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摘 要 目的：观察基质金属蛋白酶-7(MMP-7)蛋白在鼻咽癌中的表达及与肿瘤侵袭转移的关系。方法：采用成组设计的对照试验方法，运用免疫组化及逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术，检测MMP-7蛋白及mRNA在鼻咽癌及慢性鼻咽炎组织中的表达。使用方差分析、q检验、t检验和X2检验进行组间差异的统计学分析。结果：MMP-7蛋白在鼻咽癌中的阳性表达率为79.17%，明显高于在慢性鼻咽炎中的表达率11.11%(P＜0.001)；MMP-7 mRNA在鼻咽癌中的阳性表达率为89.58%，表达量为0.467±0.199，显著高于在慢性鼻咽炎组织中的表达率16.67%(P＜0.001)；MMP-7蛋白及mRNA的表达与鼻咽癌患者的性别、年龄无关，与鼻咽癌的T分期、N分期及临床分期密切相关(P＜0.05)。结论：MMP-7在鼻咽癌中阳性表达率高，其表达随着肿瘤浸润深度、区域淋巴结转移范围和临床分期的增加而增强，与鼻咽癌侵袭及转移密切相关。
关键词 鼻咽癌 肿瘤侵袭与转移 基质蛋白酶-7
鼻咽癌(NPC)是我国常见的头颈部恶性肿瘤，尤以中南各省高发，俗称为“广东瘤”。由于鼻咽癌是一种低分化、高转移性恶性肿瘤，其治疗失败的主要原因仍然为局部区域性复发与远处转移，因而侵袭和转移仍是导致鼻咽癌患者死亡的主要原因［1］。基质金属蛋白酶-7(MMP-7)作为MMP家族中较为重要的基质降解素，已经发现其表达与消化道等恶性肿瘤的浸润与转移相关。我们检测了MMP-7蛋白在鼻咽癌中表达水平，并探讨其表达与肿瘤侵袭转移的关系，旨在发现有预示作用的生物分子指标。现将实验结果报告如下。
资料与方法
随机选取2005年5月～2005年9月广东医学院附属医院耳鼻咽喉-头颈外科就诊的鼻咽癌病例48例。采用卫生部组织编写的《鼻咽癌诊治标准》第5版为病理组织学分型标准［2］，全国鼻咽癌分期专题研讨会(福州，1992年)推荐的临床分期方法为临床分期标准［3］。纳入标准：①根据临床表现初步判定为鼻咽癌；②鼻咽原发癌组织活检病理确诊为鼻咽癌；③均行鼻咽部CT扫描明确肿瘤病灶范围；④所有病例均为初诊患者，未行放疗或化疗治疗。48例鼻咽癌病例中，男34例，女14例，年龄47.63±13.58；临床分期情况：Ⅰ期4例，Ⅱ期19例，Ⅲ期15例，Ⅳ期10例，其中T1 9例，T2 15例，T3 14例，T4 10例，N0 14例，N1 21例，N2 12例，N3 1例。经病理组织学检查，48例鼻咽癌均为低分化鳞状细胞癌。选取同期就诊行鼻咽部活检，并最终病理诊断为慢性黏膜炎症的慢性鼻咽炎病例18例，作为对照组。
试剂與方法：①试剂采用SP-9000通用试剂盒、鼠抗人MMP-7单克隆抗体。RNA抽提试剂Trizol，一步法RT-PCR试剂盒，PCR引物(序列见表1)。②标本制备：于鼻内镜直视下钳取鼻咽部病变组织，将所取标本一部分置于中性福尔马林液中固定，经脱水、透明、浸蜡后石蜡包埋保存，备用于免疫组化实验。另取一部分标本保存于-70℃低温冰箱中(所取标本质量≥300mg，并于取材后10分钟内置于低温冰箱内)，以备用于RT-PCR实验。实验物品去核糖核酸酶(RNase)处理。③免疫组化染色检测方法：手术切除标本用10%甲醛固定，经脱水、透明、浸蜡后石蜡包埋保存。实验前制成厚4μm连续石蜡切片，采用免疫组化SP法进行切片染色，染色步骤按照试剂盒及一抗说明书要求进行。用PBS液代替一抗作为阴性对照。结果由两位观察者采取盲法进行读片。把制好的切片放于显微镜下观察，正常组织取黏膜上3个高倍区域(×200)，癌组织选取癌细胞丰富的3个高倍区域(×200)。MMP-7在正常组织中一般不表达，在肿瘤细胞组织中可见细胞浆内棕黄染色，根据计算法［4］评定MMP-7阳性结果。④RT-PCR检测方法：a.抽提RNA：采用Trizol一步法抽提RNA，经紫外分光光度计验证后调整RNA浓度为1g/L后作RT-PCR反应。b.一步法RT-PCR反应：RT-PCR反应体系包括10×One Step RNA PCR Buffer 5μl、MgCl2 (25mM) 10μl、dNTP Mixture (10 mM) 5μl、RNase Inhibitor (40 U/μl) 1μl、AMV RTase XL (5 U/μl) 1μl、AMV-Ptimized Taq (5 U/μl) 1μl、上下游特异性引物 (20 μM)各1μl、实验样品(1μg Total RNA) 1μl、RNase Free dH2O 24μl。反应条件为50℃ 30分钟、94℃ 2 分钟、94℃ 30秒、52℃(为MMP-7的退火温度，GAPDH的退火温度分别为55℃)30秒、72℃1分钟(PCR 反应共35Cycle)，最后72℃延10分钟。c.PCR产物的半定量分析：扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭(EB)染色后在紫外灯下观察、凝胶成像系统拍照成像。凝胶在UVP凝胶成像分析系统中扫描，用BandScan4.5图形分析处理系统分析电泳带灰度，计算特异性MMP-7扩增带灰度与GAPDH扩增带灰度之比值，即表示MMP-7mRNA相对表达量。
统计学方法：所有数据录入SAS9.0系统，运用行列表资料X2检验进行MMP-7表达的组间差异比较、直线回归分析进行相关性分析。
结 果
MMP-7在鼻咽癌组织中的表达情况：MMP-7蛋白阳性产物定位于鼻咽癌细胞胞浆，呈淡黄色、棕黄色、棕褐色不同强度染色，肿瘤细胞周围正常细胞无表达。MMP-7在鼻咽癌组织中的阳性表达率为79.17%(38/48)，慢性鼻咽炎的鼻咽上皮细胞中的阳性表达率为11.11%(2/18)，且均为弱表达。MMP-7在鼻咽癌及慢性鼻咽炎组织中蛋白表达水平的差异比较，结果X2值为26.818，P＜0.001。鼻咽癌原发灶中MMP-7的表达与患者性别、年龄无关，与肿瘤浸润深度、淋巴结转移范围及临床分期密切相关(P＜0.05)，见表2。
MMP-7 mRNA在鼻咽癌组织中的表达水平：48例鼻咽癌组织中，43例MMP-7呈阳性表达，阳性表达率为89.58%，表达量为0.467±0.199；18例慢性鼻咽炎中，仅有3例表达MMP-7 mRNA，阳性表达率为16.67%，表达量分别为0.112、0.095、0.103。MMP-7在鼻咽癌及慢性鼻咽炎组织中蛋白表达水平的差异比较，X2=32.672，P＜0.001。鼻咽癌原发灶中MMP-7mRNA的表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移范围及临床分期密切相关(P＜0.05)，而与患者的性别及年龄无关。详见表3。
讨 论
从组织学的角度分析，鼻咽癌绝大部分(95%以上)属于恶性度高的未分化或低分化癌，癌细胞易于扩散转移。据文献报道，鼻咽癌的颈淋巴结转移率高达60.3%～81.6%［5］。肿瘤的形成与发展除与细胞自身基因突变所导致的原癌基因激活或抑癌基因失活有关外，还受肿瘤细胞所处微环境变化的影响。细胞外基质(ECM)作为维持细胞微环境内稳态的物质基础，决定着胞外刺激信号的性质、强度与时空性。近年研究发现，基质金属蛋白酶家族(MMPs)几乎可以降解ECM的全部组分，因而ECM的变化受MMPs的调节。MMP-7亦称基质溶解素(matrilysin)，由于羧基端缺乏类血红素结合蛋白区，为MMPs中分子量最小的成员。MMP-7主要由纤维母细胞、巨噬细胞、肿瘤细胞分泌，能降解ECM的弹性蛋白、明胶、Ⅳ型胶原纤维、层黏素(LM)、纤维蛋白(FN)等多种成分，为肿瘤细胞扩散提供通道，并通过打破肿瘤细胞间牢固的粘附作用，而促使肿瘤细胞游走，脱离原发瘤而进入周围组织和血管。由于鼻咽癌原发灶解剖位置深在，并以放疗为主要治疗手段，因而我们的实验以T分期作为判断肿瘤浸润深度的指标。通过鼻咽癌组织切片的免疫组化实验，观察到MMP-7蛋白主要表达于肿瘤细胞，小部分位于肿瘤浸润边缘的间质中，并以癌巢扩散前沿(invasive front)的肿瘤细胞表达最为明显，其在鼻咽癌原发灶中浸润前沿的癌细胞MMP-7蛋白的表达量明显高于癌巢中心区域。运用行列表资料X2检验的关联性分析，结果提示MMP-7蛋白表达与鼻咽癌患者性别、年龄无关(X2＝5.324、1.202，P＞0.05)；不同浸润深度、区域淋巴结转移范围和临床分期的鼻咽癌标本之间MMP-7蛋白表达水平的差异有统计学意义(其相应的X2值为17.012、23.927、20.748，均P＜0.05)，根据各组间数据分布的特点，我们可以推断MMP-7蛋白表达水平随着鼻咽癌浸润深度、淋巴结转移范围的增加而升高，与鼻咽癌侵袭转移能力密切相关；同时较之鼻咽癌早期，进展期有更高的MMP-7蛋白表达。
同时，为了更全面诠释MMP-7在鼻咽癌中的表达情况，我们还从基因水平检测MMP-7 mRNA的表达水平。RT-PCR半定量分析的结果表明，鼻咽癌组MMP-7 mRNA的表达阳性率为89.58%，显著高于慢性鼻咽炎组的16.67%(X2=32.955，P＜0.001)。鼻咽癌组中mRNA的表达水平与患者性别及年龄无关；但是mRNA的表达量随着T分期的升高呈梯度递增，经T分期组内两两比较的q检验，显示T1的表达量明显低于 T3、T4，T2 亦低于T4，而T1与T2，T2与T3，T3与T4之间的差异无统计学意义(P>0.05)，这可能是因为相邻的两组间肿瘤浸润深度的差异相对较小，或者该实验的样本含量偏少所致。RT-PCR分析的结果还提示MMP-7 mRNA的表达水平随N分期的升高呈递增趋势，各N分
期间的差异有统计学意义(P＜0.05)；并且进展期癌的表达量显著高于早期癌。RT-PCR实验中所有鼻咽癌各处理因素的组间比较的差异性与免疫组化的结果相近，说明MMP-7蛋白的表达情况与基因转录水平一致，MMP-7与鼻咽癌的侵袭及转移呈正相关关系。
以上实验证实MMP-7的表达与鼻咽癌侵袭转移密切相关，高表达MMP-7的鼻咽癌有更强的恶性能力。因此，MMP-7的表达可以作为预测鼻咽癌恶性程度的生物指标，对于高表达MMP-7的鼻咽癌病例应采取更为积极的治疗方案，必要时于术后辅予放化疗，并加强随访，以减少放疗后区域复发和远处转移，延长患者生存时间。
参考文献
1 华贻军，洪明晃，罗东华，等.406例鼻咽癌患者预后多因素分析.中国肿瘤临床.2005，32(8)：435-438.
2 宗永生.鼻咽癌组织学诊断.见：闵华庆，潘国英，宗永生，主编.鼻咽癌诊治标准.第5版.北京：北京医科大学、协和医科大学联合出版社，1991.
3 刘泰福，徐国镇.全国鼻咽癌会议纪要.中华放射肿瘤杂志，1992，1(4)：204-209.
4 夏铁安.肿瘤标志物诊断.见：夏同礼，主编.肿瘤物检诊断.第1版.北京：人民卫生出版社，2002：98.
5 闵华庆，鼻咽癌.见：张天泽，徐光炜，主编.肿瘤学.第1版.天津：天津科技出版社，1994：1071-1093.
关键词 鼻咽癌 肿瘤侵袭与转移 基质蛋白酶-7
鼻咽癌(NPC)是我国常见的头颈部恶性肿瘤，尤以中南各省高发，俗称为“广东瘤”。由于鼻咽癌是一种低分化、高转移性恶性肿瘤，其治疗失败的主要原因仍然为局部区域性复发与远处转移，因而侵袭和转移仍是导致鼻咽癌患者死亡的主要原因［1］。基质金属蛋白酶-7(MMP-7)作为MMP家族中较为重要的基质降解素，已经发现其表达与消化道等恶性肿瘤的浸润与转移相关。我们检测了MMP-7蛋白在鼻咽癌中表达水平，并探讨其表达与肿瘤侵袭转移的关系，旨在发现有预示作用的生物分子指标。现将实验结果报告如下。
资料与方法
随机选取2005年5月～2005年9月广东医学院附属医院耳鼻咽喉-头颈外科就诊的鼻咽癌病例48例。采用卫生部组织编写的《鼻咽癌诊治标准》第5版为病理组织学分型标准［2］，全国鼻咽癌分期专题研讨会(福州，1992年)推荐的临床分期方法为临床分期标准［3］。纳入标准：①根据临床表现初步判定为鼻咽癌；②鼻咽原发癌组织活检病理确诊为鼻咽癌；③均行鼻咽部CT扫描明确肿瘤病灶范围；④所有病例均为初诊患者，未行放疗或化疗治疗。48例鼻咽癌病例中，男34例，女14例，年龄47.63±13.58；临床分期情况：Ⅰ期4例，Ⅱ期19例，Ⅲ期15例，Ⅳ期10例，其中T1 9例，T2 15例，T3 14例，T4 10例，N0 14例，N1 21例，N2 12例，N3 1例。经病理组织学检查，48例鼻咽癌均为低分化鳞状细胞癌。选取同期就诊行鼻咽部活检，并最终病理诊断为慢性黏膜炎症的慢性鼻咽炎病例18例，作为对照组。
试剂與方法：①试剂采用SP-9000通用试剂盒、鼠抗人MMP-7单克隆抗体。RNA抽提试剂Trizol，一步法RT-PCR试剂盒，PCR引物(序列见表1)。②标本制备：于鼻内镜直视下钳取鼻咽部病变组织，将所取标本一部分置于中性福尔马林液中固定，经脱水、透明、浸蜡后石蜡包埋保存，备用于免疫组化实验。另取一部分标本保存于-70℃低温冰箱中(所取标本质量≥300mg，并于取材后10分钟内置于低温冰箱内)，以备用于RT-PCR实验。实验物品去核糖核酸酶(RNase)处理。③免疫组化染色检测方法：手术切除标本用10%甲醛固定，经脱水、透明、浸蜡后石蜡包埋保存。实验前制成厚4μm连续石蜡切片，采用免疫组化SP法进行切片染色，染色步骤按照试剂盒及一抗说明书要求进行。用PBS液代替一抗作为阴性对照。结果由两位观察者采取盲法进行读片。把制好的切片放于显微镜下观察，正常组织取黏膜上3个高倍区域(×200)，癌组织选取癌细胞丰富的3个高倍区域(×200)。MMP-7在正常组织中一般不表达，在肿瘤细胞组织中可见细胞浆内棕黄染色，根据计算法［4］评定MMP-7阳性结果。④RT-PCR检测方法：a.抽提RNA：采用Trizol一步法抽提RNA，经紫外分光光度计验证后调整RNA浓度为1g/L后作RT-PCR反应。b.一步法RT-PCR反应：RT-PCR反应体系包括10×One Step RNA PCR Buffer 5μl、MgCl2 (25mM) 10μl、dNTP Mixture (10 mM) 5μl、RNase Inhibitor (40 U/μl) 1μl、AMV RTase XL (5 U/μl) 1μl、AMV-Ptimized Taq (5 U/μl) 1μl、上下游特异性引物 (20 μM)各1μl、实验样品(1μg Total RNA) 1μl、RNase Free dH2O 24μl。反应条件为50℃ 30分钟、94℃ 2 分钟、94℃ 30秒、52℃(为MMP-7的退火温度，GAPDH的退火温度分别为55℃)30秒、72℃1分钟(PCR 反应共35Cycle)，最后72℃延10分钟。c.PCR产物的半定量分析：扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭(EB)染色后在紫外灯下观察、凝胶成像系统拍照成像。凝胶在UVP凝胶成像分析系统中扫描，用BandScan4.5图形分析处理系统分析电泳带灰度，计算特异性MMP-7扩增带灰度与GAPDH扩增带灰度之比值，即表示MMP-7mRNA相对表达量。
统计学方法：所有数据录入SAS9.0系统，运用行列表资料X2检验进行MMP-7表达的组间差异比较、直线回归分析进行相关性分析。
结 果
MMP-7在鼻咽癌组织中的表达情况：MMP-7蛋白阳性产物定位于鼻咽癌细胞胞浆，呈淡黄色、棕黄色、棕褐色不同强度染色，肿瘤细胞周围正常细胞无表达。MMP-7在鼻咽癌组织中的阳性表达率为79.17%(38/48)，慢性鼻咽炎的鼻咽上皮细胞中的阳性表达率为11.11%(2/18)，且均为弱表达。MMP-7在鼻咽癌及慢性鼻咽炎组织中蛋白表达水平的差异比较，结果X2值为26.818，P＜0.001。鼻咽癌原发灶中MMP-7的表达与患者性别、年龄无关，与肿瘤浸润深度、淋巴结转移范围及临床分期密切相关(P＜0.05)，见表2。
MMP-7 mRNA在鼻咽癌组织中的表达水平：48例鼻咽癌组织中，43例MMP-7呈阳性表达，阳性表达率为89.58%，表达量为0.467±0.199；18例慢性鼻咽炎中，仅有3例表达MMP-7 mRNA，阳性表达率为16.67%，表达量分别为0.112、0.095、0.103。MMP-7在鼻咽癌及慢性鼻咽炎组织中蛋白表达水平的差异比较，X2=32.672，P＜0.001。鼻咽癌原发灶中MMP-7mRNA的表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移范围及临床分期密切相关(P＜0.05)，而与患者的性别及年龄无关。详见表3。
讨 论
从组织学的角度分析，鼻咽癌绝大部分(95%以上)属于恶性度高的未分化或低分化癌，癌细胞易于扩散转移。据文献报道，鼻咽癌的颈淋巴结转移率高达60.3%～81.6%［5］。肿瘤的形成与发展除与细胞自身基因突变所导致的原癌基因激活或抑癌基因失活有关外，还受肿瘤细胞所处微环境变化的影响。细胞外基质(ECM)作为维持细胞微环境内稳态的物质基础，决定着胞外刺激信号的性质、强度与时空性。近年研究发现，基质金属蛋白酶家族(MMPs)几乎可以降解ECM的全部组分，因而ECM的变化受MMPs的调节。MMP-7亦称基质溶解素(matrilysin)，由于羧基端缺乏类血红素结合蛋白区，为MMPs中分子量最小的成员。MMP-7主要由纤维母细胞、巨噬细胞、肿瘤细胞分泌，能降解ECM的弹性蛋白、明胶、Ⅳ型胶原纤维、层黏素(LM)、纤维蛋白(FN)等多种成分，为肿瘤细胞扩散提供通道，并通过打破肿瘤细胞间牢固的粘附作用，而促使肿瘤细胞游走，脱离原发瘤而进入周围组织和血管。由于鼻咽癌原发灶解剖位置深在，并以放疗为主要治疗手段，因而我们的实验以T分期作为判断肿瘤浸润深度的指标。通过鼻咽癌组织切片的免疫组化实验，观察到MMP-7蛋白主要表达于肿瘤细胞，小部分位于肿瘤浸润边缘的间质中，并以癌巢扩散前沿(invasive front)的肿瘤细胞表达最为明显，其在鼻咽癌原发灶中浸润前沿的癌细胞MMP-7蛋白的表达量明显高于癌巢中心区域。运用行列表资料X2检验的关联性分析，结果提示MMP-7蛋白表达与鼻咽癌患者性别、年龄无关(X2＝5.324、1.202，P＞0.05)；不同浸润深度、区域淋巴结转移范围和临床分期的鼻咽癌标本之间MMP-7蛋白表达水平的差异有统计学意义(其相应的X2值为17.012、23.927、20.748，均P＜0.05)，根据各组间数据分布的特点，我们可以推断MMP-7蛋白表达水平随着鼻咽癌浸润深度、淋巴结转移范围的增加而升高，与鼻咽癌侵袭转移能力密切相关；同时较之鼻咽癌早期，进展期有更高的MMP-7蛋白表达。
同时，为了更全面诠释MMP-7在鼻咽癌中的表达情况，我们还从基因水平检测MMP-7 mRNA的表达水平。RT-PCR半定量分析的结果表明，鼻咽癌组MMP-7 mRNA的表达阳性率为89.58%，显著高于慢性鼻咽炎组的16.67%(X2=32.955，P＜0.001)。鼻咽癌组中mRNA的表达水平与患者性别及年龄无关；但是mRNA的表达量随着T分期的升高呈梯度递增，经T分期组内两两比较的q检验，显示T1的表达量明显低于 T3、T4，T2 亦低于T4，而T1与T2，T2与T3，T3与T4之间的差异无统计学意义(P>0.05)，这可能是因为相邻的两组间肿瘤浸润深度的差异相对较小，或者该实验的样本含量偏少所致。RT-PCR分析的结果还提示MMP-7 mRNA的表达水平随N分期的升高呈递增趋势，各N分
期间的差异有统计学意义(P＜0.05)；并且进展期癌的表达量显著高于早期癌。RT-PCR实验中所有鼻咽癌各处理因素的组间比较的差异性与免疫组化的结果相近，说明MMP-7蛋白的表达情况与基因转录水平一致，MMP-7与鼻咽癌的侵袭及转移呈正相关关系。
以上实验证实MMP-7的表达与鼻咽癌侵袭转移密切相关，高表达MMP-7的鼻咽癌有更强的恶性能力。因此，MMP-7的表达可以作为预测鼻咽癌恶性程度的生物指标，对于高表达MMP-7的鼻咽癌病例应采取更为积极的治疗方案，必要时于术后辅予放化疗，并加强随访，以减少放疗后区域复发和远处转移，延长患者生存时间。
参考文献
1 华贻军，洪明晃，罗东华，等.406例鼻咽癌患者预后多因素分析.中国肿瘤临床.2005，32(8)：435-438.
2 宗永生.鼻咽癌组织学诊断.见：闵华庆，潘国英，宗永生，主编.鼻咽癌诊治标准.第5版.北京：北京医科大学、协和医科大学联合出版社，1991.
3 刘泰福，徐国镇.全国鼻咽癌会议纪要.中华放射肿瘤杂志，1992，1(4)：204-209.
4 夏铁安.肿瘤标志物诊断.见：夏同礼，主编.肿瘤物检诊断.第1版.北京：人民卫生出版社，2002：98.
5 闵华庆，鼻咽癌.见：张天泽，徐光炜，主编.肿瘤学.第1版.天津：天津科技出版社，1994：1071-1093.