目的 观察基因芯片分析联合小型干扰(siRNA)人端粒酶RNA(hTR)及人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因对膀胱移行细胞癌BIU-87细胞株端粒酶活性抑制的影响.方法 根据siRNA设计原则和TERT、TR基因mRNA编码序列,分别设计合成3对不同的且能干扰TR和TERT基因表达的siRNA序列并筛选出最高效抑制序列(pRNAT-TERT-Ⅲ:GTACAGGTTTCACGCATGT基因的第3229位、pRNAT-TR-Ⅲ:CGAAGGTGCCTTGGAATAT基因的第306位).构建以hTR、hTERT基因为靶点的联合RNA干扰(RNAi)装置pRNAT-TR-Ⅲ+pRNAT-TERT-Ⅲ(脂质体法)并将其转染膀胱移行细胞癌BIU-87细胞株,采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)分析hTR和hTERT mRNA表达(以目的基因与GAPDH拷贝数比值进行相对定量分析),端粒重复序列扩增-酶联免疫吸附试验(TRAP-ELISA)检测端粒酶活性(测其A值),噻唑蓝(MTT)比色法检测BIU-87细胞的生长抑制(按MTT法检测转染细胞的存活率),并对联合RNAi前后进行基因芯片分析,采用RNA抽提、RNA质量检测、cRNA标记与合成、芯片杂交、化学发光检测、图像采集和数据分析,并进一步采用逆转录(RT)-PCR验证部分差异表达基因.结果 联合RNA干扰hTR及hTERT基因后,pRNAT-TERT-Ⅲ+pRNAT-TR-Ⅲ的联合RNAi可以特异性抑制膀胱移行细胞癌BIU-87细胞株中TERT和TR表达(pRNAT-TERT-Ⅲ+pRNAT-TR-ⅢTERT:0.300±0.033,P＜0.05;TR:0.430±0.028,P＜0.05).且联合RNAi后膀胱移行细胞癌BIU-87细胞株的生长和端粒酶活性均明显受到抑制(pRNAT-TERT-Ⅲ+pRNAT-TR-Ⅲ:1.250±0.012,P＜0.05).联合siRNA前后进行基因芯片分析发现21个基因下调(ATM、BAX、BCL2、BCL2L1、BIRC5、CD44、CTNNB1、E2F1、JUN、MCAM、MTA1、MYC、NFKB1、NFKBIA、NME4、PNN、PRKDC、SERPINE1、THBS1、TNFRSF1A、UCC1).结论 联合RNA干扰hTERT及hTR基因能明显抑制膀胱移行细胞癌BIU-87细胞株的生长;联合siRNA抑制膀胱移行细胞癌BIU-87细胞株的生长的原因为21个基因下调所致。
联合RNAi膀胱移行细胞癌BIU-87细胞株端粒酶活性及其增殖影响的机制
【摘 要】
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目的 观察基因芯片分析联合小型干扰(siRNA)人端粒酶RNA(hTR)及人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因对膀胱移行细胞癌BIU-87细胞株端粒酶活性抑制的影响.方法 根据siRNA设计原则和TERT、TR基因mRNA编码序列,分别设计合成3对不同的且能干扰TR和TERT基因表达的siRNA序列并筛选出最高效抑制序列(pRNAT-TERT-Ⅲ:GTACAGGTTTCACGCATGT基因的第322
【机 构】
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210002,南京军区南京总医院泌尿外科,210002,南京军区南京总医院泌尿外科,210002,南京军区南京总医院泌尿外科,210002,南京军区南京总医院泌尿外科,210002,南京军区南京总医院
【出 处】
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中华实验外科杂志
【发表日期】
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2010年27期
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