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摘要：为寻求柴胡生产的最佳采收期，采用HPLC法、亚硝酸钠-硝酸铝比色法研究不同采收期柴胡中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、黄酮类物质含量动态变化。结果表明，随着采收期的延后，柴胡根中皂苷、黄酮类物质含量都是先下降后上升再下降，且9月1日采收的柴胡中皂苷、黄酮含量都比较高。柴胡最佳采收期确定还应结合其他主要有效成分含量动态积累的规律。该试验方法简便、快速、可靠。
关键词：柴胡；皂苷；黄酮；采收期；动态积累
中图分类号：R284.1文献标志码：A文章编号：1002-1302（2015）11-0404-02
收稿日期：2014-11-01
基金项目：黑龙江省教育厅科学技术研究项目（编号：12543082）；黑龙江省绥化市科技计划（编号：KJZD20120081）。
作者简介：王斌（1980—），女，吉林敦化人，硕士，讲师，主要从事天然药物质量评价研究、药用蕈菌活性成分研究及药学相关的教学与科研。E-mail：wangbinkuaike@163.com。柴胡是中国应用广泛的传统中药，2010版《中华人民共和国药典》收录的柴胡品种为柴胡（Bupleurum chinense DC）和狭叶柴胡（B.scorzonerifolium Willd）的干燥根，前者别称北柴胡，后者别称南柴胡。柴胡性味苦甘，入肝胆经，具有和解退热、升举阳气、疏肝解郁的功能。近代药理研究表明，柴胡具有解热、镇静、镇咳、抗炎、抗菌、抗病毒、保肝利胆、降血脂及抗消化道溃疡等药理活性[1]。柴胡中主要有效成分有皂苷、甾醇、挥发油、多糖等。目前，还发现柴胡中黄酮类成分具有利胆、抑菌、杀菌等作用。本试验研究了不同采收期柴胡中皂苷、黄酮类成分含量动态积累，为寻求柴胡生产的最佳采收期及建立柴胡多指标的质量评价体系提供理论依据。
1材料于方法
1.1材料
试验材料来源于黑龙江省明水县春草园中药材种植公司柴胡种植基地，2013年7月2日开始采样，至10月6日结束，共分7期采样，分别为：（1）7月2日；（2）7月17日；（3）8月3日；（4）8月15日；（5）9月1日；（6）9月17日；（7）10月6日。样品为狭叶柴胡的根，采挖后立即洗去泥沙，通风干燥，按采收时间对样品编号。
1.2仪器
美国waters 2695 高效液相色谱仪系统；AB125-S 1/100 000的天平，瑞士梅特勒利多仪器（上海）有限公司；752紫外可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司；SB25-12DTD超声波清洗器，宁波新芝生物科技股份有限公司；分析天平FA2014，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；DK-98-IIA电热恒温水浴锅，天津市泰斯特仪器有限公司；101-2A型数显电热鼓风干燥箱，上海锦屏仪器仪表有限公司通州分公司；FW100高速万能粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司。
1.3试剂
柴胡皂苷a对照品（中国食品药品鉴定研究院，批号：10777-201108）、柴胡皂苷d对照品（中国食品药品鉴定研究院，批号：10778-201208）芸香苷对照品（中国食品药品鉴定研究院，批号：100080-200707）、乙腈、水为色谱纯，乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、蒸馏水，氨水、甲醇以上试剂均为分析纯。
1.4分析与测定
1.4.1不同采收期柴胡中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的测定[2]
1.4.1.1对照品溶液的制备精确称取柴胡皂苷a对照品10 mg、柴胡皂苷d对照品12 mg，加甲醇定容至25 mL容量瓶中，摇匀，即得。
1.4.1.2供试品溶液的制备取样品粉末（过4号筛）约0.5 g，精确称定，置具塞锥形瓶中，加入含5%浓氨试液的甲醇溶液25 mL，密塞，30 ℃超声处理（功率200 W，频率40 kHZ）30 min，滤过，用甲醇20 mL分2次洗涤容器及药渣，洗液与滤液合并，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤（0.45 μm），弃初滤液，取续滤液，即得供试品溶液。
1.4.1.3色谱条件以十八烷基键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱；流速1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长为210 nm，理论半数按柴胡皂苷a峰计算应不低于10 000。
表1流动相梯度洗脱
时间（min）流动相A（%）流动相B（%）0～5025→9075→1050～559010
1.4.1.4测定法分别精确吸取对照品溶液20 μL与供试品溶液20 μL，注入色谱仪，测定即得。
1.4.2不同采收期柴胡中黄酮类物质的测定
1.4.2.1标准曲线的绘制（1）标准品溶液的制备。干燥恒质量的芸香苷标准品20 mg，加60%乙醇20 mL于水浴60 ℃溶解，配制成1.0 mg/mL的标准溶液。（2）线性关系考察。精确吸取0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL的标准溶液至25mL容量瓶中，加入0.7 mL 5%NaNO2，5 min后再加入0.7mL 10%Al（NO3）3，放置10 min，加入5.0 mL 4%NaOH，混匀后用30%乙醇定容至刻度，于38 ℃水浴中显色15 min，以试剂空白对照，在510 nm处测定吸光度。以芸香苷质量（mg）为横坐标，吸光度（D）为纵坐标，绘制标准曲线。
1.4.2.2样品的测定（1）样品溶液的制备。将样品于 60 ℃真空干燥5 h，于粉碎机中粉碎，过40目筛，贮存于具塞锥形瓶中，置干燥器中备用。称取粉碎的样品粉末2.0 g，置于100 mL 锥形瓶中加入70%乙醇30 mL，用封口膜密封，浸泡12 h，超声提取，提取温度60 ℃，提取时间15 min，超声功率60%，提取完毕，真空过滤，取上清液。第2次提取加入70%乙醇15 mL，其他提取条件不变，合并2次的提取上清液，用70%乙醇定容至35 mL，备用。（2）样品的测定与结果。精确吸取样品溶液5 mL，在“1.4.1.4”节条件下测定样品，每个测试样品溶液平行3次测定，取平均值代入公式计算黄酮类物质含量。 黄酮类物质含量=X×7÷1 000÷m×100%。
式中：X为根据标准曲线计算换算为芸香苷的质量，mg；m为制备样品测定液时称取的柴胡干燥粉末的质量，g。
1.5方法学考察
1.5.1精密度试验精确称取样品，分别按“1.4.1.2”和“1.4.1.4”节下的条件制备供试品溶液，按样品测定项操作连续记录色谱图5次，计算主要峰的峰面积。精密称取样品，分别按“1.4.2.1”和“1.4.2.2”节下的条件制备供试品溶液，按样品测定项操作连续测吸光度各5次，计算黄酮类物质含量。
1.5.2加样回收率试验以重复试验所得的柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、黄酮平均含量为样品含量，精确称取样品5份，加入等量对照品溶液，按样品测定项操作。
1.5.3重复性试验精确称取样品，分别按“1.4.1.2”、“1.4.1.4”、“1.4.2.1”、“1.4.2.2”节下的条件制备供试品溶液各5份，记录色谱图，计算主要峰的峰面积、测定吸光度。
1.5.4稳定性试验精确称取样品，分别按“1.4.1.2”、“1.4.1.4”、“1.4.2.1”、“1.4.2.2”节下的条件制备供试品溶液，分别于0、1、2、4、 8 h 进样，记录色谱图，计算主要峰的峰面积、测定吸光度。
2结果与分析
2.1精密度及加样回收率
精密度及加样回收率试验结果表明，精密度良好，RSD分别为1.03%、1.89%，加样回收率为99.91 %、100.35%。表明HPLC法测定柴胡中的皂苷、亚硝酸钠-硝酸铝比色法测定柴胡中的黄酮类物质含量方法简便、可靠、易行。
2.2重复性及稳定性
重复性及稳定性试验结果表明，重复性良好，RSD分别为0.95%、1.14%。稳定性试验测试结果表明，在8 h内色谱图、吸光度均基本稳定。表明该测定方法重复性好且测定的数据稳定。
2.3不同采收期柴胡中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的含量
通过计算，不同采收期柴胡中黄酮类物质的含量不同，随着采收期的延后，根中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、柴胡皂苷a d含量的变化趋势都是先下降后上升再下降。其中8月3日采收样品皂苷含量最低，柴胡皂苷a、d含量分别为0.047%、0.050%，9月1日采收的样品皂苷含量最高，柴胡皂苷a、d含量分别为0.203%、0.207%。
2.4不同采收期柴胡中黄酮类物质的含量
不同采收期柴胡中黄酮类物质的含量不同，随着采收期的延后，根中黄酮类物质含量的变化趋势是先下降后上升再下降。其中，8月15日采收的样品黄酮类物质含量比较低，为0.291%，9月1日、9月17日采收的样品黄酮类物质含量比较高，分别为0.416%、0.440%（图3）。经回归分析得出柴胡黄酮类物质含量的回归方程为：y=0.379 8x 0.041 5，r=0.994 8，表明芸香苷在0.8～2.0 mg 呈良好的线性关系。
3结论与讨论
应用HPLC法、亚硝酸钠-硝酸铝比色法测定不同采收期柴胡根中柴胡皂苷、黄酮类物质含量，并对测定方法进行了全面的
方法学考察，其中回收率试验和精密度试验结果表明，该方法排除了干扰因素，精密度良好，说明该方法简便、可靠、易行。
采收期是药材生产中的关键环节之一，直接影响药材的品质。药材有效成分的积累具有一定的规律，按照有效成分积累规律进行采收可以保障药材的质量，反之则会导致药材质量下降。在本研究中，随着采收期的延后，根中柴胡皂苷、黄酮类物质含量都是先下降后上升再下降。9月1日采收的柴胡皂苷、黄酮类物质含量比较高。原因是随着柴胡地上部分的发育，根中柴胡皂苷、黄酮类物质含量呈下降趋势，至9月地上部分基本停止生长，其体内的代谢物质向根内转移，大部分皂苷、黄酮类物质含量又开始升高。王斌等对不同采收期柴胡糖类物质含量动态积累规律进行研究，结果表明，随着采收期的延后，柴胡中总糖、多糖含量呈现先下降后上升再下降再上升的变化趋势[3]。7月15日、10月2日采收的总多糖含量有2个高峰期。因此，柴胡最佳采收期还应结合糖类物质及其他主要有效成分含量动态积累的规律及药材有效成分总产量来确定。
本研究首次同时以柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、黄酮类物质含量来探讨柴胡中有效成分积累规律，为柴胡多指标质量评价体系的建立提供了理论依据。
参考文献：
[1]王斌，张腾霄，马松艳，等. 柴胡的临床应用及配伍规律研究[J]. 时珍国医国药，2012，23（1）：225-227.
[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M]. 北京：中国医药科技出版社，2010：263.
[3]王斌，张腾霄，刘利军. 不同采收期对柴胡糖类物质动态积累的影响[J]. 贵州农业科学，2010，38（6）：76-78.徐燕，邱诗春. 大豆中硒的示波极谱法测定[J]. 江苏农业科学，2015，43（11：406-407.
关键词：柴胡；皂苷；黄酮；采收期；动态积累
中图分类号：R284.1文献标志码：A文章编号：1002-1302（2015）11-0404-02
收稿日期：2014-11-01
基金项目：黑龙江省教育厅科学技术研究项目（编号：12543082）；黑龙江省绥化市科技计划（编号：KJZD20120081）。
作者简介：王斌（1980—），女，吉林敦化人，硕士，讲师，主要从事天然药物质量评价研究、药用蕈菌活性成分研究及药学相关的教学与科研。E-mail：wangbinkuaike@163.com。柴胡是中国应用广泛的传统中药，2010版《中华人民共和国药典》收录的柴胡品种为柴胡（Bupleurum chinense DC）和狭叶柴胡（B.scorzonerifolium Willd）的干燥根，前者别称北柴胡，后者别称南柴胡。柴胡性味苦甘，入肝胆经，具有和解退热、升举阳气、疏肝解郁的功能。近代药理研究表明，柴胡具有解热、镇静、镇咳、抗炎、抗菌、抗病毒、保肝利胆、降血脂及抗消化道溃疡等药理活性[1]。柴胡中主要有效成分有皂苷、甾醇、挥发油、多糖等。目前，还发现柴胡中黄酮类成分具有利胆、抑菌、杀菌等作用。本试验研究了不同采收期柴胡中皂苷、黄酮类成分含量动态积累，为寻求柴胡生产的最佳采收期及建立柴胡多指标的质量评价体系提供理论依据。
1材料于方法
1.1材料
试验材料来源于黑龙江省明水县春草园中药材种植公司柴胡种植基地，2013年7月2日开始采样，至10月6日结束，共分7期采样，分别为：（1）7月2日；（2）7月17日；（3）8月3日；（4）8月15日；（5）9月1日；（6）9月17日；（7）10月6日。样品为狭叶柴胡的根，采挖后立即洗去泥沙，通风干燥，按采收时间对样品编号。
1.2仪器
美国waters 2695 高效液相色谱仪系统；AB125-S 1/100 000的天平，瑞士梅特勒利多仪器（上海）有限公司；752紫外可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司；SB25-12DTD超声波清洗器，宁波新芝生物科技股份有限公司；分析天平FA2014，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；DK-98-IIA电热恒温水浴锅，天津市泰斯特仪器有限公司；101-2A型数显电热鼓风干燥箱，上海锦屏仪器仪表有限公司通州分公司；FW100高速万能粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司。
1.3试剂
柴胡皂苷a对照品（中国食品药品鉴定研究院，批号：10777-201108）、柴胡皂苷d对照品（中国食品药品鉴定研究院，批号：10778-201208）芸香苷对照品（中国食品药品鉴定研究院，批号：100080-200707）、乙腈、水为色谱纯，乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、蒸馏水，氨水、甲醇以上试剂均为分析纯。
1.4分析与测定
1.4.1不同采收期柴胡中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的测定[2]
1.4.1.1对照品溶液的制备精确称取柴胡皂苷a对照品10 mg、柴胡皂苷d对照品12 mg，加甲醇定容至25 mL容量瓶中，摇匀，即得。
1.4.1.2供试品溶液的制备取样品粉末（过4号筛）约0.5 g，精确称定，置具塞锥形瓶中，加入含5%浓氨试液的甲醇溶液25 mL，密塞，30 ℃超声处理（功率200 W，频率40 kHZ）30 min，滤过，用甲醇20 mL分2次洗涤容器及药渣，洗液与滤液合并，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤（0.45 μm），弃初滤液，取续滤液，即得供试品溶液。
1.4.1.3色谱条件以十八烷基键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱；流速1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长为210 nm，理论半数按柴胡皂苷a峰计算应不低于10 000。
表1流动相梯度洗脱
时间（min）流动相A（%）流动相B（%）0～5025→9075→1050～559010
1.4.1.4测定法分别精确吸取对照品溶液20 μL与供试品溶液20 μL，注入色谱仪，测定即得。
1.4.2不同采收期柴胡中黄酮类物质的测定
1.4.2.1标准曲线的绘制（1）标准品溶液的制备。干燥恒质量的芸香苷标准品20 mg，加60%乙醇20 mL于水浴60 ℃溶解，配制成1.0 mg/mL的标准溶液。（2）线性关系考察。精确吸取0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL的标准溶液至25mL容量瓶中，加入0.7 mL 5%NaNO2，5 min后再加入0.7mL 10%Al（NO3）3，放置10 min，加入5.0 mL 4%NaOH，混匀后用30%乙醇定容至刻度，于38 ℃水浴中显色15 min，以试剂空白对照，在510 nm处测定吸光度。以芸香苷质量（mg）为横坐标，吸光度（D）为纵坐标，绘制标准曲线。
1.4.2.2样品的测定（1）样品溶液的制备。将样品于 60 ℃真空干燥5 h，于粉碎机中粉碎，过40目筛，贮存于具塞锥形瓶中，置干燥器中备用。称取粉碎的样品粉末2.0 g，置于100 mL 锥形瓶中加入70%乙醇30 mL，用封口膜密封，浸泡12 h，超声提取，提取温度60 ℃，提取时间15 min，超声功率60%，提取完毕，真空过滤，取上清液。第2次提取加入70%乙醇15 mL，其他提取条件不变，合并2次的提取上清液，用70%乙醇定容至35 mL，备用。（2）样品的测定与结果。精确吸取样品溶液5 mL，在“1.4.1.4”节条件下测定样品，每个测试样品溶液平行3次测定，取平均值代入公式计算黄酮类物质含量。 黄酮类物质含量=X×7÷1 000÷m×100%。
式中：X为根据标准曲线计算换算为芸香苷的质量，mg；m为制备样品测定液时称取的柴胡干燥粉末的质量，g。
1.5方法学考察
1.5.1精密度试验精确称取样品，分别按“1.4.1.2”和“1.4.1.4”节下的条件制备供试品溶液，按样品测定项操作连续记录色谱图5次，计算主要峰的峰面积。精密称取样品，分别按“1.4.2.1”和“1.4.2.2”节下的条件制备供试品溶液，按样品测定项操作连续测吸光度各5次，计算黄酮类物质含量。
1.5.2加样回收率试验以重复试验所得的柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、黄酮平均含量为样品含量，精确称取样品5份，加入等量对照品溶液，按样品测定项操作。
1.5.3重复性试验精确称取样品，分别按“1.4.1.2”、“1.4.1.4”、“1.4.2.1”、“1.4.2.2”节下的条件制备供试品溶液各5份，记录色谱图，计算主要峰的峰面积、测定吸光度。
1.5.4稳定性试验精确称取样品，分别按“1.4.1.2”、“1.4.1.4”、“1.4.2.1”、“1.4.2.2”节下的条件制备供试品溶液，分别于0、1、2、4、 8 h 进样，记录色谱图，计算主要峰的峰面积、测定吸光度。
2结果与分析
2.1精密度及加样回收率
精密度及加样回收率试验结果表明，精密度良好，RSD分别为1.03%、1.89%，加样回收率为99.91 %、100.35%。表明HPLC法测定柴胡中的皂苷、亚硝酸钠-硝酸铝比色法测定柴胡中的黄酮类物质含量方法简便、可靠、易行。
2.2重复性及稳定性
重复性及稳定性试验结果表明，重复性良好，RSD分别为0.95%、1.14%。稳定性试验测试结果表明，在8 h内色谱图、吸光度均基本稳定。表明该测定方法重复性好且测定的数据稳定。
2.3不同采收期柴胡中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的含量
通过计算，不同采收期柴胡中黄酮类物质的含量不同，随着采收期的延后，根中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、柴胡皂苷a d含量的变化趋势都是先下降后上升再下降。其中8月3日采收样品皂苷含量最低，柴胡皂苷a、d含量分别为0.047%、0.050%，9月1日采收的样品皂苷含量最高，柴胡皂苷a、d含量分别为0.203%、0.207%。
2.4不同采收期柴胡中黄酮类物质的含量
不同采收期柴胡中黄酮类物质的含量不同，随着采收期的延后，根中黄酮类物质含量的变化趋势是先下降后上升再下降。其中，8月15日采收的样品黄酮类物质含量比较低，为0.291%，9月1日、9月17日采收的样品黄酮类物质含量比较高，分别为0.416%、0.440%（图3）。经回归分析得出柴胡黄酮类物质含量的回归方程为：y=0.379 8x 0.041 5，r=0.994 8，表明芸香苷在0.8～2.0 mg 呈良好的线性关系。
3结论与讨论
应用HPLC法、亚硝酸钠-硝酸铝比色法测定不同采收期柴胡根中柴胡皂苷、黄酮类物质含量，并对测定方法进行了全面的
方法学考察，其中回收率试验和精密度试验结果表明，该方法排除了干扰因素，精密度良好，说明该方法简便、可靠、易行。
采收期是药材生产中的关键环节之一，直接影响药材的品质。药材有效成分的积累具有一定的规律，按照有效成分积累规律进行采收可以保障药材的质量，反之则会导致药材质量下降。在本研究中，随着采收期的延后，根中柴胡皂苷、黄酮类物质含量都是先下降后上升再下降。9月1日采收的柴胡皂苷、黄酮类物质含量比较高。原因是随着柴胡地上部分的发育，根中柴胡皂苷、黄酮类物质含量呈下降趋势，至9月地上部分基本停止生长，其体内的代谢物质向根内转移，大部分皂苷、黄酮类物质含量又开始升高。王斌等对不同采收期柴胡糖类物质含量动态积累规律进行研究，结果表明，随着采收期的延后，柴胡中总糖、多糖含量呈现先下降后上升再下降再上升的变化趋势[3]。7月15日、10月2日采收的总多糖含量有2个高峰期。因此，柴胡最佳采收期还应结合糖类物质及其他主要有效成分含量动态积累的规律及药材有效成分总产量来确定。
本研究首次同时以柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、黄酮类物质含量来探讨柴胡中有效成分积累规律，为柴胡多指标质量评价体系的建立提供了理论依据。
参考文献：
[1]王斌，张腾霄，马松艳，等. 柴胡的临床应用及配伍规律研究[J]. 时珍国医国药，2012，23（1）：225-227.
[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M]. 北京：中国医药科技出版社，2010：263.
[3]王斌，张腾霄，刘利军. 不同采收期对柴胡糖类物质动态积累的影响[J]. 贵州农业科学，2010，38（6）：76-78.徐燕，邱诗春. 大豆中硒的示波极谱法测定[J]. 江苏农业科学，2015，43（11：406-407.