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目的
构建稳定沉默表达miR-26a的人肺腺癌细胞株(A549)。
方法体外合成成熟的人miR-26a-5p(Hsa-miR-26a-5p)特异性互补序列，在片段两侧添加Age I、EcoRI酶切位点，与经双酶切后的GV280载体连接，构建GV280-miR-26a-down慢病毒载体。应用DNA测序对此重组载体进行鉴定。将GV280-miR-26a-down慢病毒载体与病毒包装质粒pGC-LV载体、pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体共转染293T细胞，包装产生慢病毒。依据293T细胞绿色荧光蛋白的表达量确定病毒滴度。将沉默表达miR-26a的慢病毒转染A549细胞，嘌呤霉素筛选后获得稳定细胞株。应用Western blot法检测miR-26a一个靶基因SMAD1的表达情况，验证此细胞株的功能。
结果经DNA测序鉴定，成功构建了GV280-miR-26a-down慢病毒载体。在293T细胞中将该载体包装成慢病毒，测定病毒滴度为2×1012 TU/L。重组慢病毒转染A549细胞的效率高达95%，用2.5 mg/L嘌呤霉素筛选2周后几乎100%的A549细胞表达GFP。Western blot结果显示miR－26a的靶基因SMAD1的表达量在miR－26a沉默组比空载病毒组和空白对照组明显上调。
结论成功构建了GV280-miR-26a-down慢病毒载体，并构建稳定沉默表达miR-26a的A549细胞株，为后续研究奠定了基础。