等，注意避免不同工作区域内的设备、物品混用。
人员的管理和培训
从事PCR实验室工作人员，应具备医学检验和微生物检验的基本知识，且是受过临床基因扩增实验室基础知识和技能的培训并获得上岗证书的人员。中心主任要亲自负责实验室全面管理、技术指导、解决与沟通技术疑难等问题。同时为了加强专业知识和技能的训练，中心要不定期外请专业人员进行培训和派送相关人员外出学习，做好后备人员的培养。要求PCR实验室人员定期写学术综述或经验总结，能够顺利地通过國家设立的定期考核。对PCR的原理、应用范围、局限性及发生污染的每一个环节要有充分的了解，熟悉操作规程，善于分析试验结果。要建立技术人员档案，做好对本室人员的管理。
污染及处理污染的措施
荧光PCR的污染分为实验前的污染和实验进行中的污染。实验前的污染是指实验材料的污染，主要是病人标本来源的核酸；而实验进行中的污染，通常实验过程中的每一步骤都可能发生对样本的污染。核酸的制备是较常产生污染的过程，荧光PCR反应进行过程中所涉及到的实验设备的任何部位，也是可能的污染源。而PCR产物是个高度危险的污染源，通常的阳性PCR产物含有大量的目标模板分子，极易泄露产生气溶胶污染整个实验室。在日常工作中需要加强对污染的监测，每次PCR实验务必做各种阴阳性对照。①阳性对照：阳性对照要选择扩增度中等、重复性好的模板进行，监测PCR反应是否成功且是否合乎理论要求。②标本对照：被检测的标本是血清就用鉴定后的正常血清作对照。③试剂对照：在PCR试剂中不加模板DNA或RNA，进行PCR扩增，以监测试剂及环境是否污染。有时轻微的气溶胶污染还需要复管试验、重复性试验等。所以实验室所有人员应充分认识预防污染的重要性，了解产生污染的原因，如：①标本间交叉污染。在核酸提取过程中一定要小心操作，防止飞溅，做好标记，避免样本间的交叉污染。配好反应液并加入待测核酸后，必须盖好反应管，要有明确的样品处理程序。②PCR试剂的污染。主要是由于在PCR试剂的配置过程中加样枪、容器、双蒸水及其他溶液被PCR核酸模板污染。③PCR扩增产物污染。主要是气溶胶污染，一定要选用质量好的离心管和反应管，避免试剂飞溅、外泄。同时必须要有高度的责任感，反应完毕后应及时把反应物清理掉，避免荧光PCR后的产物反应管在工作区内打开。
要避免污染，首先应是预防而不是排除污染。实验室工作区的严格划分的目的就是为了预防污染，工作区之间传递窗的设置，一方面方便了试剂、样品等在不同实验室区间的传递；另一方面也增加了交叉污染的危险，因此要定期对传递窗进行处理或用移动紫外灯照射。工作结束后必须立即对工作区进行清洁，用10%次氯酸钠擦拭，再用70%乙醇擦拭，然后再用可移动紫外灯调至实验台上60～90cm内过夜照射，可有效打断扩增产物。一旦污染发生，应立即进行清洁卫生、稀盐酸液擦拭或浸泡、通风疏散、紫外灯照射、酸雾处理等措施，尽快消除污染。也可选用不同区域的引物进行PCR扩增，尽快恢复正常工作状态。造成荧光PCR污染的原因很多也较复杂的，因此必须对荧光PCR实验室进行严格的科学管理。
质量管理体系的建立及质量控制
实验室质量管理体系包括三部分：即质量方针与宗旨、工作制度、标准操作文件(SOP)。基本内容也可概括为四句话“写你所应做的，做你所写的，记录你所做的和分析你所做的”。就是要写质量管理文件，并把实验室的工作文件化，写的要具体一些，让第一次接触该SOP的人，也能够按其完成相关操作。文件的编写是实验室验收工作最重的一个环节，所以在编写文件时要让每一个实验室的人员都参与，对所写的内容、程序和要求都知道，并能遵守执行。要做到这一点，除了严格的实验室管理制度外，关键是实验室负责人和实验技术人员的观念，要认识到SOP文件对质量保障的重要性。质量管理精髓是所有与实验室检验质量有关的环节全部要有章可循，按章进行。
质量控制包括两个方面，即室内质量控制和室间质量评价。室内质量控制(IQC)的目的是确保临床测定过程及结果在偏差和精密度方面达到预定的标准；室间质量控制(EQC)是将实验室测定情况与一室间和客观标准进行回顾性比较的数据。所有开展临床基因扩增实验的实验室，都必须参加由卫生部组织的全国临床基因扩增检验项目的室间质量评价，评价结果将作为其开展临床基因扩增实验的依据之一。临床标本制备处理和核酸提取方法的标准化、检测试剂和方法的标准化是室间控制的关键。应在常规工作的基础上，进行IQC以监测方法或者检测系统的稳定性，通过室内质控系统，使用质控品，确定质控标准，可以评价检验结果的精密度，结合室间质量评价(EQA)可以评价检验结果的准确性。通过有效的质量控制，充分运用实时荧光PCR技术的灵敏性、特异性和高效性，为临床检测和诊断提供科学和准确的报告，真正实现为患者及社会公共卫生监测服务的宗旨。
样本的采集与处理
常用于基因扩增检测的临床标本包括EDTA或者是枸橼酸钠抗凝全血或骨髓、血清或血浆、痰、CSF、尿及分泌物、各种食品样本等。标本的收集应在实验室工作区域之外进行，样本采集后应及时进行分离、微生物细菌培养等处理，暂不进行试验的样本应处于合适的温度条件下保存并明确保存期限，及时检测。对样本编号应有明确规定，保证编码的惟一性，不能有重复编号，样本资料信息登记要完整，方便查找。采血液样本时，应用一次性密闭容器。非密闭采集样本时，必须防止来自采样者的皮屑或分泌物的污染，采样时必须戴一次性手套、帽子。玻璃器皿在使用前应高压处理，可使核酸酶永久性失活。进行抗凝处理时，不能使用肝素抗凝，因肝素是Taq酶的强抑制剂。
仪器设备的校准及保养维护
仪器性能稳定调试校准，是试验操作的前提条件，加样枪应及时的校准及保养维护，PCR检测仪每年应由仪器厂家对仪器进行检修和校准；对冰箱和加热模板应每日记录其温度，有效地控制实验的条件；其他设备要经常清洁卫生，避免尘埃或核酸分子沉积。尘埃分子等对荧光反射有一定得影响，最好应避免在尘埃数过高的实验室内操作。及时升级或更新已老化的仪器设备，保证PCR检测实验结果的准确。
实验室安全
PCR实验室的安全包括实验室的生物防护、实验室的清洁、实验室污染的处理、实验废弃物的处理等。生物防护除了必备的口罩、帽子、手套、工作服外，还应具备洗眼瓶、75%酒精、眼罩、生物安全柜等设施，并制定紧急情况处理方案。如不慎将血液标本、体液标本或其他病原微生物溅到皮肤上，应立即用清水反复冲洗，接着用75%酒精棉签或含碘消毒棉签擦拭消毒，最后再用清水冲洗干净。要防止污物处理不规范、检验人员自我防护措施不严、日常消毒灭菌不能坚持、人员通行混乱、工作记录不全、实验方法未按SOP文件程序操作、质量控制未按要求执行等等。
基因扩增检验实验室的建设，不仅需要健全的实验室制度与实验室质量管理体系的建立，而且需要对各种有关条例、规范等的贯彻和实施，从而做到真正意义上的基因扩增检验实验室，这不仅可为公共卫生、临床及患者提供准确、公正、及时、有效的检测报告，也为今后实验室的发展打下了坚实的基础。
参考文献
1 申子瑜,李金明.临床基因扩增检验技术.北京:人民卫生出版社,2002:52.
2 李金明.临床PCR实验室的设计及质量管理体系的建立.标记免疫分析与临床,2007,14(增刊):24-26.
3 李金明.临床基因扩增检验实验室的规范化.解放军检验医学杂志.2002,1(2):99-100.
4 张伟民,王伯昌,夏晓华.82所临床基因扩增实验室复审结果和现状分析.浙江检验医学,2006,4(30):19-20.