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摘要 [目的]建立5种兽用中药散剂中非法添加苯丙酸诺龙的高效液相色谱检测方法。[方法]兽药样品经甲醇超声提取后离心进行HPLC检测分析。以乙腈-水为流动相，梯度洗脱，采用反相高效液相色谱-紫外检测法进行测定，检测波长为241 nm。[结果]苯丙酸诺龙的线性范围是1.0～50.0 mg/L，回收率为89.7% ～102.5%，方法的检测限为1.0 mg/kg，定量限为5.0 mg/kg。[结论]该方法的灵敏度高、精密度好、回收率高，适用于中兽药中苯丙酸诺龙的快速检测，为监管部门查处非法添加提供检测依據。
关键词 中兽药;苯丙酸诺龙;高效液相色谱;非法添加
中图分类号 S859.79文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2019）10-0160-03
Abstract [Objective]This experiment established a method for determination of nandrolone phenylpropionate in 5 kinds of veterinary traditional Chinese drugs by HPLC.[Method] Veterinary powder samples were chosen and extracted by methanol，then detected by HPLC.Acetonitrile and water as mobile phase，gradient elute; determination by reversed-phase high performance liquid chromatography-ultraviolet detection，the wavelength was 241 nm.[Result] The linear range of nandrolone phenylpropionate was 1.0 to 50.0 mg/L.The recovery rate was between 89.7% -102.5%，the limit of detection（LOD）was 1.0 mg/kg and the limit of quantitation（LOQ）was 5.0 mg/kg.[Conclusion]The method has high sensitivity，good precision and high recovery rate，and is suitable for rapid detection of phenylpropionate in Chinese veterinary medicine，and provides a test basis for the regulatory authorities to investigate and deal with illegal addition.
Key words Veterinary traditional Chinese medicine; Nandrolone phenylpropionate;High performance liquid chromatography; Illegal addition
苯丙酸诺龙是一种蛋白同化激素，是具有环戊烷并多氢菲母核的甾体激素类药物，具有蛋白同化作用[1]，在医学上用于严重创伤、烧伤后的修复、再生障碍性贫血的治疗及骨质疏松症的辅助治疗，同时也具有促进畜禽生长、提高饲料转化率、利于蛋白质沉积的作用。该试验选取了5种中兽药，有健胃散、肥猪散等，主要有催肥、开胃、主治生长迟缓等作用，若违规添加苯丙酸诺龙，利用其强的蛋白同化作用，可增强动物食欲和提高饲料转化率，但食用此类残留有苯丙酸诺龙的动物源性食品会造成男女性别特征的紊乱、总胆固醇升高、肝细胞癌、青少年儿童骨骼早闭后的身材矮小等，严重危害消费者身心健康。因此该试验旨在建立中兽药散剂中非法添加苯丙酸诺龙HPLC法的定性、定量检查方法，为兽药监管提供科学依据[2-8]。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要仪器。美国Agilent公司高效液相色谱仪，型号1260-Ⅱ，配四元梯度泵、在线脱气机、二极管阵列紫外检测器（DAD）、自动进样器和柱温箱; 十万分之一天平，德国赛多利斯，感量0.01 mg，型号BS21S;水浴超声仪（HS10260D）;超纯水机（Milli-Q Millipore）;高速冷冻离心机（Hitachi CR 22G）。
1.1.2 主要试剂。
苯丙酸诺龙标准品（纯度99.5%，批号100004-200603，中国食品药品检定研究院）;健胃散（石家庄九鼎动物药业有限公司，批号17020329）;肥猪散（阜阳顺昌牧业有限公司，批号20170901）;强壮散（安庆市柯旷动物药业，批号170901）;壮阳散（合肥中龙神力动物药业，批号20181218）;猪健散（亳州同欣生物科技有限公司，批号20161204）。甲醇、乙腈均为色谱纯;试验用水为超纯水，符合GB/T 6682 用水规定。
1.1.3 溶液配制。
1.1.3.1 对照品溶液的制备。精密称取苯丙酸诺龙对照品100 mg于100 mL 容量瓶，加甲醇溶解，制成浓度为1 000 mg/L的储备液，精密量取储备液5 mL于100 mL容量瓶中，加甲醇定容，制成工作液。
1.1.3.2 标准曲线工作液的制备。
精密量取“1.1.3.1”项下的储备液，用甲醇依次稀释成浓度为1.0、5.0、10.0、25.0、50.0 mg/L 的标准品工作液。经0.45 μm滤膜过滤，取续滤液，即得。 1.2 方法
1.2.1 色谱条件。色谱柱C18 150 mm×4.6 mm（eclipse Plus C18），粒径5 μm，或者相当;柱温35 ℃;流速1.0 mL/min;检测波长241 nm;进样量10 μL;流动相见表1。
1.2.2 标准曲线。将苯丙酸诺龙标准品工作液依次浓度从低到高，按上述色谱条件进样，每个浓度重复3次，按其所得峰面积的平均值与对应的标准溶液浓度做标准曲线，计算回归方程和相关系数。
1.2.3 样品处理。准确称取兽药样品2.0 g（精确至0.01 g），置于50 mL离心管中，准确加入25 mL甲醇，加塞，振荡1 min;再置于超声仪中超声25 min，放冷，3 500 r/min 离心10 min。精密量取上清液1 mL至25 mL量瓶中，甲醇定容，摇匀，溶液过0.45 μm 微孔有机滤膜，上机测定。
1.2.4 空白溶液的制备 准确称取经检测不含阳性样品的健胃散、肥猪散等样品各2 g至50 mL离心管中，按“1.2.3”方法处理。
1.2.5 样品回收率及精密度。准确称取兽药样品各2.0 g，分别加入适量苯丙酸诺龙标准品工作液， 制成2.5、5.0、7.5 mg/kg 的3种质量浓度的阳性样品， 按“1.2.3”方法进行处理，按“1.2.1”色谱条件进行测定，每个添加浓度做5个平行，计算平均回收率和精密度。
1.2.6 检测限和定量限。在空白样品中添加苯丙酸诺龙标准溶液， 测得其保留时间处的响应值与基线噪音值，计算信噪比，以3倍信噪比为检出限，10倍信噪比为定量限。
2 结果与分析
2.1 苯丙酸诺龙的液相色谱图与保留时间 在选定的色谱条件下， 测得苯丙酸诺龙标准溶液的保留时间约为7.9 min，见图1;各阳性添加样品色谱图见图2～6，空白样品色谱图见图7。
2.2 标准曲线 苯丙酸诺龙标准曲线见图8，线性方程为y=30.024x+25.267， 其中y代表峰面积，x代表苯丙酸诺龙标准品溶液的浓度（mg/L），相关系数r=0.999 5，表明苯丙酸诺龙在1.0～50.0 mg/L线性关系良好。
2.3 样品回收率和精密度 5种中兽药样品阳性添加平均回收率在89.7%～102.5%，RSD在2.3%～3.5%。表明该方法精密度良好。
2.4 检测限和定量限 在信噪比大于3的情况下，苯丙酸诺龙的检测限为1.0 mg/kg，在信噪比大于10 的情况下苯丙酸诺龙的定量限为5.0 mg/kg。
3 讨论
3.1 样品处理 苯丙酸诺龙极性小，脂溶性强，不溶于水，可溶于乙醇、甲醇、正己烷等有机溶剂。因此，该试验在前处理中选择了甲醇和乙腈为提取试剂，发现甲醇的提取效果较好，处理空白样品时能较好地排除杂质对主峰的干扰。除提取溶剂的选择外，该试验还比较了处理步骤的不同，离心对样品的影响，发现样品经过超声并离心后干扰清除更彻底，因此确定了超声并离心的处理步骤。
3.2 流动相的选择 如前所述，苯丙酸诺龙极性较小，出峰较迟，该试验选用乙腈-水和甲醇-水2种流动相体系，采用不同比例做流动相，并参考其他文献。试验结果表明，采用乙腈-水作为流动相能把苯丙酸诺龙与饲料中的其他组分分离。当选择乙腈-水比例75∶25为初始比例时，阳性添加样品中的中药成分出峰太多，对出峰时间为8 min左右的主峰干扰严重，因此直接提高有机相比例，确定初始比例乙腈-水为75∶25，并选择表1中的梯度洗脱程序时，苯丙酸诺龙的保留时间适中，且与中兽药样品中的其他干扰杂质分离效果佳，峰型好。
4 结论
该试验建立了高效液相色谱法测定5种中兽药散剂中的苯丙酸诺龙含量的方法。试样的前处理方法简便、快速，方法的灵敏度高、精密度好、回收率高，适用于中兽药中苯丙酸诺龙的快速检测，为监管部门查处非法添加提供检测依据。
參考文献
[1] 续倩，何绮霞，张展，等.高效液相色谱法测定饲料中苯丙酸诺龙含量的研究[J].中国饲料，2014（2）：41-43.
[2] 崔成富，陈创华，林海丹，等.中兽药散剂中非法添加利巴韦林的检测方法研究[J].中国兽药杂志，2011，45（9）：32-35.
[3] 黄冬梅，史永富，王媛，等.HPLC-MS/MS 测定水产品中苯丙酸诺龙、诺龙残留量[J].食品科学，2010，31（22）：394-397.
[4] 中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典：2015年版一部[S].北京：中国农业出版社，2016.
[5] 黄冬梅，徐捷，钱蓓蕾，等.HPLC-MS/MS 测定鳗鲡中苯丙酸诺龙与诺龙残留量[J].分析实验室，2010，29（S1）：274-277.
[6] 张兰，陈金凤，童萍，等.高效液相色谱法同时测定血浆中的10 种蛋白同化激素[J].色谱，2008，26（4）：449-453.
[7] 刘玉波，马剑文.苯丙酸诺龙高效液相色谱测定法[J].药物分析杂志，1993，13（1）：272-273.
[8] 严慧，向平，王萌烨，等.液相色谱-串联质谱法测定头发中10种蛋白同化激素[J].分析化学，2007（7）：949-953.
关键词 中兽药;苯丙酸诺龙;高效液相色谱;非法添加
中图分类号 S859.79文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2019）10-0160-03
Abstract [Objective]This experiment established a method for determination of nandrolone phenylpropionate in 5 kinds of veterinary traditional Chinese drugs by HPLC.[Method] Veterinary powder samples were chosen and extracted by methanol，then detected by HPLC.Acetonitrile and water as mobile phase，gradient elute; determination by reversed-phase high performance liquid chromatography-ultraviolet detection，the wavelength was 241 nm.[Result] The linear range of nandrolone phenylpropionate was 1.0 to 50.0 mg/L.The recovery rate was between 89.7% -102.5%，the limit of detection（LOD）was 1.0 mg/kg and the limit of quantitation（LOQ）was 5.0 mg/kg.[Conclusion]The method has high sensitivity，good precision and high recovery rate，and is suitable for rapid detection of phenylpropionate in Chinese veterinary medicine，and provides a test basis for the regulatory authorities to investigate and deal with illegal addition.
Key words Veterinary traditional Chinese medicine; Nandrolone phenylpropionate;High performance liquid chromatography; Illegal addition
苯丙酸诺龙是一种蛋白同化激素，是具有环戊烷并多氢菲母核的甾体激素类药物，具有蛋白同化作用[1]，在医学上用于严重创伤、烧伤后的修复、再生障碍性贫血的治疗及骨质疏松症的辅助治疗，同时也具有促进畜禽生长、提高饲料转化率、利于蛋白质沉积的作用。该试验选取了5种中兽药，有健胃散、肥猪散等，主要有催肥、开胃、主治生长迟缓等作用，若违规添加苯丙酸诺龙，利用其强的蛋白同化作用，可增强动物食欲和提高饲料转化率，但食用此类残留有苯丙酸诺龙的动物源性食品会造成男女性别特征的紊乱、总胆固醇升高、肝细胞癌、青少年儿童骨骼早闭后的身材矮小等，严重危害消费者身心健康。因此该试验旨在建立中兽药散剂中非法添加苯丙酸诺龙HPLC法的定性、定量检查方法，为兽药监管提供科学依据[2-8]。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要仪器。美国Agilent公司高效液相色谱仪，型号1260-Ⅱ，配四元梯度泵、在线脱气机、二极管阵列紫外检测器（DAD）、自动进样器和柱温箱; 十万分之一天平，德国赛多利斯，感量0.01 mg，型号BS21S;水浴超声仪（HS10260D）;超纯水机（Milli-Q Millipore）;高速冷冻离心机（Hitachi CR 22G）。
1.1.2 主要试剂。
苯丙酸诺龙标准品（纯度99.5%，批号100004-200603，中国食品药品检定研究院）;健胃散（石家庄九鼎动物药业有限公司，批号17020329）;肥猪散（阜阳顺昌牧业有限公司，批号20170901）;强壮散（安庆市柯旷动物药业，批号170901）;壮阳散（合肥中龙神力动物药业，批号20181218）;猪健散（亳州同欣生物科技有限公司，批号20161204）。甲醇、乙腈均为色谱纯;试验用水为超纯水，符合GB/T 6682 用水规定。
1.1.3 溶液配制。
1.1.3.1 对照品溶液的制备。精密称取苯丙酸诺龙对照品100 mg于100 mL 容量瓶，加甲醇溶解，制成浓度为1 000 mg/L的储备液，精密量取储备液5 mL于100 mL容量瓶中，加甲醇定容，制成工作液。
1.1.3.2 标准曲线工作液的制备。
精密量取“1.1.3.1”项下的储备液，用甲醇依次稀释成浓度为1.0、5.0、10.0、25.0、50.0 mg/L 的标准品工作液。经0.45 μm滤膜过滤，取续滤液，即得。 1.2 方法
1.2.1 色谱条件。色谱柱C18 150 mm×4.6 mm（eclipse Plus C18），粒径5 μm，或者相当;柱温35 ℃;流速1.0 mL/min;检测波长241 nm;进样量10 μL;流动相见表1。
1.2.2 标准曲线。将苯丙酸诺龙标准品工作液依次浓度从低到高，按上述色谱条件进样，每个浓度重复3次，按其所得峰面积的平均值与对应的标准溶液浓度做标准曲线，计算回归方程和相关系数。
1.2.3 样品处理。准确称取兽药样品2.0 g（精确至0.01 g），置于50 mL离心管中，准确加入25 mL甲醇，加塞，振荡1 min;再置于超声仪中超声25 min，放冷，3 500 r/min 离心10 min。精密量取上清液1 mL至25 mL量瓶中，甲醇定容，摇匀，溶液过0.45 μm 微孔有机滤膜，上机测定。
1.2.4 空白溶液的制备 准确称取经检测不含阳性样品的健胃散、肥猪散等样品各2 g至50 mL离心管中，按“1.2.3”方法处理。
1.2.5 样品回收率及精密度。准确称取兽药样品各2.0 g，分别加入适量苯丙酸诺龙标准品工作液， 制成2.5、5.0、7.5 mg/kg 的3种质量浓度的阳性样品， 按“1.2.3”方法进行处理，按“1.2.1”色谱条件进行测定，每个添加浓度做5个平行，计算平均回收率和精密度。
1.2.6 检测限和定量限。在空白样品中添加苯丙酸诺龙标准溶液， 测得其保留时间处的响应值与基线噪音值，计算信噪比，以3倍信噪比为检出限，10倍信噪比为定量限。
2 结果与分析
2.1 苯丙酸诺龙的液相色谱图与保留时间 在选定的色谱条件下， 测得苯丙酸诺龙标准溶液的保留时间约为7.9 min，见图1;各阳性添加样品色谱图见图2～6，空白样品色谱图见图7。
2.2 标准曲线 苯丙酸诺龙标准曲线见图8，线性方程为y=30.024x+25.267， 其中y代表峰面积，x代表苯丙酸诺龙标准品溶液的浓度（mg/L），相关系数r=0.999 5，表明苯丙酸诺龙在1.0～50.0 mg/L线性关系良好。
2.3 样品回收率和精密度 5种中兽药样品阳性添加平均回收率在89.7%～102.5%，RSD在2.3%～3.5%。表明该方法精密度良好。
2.4 检测限和定量限 在信噪比大于3的情况下，苯丙酸诺龙的检测限为1.0 mg/kg，在信噪比大于10 的情况下苯丙酸诺龙的定量限为5.0 mg/kg。
3 讨论
3.1 样品处理 苯丙酸诺龙极性小，脂溶性强，不溶于水，可溶于乙醇、甲醇、正己烷等有机溶剂。因此，该试验在前处理中选择了甲醇和乙腈为提取试剂，发现甲醇的提取效果较好，处理空白样品时能较好地排除杂质对主峰的干扰。除提取溶剂的选择外，该试验还比较了处理步骤的不同，离心对样品的影响，发现样品经过超声并离心后干扰清除更彻底，因此确定了超声并离心的处理步骤。
3.2 流动相的选择 如前所述，苯丙酸诺龙极性较小，出峰较迟，该试验选用乙腈-水和甲醇-水2种流动相体系，采用不同比例做流动相，并参考其他文献。试验结果表明，采用乙腈-水作为流动相能把苯丙酸诺龙与饲料中的其他组分分离。当选择乙腈-水比例75∶25为初始比例时，阳性添加样品中的中药成分出峰太多，对出峰时间为8 min左右的主峰干扰严重，因此直接提高有机相比例，确定初始比例乙腈-水为75∶25，并选择表1中的梯度洗脱程序时，苯丙酸诺龙的保留时间适中，且与中兽药样品中的其他干扰杂质分离效果佳，峰型好。
4 结论
该试验建立了高效液相色谱法测定5种中兽药散剂中的苯丙酸诺龙含量的方法。试样的前处理方法简便、快速，方法的灵敏度高、精密度好、回收率高，适用于中兽药中苯丙酸诺龙的快速检测，为监管部门查处非法添加提供检测依据。
參考文献
[1] 续倩，何绮霞，张展，等.高效液相色谱法测定饲料中苯丙酸诺龙含量的研究[J].中国饲料，2014（2）：41-43.
[2] 崔成富，陈创华，林海丹，等.中兽药散剂中非法添加利巴韦林的检测方法研究[J].中国兽药杂志，2011，45（9）：32-35.
[3] 黄冬梅，史永富，王媛，等.HPLC-MS/MS 测定水产品中苯丙酸诺龙、诺龙残留量[J].食品科学，2010，31（22）：394-397.
[4] 中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典：2015年版一部[S].北京：中国农业出版社，2016.
[5] 黄冬梅，徐捷，钱蓓蕾，等.HPLC-MS/MS 测定鳗鲡中苯丙酸诺龙与诺龙残留量[J].分析实验室，2010，29（S1）：274-277.
[6] 张兰，陈金凤，童萍，等.高效液相色谱法同时测定血浆中的10 种蛋白同化激素[J].色谱，2008，26（4）：449-453.
[7] 刘玉波，马剑文.苯丙酸诺龙高效液相色谱测定法[J].药物分析杂志，1993，13（1）：272-273.
[8] 严慧，向平，王萌烨，等.液相色谱-串联质谱法测定头发中10种蛋白同化激素[J].分析化学，2007（7）：949-953.