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本研究为了优化确立柱花草(Stylosanthesguianensis杂交后代育性分离群体ISSR-PCR反应体系.利用正交设计试验,从模板DNA和引物2个因素、4个水平对柱花草杂交后代育性分离群体ISSR-PCR反应体系进行优化试验.结果表明:反应体系中模板DNA 75 ng,ISSR引物10 μmol/L,2×EasyTaq PCR SuperMixfor PAGE(含染料)7.5μL时扩增效果最好.并通过对柱花草杂交后代育性分离群体ISSR-PCR最佳反应体系进行梯度退火试验,得到引物UBC834的最佳退火温度为54.4℃.该反应体系在柱花草BC1F1代不育可育分离群体中获得较好的扩增结果,该优化体系为后续筛选与柱花草花粉不育基因连锁的分子标记提供了稳定和可靠参考.