【摘 要】
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目的 通过克隆人聚角微丝蛋白(filaggrin)基因,构建重组表达质粒,获得具活性的纯化重组蛋白,建立人AFA间接ELISA检测法,以评价AFA在RA诊断中的价值.方法 构建重组表达载体,在
【机 构】
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浙江省台州医院检验科,复旦大学上海医学院医学分子病毒学重点实验室
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目的 通过克隆人聚角微丝蛋白(filaggrin)基因,构建重组表达质粒,获得具活性的纯化重组蛋白,建立人AFA间接ELISA检测法,以评价AFA在RA诊断中的价值.方法 构建重组表达载体,在大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)中表达;融合蛋白经Ni-NAT树脂柱进行亲和层析纯化,建立间接ELISA检测AFA方法,并用于检测114例RA患者、56例SLE患者、32例OA患者及40名健康体检者血清中抗人AFA;分析AFA和抗CCP抗体诊断RA的相关性.结果 扩增出321 bp人filagrin基因片段,构建了具有正确序列的质粒载体pET-28a(+)-filaggrin,转化大肠杆菌Rosettagami(DE3)中经诱导产生高水平的表达产物.经SDS-PAGE分析,在相对分子质量为14 000处出现新生蛋白带.用Ni-NAT树脂纯化后得到具有活性的纯化人filaggrin重组蛋白.间接ELISA检测标本血清结果显示,RA组AFA检测吸光度(A)值为0.473±0.248,与SLE组、0A组及健康对照组的A值(分别为0.160±0.088、0.050±O.018、0.121±0.040)两两组间比较,差异具有统计学意义(t值分别为12.004、14.464、18.078,P均
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