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摘要 本文综述了转基因鸡的研究及应用，并介绍了3种常用的制备方法，包括外源基因受精卵注射、逆转录病毒介导转基因、利用慢病毒载体实现转基因的介入和导向，以期为转基因技术的应用提供参考。
关键词 转基因鸡；研究；应用；制备方法
中图分类号 S831 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2018）12-0229-02
转基因技术的研究虽然备受争议，但是由于其具有广阔的应用前景，近年来发展迅速。与哺乳动物相比，禽类具有特殊的生殖系统，因而家禽的转基因研究相对滞后。影响转基因家禽研制的关键因素在于表达载体的选择和外源基因的导入方式，这决定了转基因家禽的孵化率和转染率。本文对转基因鸡的制备技术作一综述，对转基因技术的合理应用具有重要意义。
1 转基因鸡的研究及应用
1.1 输卵管反应器的研究
利用动物体所具有的生物功能，在其体内经过生物自身的代谢，能够获得目标产物的细胞、组织器官的方法称之为动物生物反应器法[1-2]。生物反应器类型主要根据蛋白表达部位不同来划分，主要有血液、膀胱、唾液腺、乳腺、輸卵管等生物反应器[3]。乳腺和输卵管两大生物反应器的广泛应用受到了研究者们的高度关注。
干扰素、单克隆抗体等药用蛋白能够用于治疗人类疾病，通过生物反应器工业化生产的成本昂贵且耗时，加上产量又不高，无法满足临床医学的需求[4]。起初人们认为乳腺最有希望成为产生某些药用蛋白的生物反应器[5]，但结果发现，乳腺作为生物反应器也具有一定的缺陷，如哺乳动物世代间隔时间长，其中的乳蛋白和脂肪生化成分难以证实，重组蛋白的分离提纯耗费大且难度较大。而禽类大部分蛋白的糖基化与人类的较为接近，能避免乳腺中出现的许多问题[6]。由此，人类开启了对转基因禽类输卵管反应器的研究，希望能获得生产人类药用蛋白的新途径。
1.2 转基因鸡的应用
1.2.1 改良鸡的种质品质，提高产品质量。鸡肉营养丰富，蛋白质含量高，维生素含量丰富，鸡肉脂肪中含大量不饱和脂肪酸，易于消化吸收，是人类日常肉类食物的重要组成部分。鸡作为经济养殖动物在畜牧业中也最为常见，具有巨大的商业价值。转基因鸡能够改良鸡的种质品质，提高产品质量。
1.2.2 生产药用蛋白。转基因鸡作为生物反应器，主流的应用方向是生产药用蛋白。在利用哺乳动物细胞作为生物反应器表达部分人用药物蛋白时，常出现宿主细胞死亡率较高的现象，但如果选择鸡细胞作为宿主来表达，则对其正常的机体功能无任何损伤。与他家畜相比，鸡具有养殖成本较低、繁殖周期短、便于规模管理等特点，鸡的产蛋数量多、蛋白含量高，鸡蛋内部有天然无菌环境，蛋白分离提纯简单。对生物制药业来说，鸡输卵管生物反应器可以作为临床医学药用蛋白高效生产的理想途径。在转基因鸡的研究中，Kwon等[7]制备了促红细胞生成素，Daisuke等[8]制备了粒细胞集落刺激因子，Kyogoku等[9]制备了化肿瘤坏死因子的Fc受体融合蛋白等药物蛋白。
1.2.3 抗病育种。经过不断发展，在分子生物学、遗传生物学等领域和繁殖育种方面，动物转基因技术的应用越发成熟和普遍，这皆因转基因鸡能改善鸡的遗传性状。转基因鸡不仅可以改善鸡的机体性能，还可以提高新品种鸡的培育速度，提高饲料转化率，增加蛋鸡产蛋量，提升肉鸡质量，改变脂肪/肌肉比例等[10]。转基因鸡的成功制备能在一定程度上提高鸡对疾病的抵抗力。危害严重的鸡传染性疾病不仅给家禽养殖业带来经济损失，而且还会对人类的身体健康造成重大威胁。现如今，利用转基因技术培育的抗病物种具有诸多优点。一是转基因技术的应用将一些其他物种的抗性基因导入鸡的基因组中，不仅能打破物种隔阂，还可以定向诱导培育，大幅缩减繁殖育种时间；二是避免自然交配育种耗时长、筛选单一、获得目的性状的概率小等缺点；三是转基因技术的应用可避免在家禽疾病预防中疫苗的长期使用和滥用，以及给食物带来安全隐患等缺点。转基因技术现已是科学研究中常用的手段，为解决动物疾病问题开辟了新途径。例如，在2011年国外某研究所首次研发出对禽流感有一定抵抗力的转基因鸡[11]。
1.2.4 用作模型动物。在发育生物学模式动物中转基因鸡可充当重要角色，这是因为其来源广泛，取材容易，且可拥有很多常见的、已经被科学家成功定位的功能基因。如鸡的丝羽[12]、黄皮肤[13]以及鸡的巧瑰冠[14]等，通过基因敲除和基因表达等分子生物学技术以及试验进行验证，可将其用作研究鸟纲动物的模型动物。
1.3 转基因鸡研究中出现的问题
1.3.1 转基因鸡制作的方法问题。目前，利用实验动物进行转基因研究的效率普遍较低，而利用家畜的效率尤其低。加上在转基因禽类制作技术中，除了利用慢病毒法以外，其余的方法都不够完善。转基因鸡制备成功的报道较少，其中有些报道仅限于在胚胎中未能出雏，还有的是嵌合体鸡。应用前景较好的有慢病毒法、PGCs制作法，但其在操作技术上还有很大的改善空间。
1.3.2 在宿主染色体中转基因整合的行为问题。目前的外源基因容易导致内源性基因破坏、失活或激活处于关闭状态，因为在所有的转基因动物中插入宿主的染色体均是随机的，还有可能导致插入位点临近的染色体发生重排、缺失、重复或易位，其结果往往会导致出现转基因阳性个体、出雏后不育、胚胎死亡和四肢畸形等异常现象。
2 转基因鸡制备常用方法
2.1 外源基因受精卵注射
外源基因受精卵注射，即通过口吸管连接毛细玻璃针，在体式显微镜下向宿主动物受精卵中直接注入外源基因，外源基因通过受精卵分裂过程中的修复机制整合到宿主细胞基因组中，使其继续发育成转基因动物[15]。生产转基因动物常用的方法，其一便是外源基因新受精卵原核注射。
通过试验证明了利用受精卵显微注射法生产转基因家禽是可行的，但鸡具有特殊的生殖结构和生理特点，当新鲜鸡蛋刚排出时鸡胚已经发育，因而难以找到受精的原核，因为其一个卵子同时允许多个精子进入，而鸡受精卵的显微注射实际是胞质注射，主要过程是将外源基因注射到胞质中，由于成本较高，一般实验室不具备相关专业设备，同时对该技术的操作要求较高，导致这种方法的运用难以推广。 2.2 逆转录病毒介导转基因
逆转录病毒介导法的主要过程：将外源基因重组到逆转录病毒载体上；转染细胞产毒，收集后经超离心得到高浓度的病毒颗粒；将病毒液通过显微注射注入鸡的受精卵或胚盘中；通过病毒的作用，把外源基因整合到受精卵或胚盘干细胞基因组中。由于逆转录病毒具有强大的侵染能力，故能将外源基因融合导入宿主细胞染色体中，并能避免仅在特定部位注射，从而使该方法成为外源基因转移的理想途径[16]。
1986年，Salter等[17]以发育鸡胚的胚盘为注射部位，显微注入网织内皮增生病病毒（reticuloendotheliosis virus，RE-V），同时注入鸡重组白血病病毒（recombinat avian leucosis virus，re-ALV），得到的个体性成熟后继续繁育后代，在子代的基因组中检测到病毒基因组的序列，试验证明了病毒基因组能与鸡基因组发生融合。继而在1989年Bosselman等[18]通过向鸡胚中注射复制缺陷型病毒（replication defective virus），首次证实了该病毒可以将外源基因整合到雞的生殖细胞中，并且可遗传给后代。Harvey等[19]以缺陷型ALV为载体，获得了转基因鸡，通过CMV启动子驱动具有表达生物活性的β-内酰胺酶，在传至第4代后仍在后代的卵清蛋白和血清中检测到且其表达水平在不同子代中较接近。简而言之，诸多成功实例证明了逆转录病毒介导法在制备转基因鸡方面前景广阔。
2.3 利用慢病毒载体实现转基因的介入和导向
慢病毒载体具有特别的优点，即与逆转录病毒载体相比，首先其来源于慢病毒，并在此基础上发展成为一种基因操作方法。该方法拥有可感染分裂及非分裂期细胞的能力[20]，其他结构类型简单的病毒所缺乏的正是这项能力，再加上慢病毒载体对广泛的宿主都有感受性，因而对转基因操作而言是理想的工具。
刚开始部分研究小组成功获得转基因家禽，这主要是利用一些能导致肿瘤的病毒进行相关试验而得到的。然而在获得的家禽中有些会出现发育不表达，并常出现外源基因mRNA及蛋白表达效率偏低现象，导致了在后代中不容易检测。目前慢病毒载体作为一种新的逆转录病毒，其出现改变了这种现状。2007年，Lillico等成功制备了转基因鸡，在该转基因鸡的输卵管上皮细胞中能检测到人源化单克隆抗体ScFv-Fc和重组人IFN-β-1a蛋白。在我国，科研人员经过多年的努力，在运用慢病毒载体制备转基因鸡的研究中也取得了显著的成绩，Liu等[21]获得了输卵管特异性表达人防御素4转基因鸡，Cao等[22]获得了输卵管特异性表达人溶菌酶的转基因鸡。
目前，在转基因鸡的制备中慢病毒载体介导法的应用已经非常成熟，并且Jon等[23]成功实现了对禽流感传播的抑制，正是利用慢病毒载体获得的小干扰RNAs（siRNAs）证实的。在转基因鸡制备研究中，慢病毒载体的优点主要是其具有独特的灵活性，同时具有巨大的应用价值，并且在该领域占据了一定位置。
3 参考文献
[1] O′CALLAGHAN P M，JAMES D C.Systems biotechnology of mammalian cell factories.[J].Briefings in Functional Genomics
关键词 转基因鸡；研究；应用；制备方法
中图分类号 S831 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2018）12-0229-02
转基因技术的研究虽然备受争议，但是由于其具有广阔的应用前景，近年来发展迅速。与哺乳动物相比，禽类具有特殊的生殖系统，因而家禽的转基因研究相对滞后。影响转基因家禽研制的关键因素在于表达载体的选择和外源基因的导入方式，这决定了转基因家禽的孵化率和转染率。本文对转基因鸡的制备技术作一综述，对转基因技术的合理应用具有重要意义。
1 转基因鸡的研究及应用
1.1 输卵管反应器的研究
利用动物体所具有的生物功能，在其体内经过生物自身的代谢，能够获得目标产物的细胞、组织器官的方法称之为动物生物反应器法[1-2]。生物反应器类型主要根据蛋白表达部位不同来划分，主要有血液、膀胱、唾液腺、乳腺、輸卵管等生物反应器[3]。乳腺和输卵管两大生物反应器的广泛应用受到了研究者们的高度关注。
干扰素、单克隆抗体等药用蛋白能够用于治疗人类疾病，通过生物反应器工业化生产的成本昂贵且耗时，加上产量又不高，无法满足临床医学的需求[4]。起初人们认为乳腺最有希望成为产生某些药用蛋白的生物反应器[5]，但结果发现，乳腺作为生物反应器也具有一定的缺陷，如哺乳动物世代间隔时间长，其中的乳蛋白和脂肪生化成分难以证实，重组蛋白的分离提纯耗费大且难度较大。而禽类大部分蛋白的糖基化与人类的较为接近，能避免乳腺中出现的许多问题[6]。由此，人类开启了对转基因禽类输卵管反应器的研究，希望能获得生产人类药用蛋白的新途径。
1.2 转基因鸡的应用
1.2.1 改良鸡的种质品质，提高产品质量。鸡肉营养丰富，蛋白质含量高，维生素含量丰富，鸡肉脂肪中含大量不饱和脂肪酸，易于消化吸收，是人类日常肉类食物的重要组成部分。鸡作为经济养殖动物在畜牧业中也最为常见，具有巨大的商业价值。转基因鸡能够改良鸡的种质品质，提高产品质量。
1.2.2 生产药用蛋白。转基因鸡作为生物反应器，主流的应用方向是生产药用蛋白。在利用哺乳动物细胞作为生物反应器表达部分人用药物蛋白时，常出现宿主细胞死亡率较高的现象，但如果选择鸡细胞作为宿主来表达，则对其正常的机体功能无任何损伤。与他家畜相比，鸡具有养殖成本较低、繁殖周期短、便于规模管理等特点，鸡的产蛋数量多、蛋白含量高，鸡蛋内部有天然无菌环境，蛋白分离提纯简单。对生物制药业来说，鸡输卵管生物反应器可以作为临床医学药用蛋白高效生产的理想途径。在转基因鸡的研究中，Kwon等[7]制备了促红细胞生成素，Daisuke等[8]制备了粒细胞集落刺激因子，Kyogoku等[9]制备了化肿瘤坏死因子的Fc受体融合蛋白等药物蛋白。
1.2.3 抗病育种。经过不断发展，在分子生物学、遗传生物学等领域和繁殖育种方面，动物转基因技术的应用越发成熟和普遍，这皆因转基因鸡能改善鸡的遗传性状。转基因鸡不仅可以改善鸡的机体性能，还可以提高新品种鸡的培育速度，提高饲料转化率，增加蛋鸡产蛋量，提升肉鸡质量，改变脂肪/肌肉比例等[10]。转基因鸡的成功制备能在一定程度上提高鸡对疾病的抵抗力。危害严重的鸡传染性疾病不仅给家禽养殖业带来经济损失，而且还会对人类的身体健康造成重大威胁。现如今，利用转基因技术培育的抗病物种具有诸多优点。一是转基因技术的应用将一些其他物种的抗性基因导入鸡的基因组中，不仅能打破物种隔阂，还可以定向诱导培育，大幅缩减繁殖育种时间；二是避免自然交配育种耗时长、筛选单一、获得目的性状的概率小等缺点；三是转基因技术的应用可避免在家禽疾病预防中疫苗的长期使用和滥用，以及给食物带来安全隐患等缺点。转基因技术现已是科学研究中常用的手段，为解决动物疾病问题开辟了新途径。例如，在2011年国外某研究所首次研发出对禽流感有一定抵抗力的转基因鸡[11]。
1.2.4 用作模型动物。在发育生物学模式动物中转基因鸡可充当重要角色，这是因为其来源广泛，取材容易，且可拥有很多常见的、已经被科学家成功定位的功能基因。如鸡的丝羽[12]、黄皮肤[13]以及鸡的巧瑰冠[14]等，通过基因敲除和基因表达等分子生物学技术以及试验进行验证，可将其用作研究鸟纲动物的模型动物。
1.3 转基因鸡研究中出现的问题
1.3.1 转基因鸡制作的方法问题。目前，利用实验动物进行转基因研究的效率普遍较低，而利用家畜的效率尤其低。加上在转基因禽类制作技术中，除了利用慢病毒法以外，其余的方法都不够完善。转基因鸡制备成功的报道较少，其中有些报道仅限于在胚胎中未能出雏，还有的是嵌合体鸡。应用前景较好的有慢病毒法、PGCs制作法，但其在操作技术上还有很大的改善空间。
1.3.2 在宿主染色体中转基因整合的行为问题。目前的外源基因容易导致内源性基因破坏、失活或激活处于关闭状态，因为在所有的转基因动物中插入宿主的染色体均是随机的，还有可能导致插入位点临近的染色体发生重排、缺失、重复或易位，其结果往往会导致出现转基因阳性个体、出雏后不育、胚胎死亡和四肢畸形等异常现象。
2 转基因鸡制备常用方法
2.1 外源基因受精卵注射
外源基因受精卵注射，即通过口吸管连接毛细玻璃针，在体式显微镜下向宿主动物受精卵中直接注入外源基因，外源基因通过受精卵分裂过程中的修复机制整合到宿主细胞基因组中，使其继续发育成转基因动物[15]。生产转基因动物常用的方法，其一便是外源基因新受精卵原核注射。
通过试验证明了利用受精卵显微注射法生产转基因家禽是可行的，但鸡具有特殊的生殖结构和生理特点，当新鲜鸡蛋刚排出时鸡胚已经发育，因而难以找到受精的原核，因为其一个卵子同时允许多个精子进入，而鸡受精卵的显微注射实际是胞质注射，主要过程是将外源基因注射到胞质中，由于成本较高，一般实验室不具备相关专业设备，同时对该技术的操作要求较高，导致这种方法的运用难以推广。 2.2 逆转录病毒介导转基因
逆转录病毒介导法的主要过程：将外源基因重组到逆转录病毒载体上；转染细胞产毒，收集后经超离心得到高浓度的病毒颗粒；将病毒液通过显微注射注入鸡的受精卵或胚盘中；通过病毒的作用，把外源基因整合到受精卵或胚盘干细胞基因组中。由于逆转录病毒具有强大的侵染能力，故能将外源基因融合导入宿主细胞染色体中，并能避免仅在特定部位注射，从而使该方法成为外源基因转移的理想途径[16]。
1986年，Salter等[17]以发育鸡胚的胚盘为注射部位，显微注入网织内皮增生病病毒（reticuloendotheliosis virus，RE-V），同时注入鸡重组白血病病毒（recombinat avian leucosis virus，re-ALV），得到的个体性成熟后继续繁育后代，在子代的基因组中检测到病毒基因组的序列，试验证明了病毒基因组能与鸡基因组发生融合。继而在1989年Bosselman等[18]通过向鸡胚中注射复制缺陷型病毒（replication defective virus），首次证实了该病毒可以将外源基因整合到雞的生殖细胞中，并且可遗传给后代。Harvey等[19]以缺陷型ALV为载体，获得了转基因鸡，通过CMV启动子驱动具有表达生物活性的β-内酰胺酶，在传至第4代后仍在后代的卵清蛋白和血清中检测到且其表达水平在不同子代中较接近。简而言之，诸多成功实例证明了逆转录病毒介导法在制备转基因鸡方面前景广阔。
2.3 利用慢病毒载体实现转基因的介入和导向
慢病毒载体具有特别的优点，即与逆转录病毒载体相比，首先其来源于慢病毒，并在此基础上发展成为一种基因操作方法。该方法拥有可感染分裂及非分裂期细胞的能力[20]，其他结构类型简单的病毒所缺乏的正是这项能力，再加上慢病毒载体对广泛的宿主都有感受性，因而对转基因操作而言是理想的工具。
刚开始部分研究小组成功获得转基因家禽，这主要是利用一些能导致肿瘤的病毒进行相关试验而得到的。然而在获得的家禽中有些会出现发育不表达，并常出现外源基因mRNA及蛋白表达效率偏低现象，导致了在后代中不容易检测。目前慢病毒载体作为一种新的逆转录病毒，其出现改变了这种现状。2007年，Lillico等成功制备了转基因鸡，在该转基因鸡的输卵管上皮细胞中能检测到人源化单克隆抗体ScFv-Fc和重组人IFN-β-1a蛋白。在我国，科研人员经过多年的努力，在运用慢病毒载体制备转基因鸡的研究中也取得了显著的成绩，Liu等[21]获得了输卵管特异性表达人防御素4转基因鸡，Cao等[22]获得了输卵管特异性表达人溶菌酶的转基因鸡。
目前，在转基因鸡的制备中慢病毒载体介导法的应用已经非常成熟，并且Jon等[23]成功实现了对禽流感传播的抑制，正是利用慢病毒载体获得的小干扰RNAs（siRNAs）证实的。在转基因鸡制备研究中，慢病毒载体的优点主要是其具有独特的灵活性，同时具有巨大的应用价值，并且在该领域占据了一定位置。
3 参考文献
[1] O′CALLAGHAN P M，JAMES D C.Systems biotechnology of mammalian cell factories.[J].Briefings in Functional Genomics