论文部分内容阅读
摘要：用石蜡切片法对我国特有珍稀濒危水生植物海菜花的大孢子发生及雌配子体的发育过程进行解剖学研究，探讨其繁殖生物学特性。结果表明：海菜花雌蕊为3心皮，每心皮胚珠多数，胚珠倒生，双珠被，厚珠心。功能大孢子位于珠孔端，胚囊发育蓼型。大孢子发生和雌配子体发育情况基本正常。此外，还能观察到雌花内有雄蕊退化的痕迹。
关键词：海菜花；大孢子；发生；雌配子体；雌花形态结构；发育形态；繁殖；生物学特性；胚胎学特征；雄蕊退化
中图分类号： S6823201文献标志码：
文章编号：1002-1302（2017）16-0229-02
收稿日期：2017-04-09
基金项目：国家自然科学基金（编号：3136O065）。
作者简介：翟书华（1963—），男，教授，从事资源植物学与生理生态学的教学和研究。E-mail：937701466@qqcom。
通信作者：殷根深，博士，实验师，主要从事植物学教学和研究。E-mail：252351015@qqcom。
海菜花[Ottelia acuminata（Gagnep） Dandy]为水鳖科（Hydrocharitaceae）水车前属植物，别称异叶水车前、龙爪菜、海菜等，多年生大型沉水植物，是中国特有的国家三级重点保护珍稀濒危水生植物[1-2]。曾经广泛分布于中国西南、华南诸省，特别是在广西西南部高原台地的河溪与云南湖泊中能形成稳定的沉水植物群落。可供观赏、食用、药用，也可作为鸟类、鱼类等动物的饲料，另外还可以用于环境监测[3-4]。但是，由于水体污染、干旱、水位下降、人类的过度采捞等，导致海菜花的数量急剧下降[4]。近年来，海菜花属植物在分类学、生态学、核型研究等方面的报道不断增多[5-10]，但是对海菜花有性生殖过程中大孢子的发生和雌配子体的发育未见报道。本研究对海菜花大孢子的发生和雌配子体的发育情况进行显微观察，从生殖生物学的角度探讨海菜花是否存在生殖障碍，为其濒危机制、繁育和保护研究提供理论依据。
1材料与方法
11材料的采集与栽培
活体材料采自于云南省鹤庆县黑龙潭（编号为HQH-1，100°10′044″E、26°35′400″N，海拔2 192 m）和剑川县金华乡格美江（编号为JCJ-1，96°56′590″E、26°31′134″N，海拔 2 140 m），移栽到昆明学院生命科学与技术系实验楼中，栽培基质为营养土（3份沙 ∶6份红壤土 ∶1份腐殖质土 ∶005份有机肥，均为质量比，本试验所用单位为kg），沉入玻璃缸中，定期人工加水、换水、施肥、打捞藻类、螺类和换土等。
12方法
在开花期间采集雌花，根据花蕾大小分组，清洗后用FAA固定，置于4 ℃冰箱中保存备用。在解剖镜下對雌花进行解剖，观察其形态特征，并记录拍照。铁钒-苏木精整体染色，石蜡切片法制片，切片厚度8～12 μm，中性树胶封片，徕卡数码显微镜（DM2500）下观察并拍照。
2结果与分析
21雌花的形态结构
海菜花为单性花，雌雄异株，据笔者20多年的观察，只要气温适宜即可常年开花。每个雌花花序有3枚绿色总苞，佛焰苞中有2～4枚雌花，雌花有花萼3枚，绿色披针形，花瓣3枚，长1～35 cm，基部黄色，上部白色，倒心形，花柱3枚，橙黄色，分2叉，长约14 cm，退花雄蕊3枚，黄色，线形。雌蕊3心皮3室，子房下位，呈狭长的不规则三棱柱状，子房内有3列倒生的胚珠，胚珠多数。
22大孢子发生
海菜花的胚珠着生于心皮的侧膜胎座（图1-a）上，子房壁内表皮下的细胞平周分裂，产生胚珠原基（图1-a），胚珠原基继续分裂分化，顶端发育成珠心，基部发育成珠柄（图1-b）。珠心表皮细胞下分化出1个孢原细胞，孢原细胞不断发育，体积逐渐增大，细胞核大而明显，易区别于周围的珠心细胞，孢原细胞经过平周分裂形成周缘细胞和造孢细胞，周缘细胞经过平周分裂和垂周分裂形成珠心组织，造孢细胞发育成1个胚囊母细胞（图1-c），与周围的珠心细胞、表皮细胞相比，其体积较大、细胞质浓、细胞核大，胚囊母细胞经过2次分裂形成4个细胞，其中1个为功能性大孢子，功能性大孢子逐渐发育成单核胚囊（图1-d），随即进入雌配子体发育。在大孢子发生的过程中，内外珠被细胞也在不断分裂发育并逐渐包围珠心，最后生长到胚珠顶端，与胚珠顶端愈合在一起，并且在愈合处形成珠孔，为成熟的花粉粒进入胚珠内与卵细胞结合提供通道。
23雌配子体发育
单核胚囊经过1次分裂，形成2个核，2个核分别反方向向胚囊两端移动， 形成二核胚囊（图1-e），二核胚囊不断发
育成熟，再次分裂为四核胚囊（图1-f），四核胚囊发育成熟后再次进行分裂，形成八核胚囊，胚囊近珠孔端有3个细胞，合点端有3个细胞，中央有2个极核（图1-g），胚囊发育属蓼型。随着胚囊的继续发育，合点端的3个反足细胞一段时间后逐渐退化消失。珠孔端为2个助细胞和1个卵细胞形成的卵器，中央的2个极核形成1个中央细胞。分化的卵细胞细胞核较大且明显，细胞质较浓，随后细胞体积增大。卵细胞是胚囊的核心部分，是雌配子。助细胞刚分化时呈楔形，2个助细胞与卵细胞构成卵器，位于细胞的珠孔端，助细胞成熟后，珠孔端会分化出丝状器（图1-h）延伸到2个助细胞中部与之联合，在成熟胚囊里助细胞没有退化。反足细胞位于胚囊的合点端，3个反足细胞分化后很快就开始退化，细胞退化开始的时间比胚囊内其他细胞早一些，成熟的胚囊中有时仅见胚囊的合点端有一些染色较深的反足细胞退化团块（图1-i）。
3讨论与结论
31海菜花的生物学特征
海菜花为单子叶植物，单性花，雌雄异株，雄花和雌花都形成花葶，发育顺序外向式，这一结果与王玉国等报道的路南海菜花的花器官发生的结论[11]相一致。据笔者20余年的栽培观察，其主要繁殖方式为有性生殖，当种子成熟后落入水中萌发或进入泥土后萌发繁殖，也有观察到海菜花克隆繁殖的现象。在海菜花栽培过程中，要求水质清澈，须经常换水，否则易滋生大量藻类，吸附在海菜花叶片上，严重影响生长繁殖，随着藻类数量的增加而导致死亡，这与李杰等报道的海菜花生长抑制藻类的结论[12]有不同的情况。 32海菜花的胚胎学特征
在被子植物中，大孢子母细胞经过减数分裂之后形成的四分体一般呈线形排列或T形排列，在本试验中观察到呈线形排列的四分体，但没有观察到T形排列的四分体；而海菜花功能大孢子是移动到珠孔端，而不是合点端，这与多数功能大孢子位于合点端的被子植物不同，但与王玉国等的结果[11]相同，是海菜花的一个重要生殖特征。
笔者还观察到大孢子发生、雌配子体形成与胚胎发育中均发现了败育现象，其中不同地区的败育率不同，在大孢子发生阶段败育低，而在之后发育阶段中，败育率明显增加，但败育率有所不同，同一采集点同一发育阶段败育率差别不大，也有极少数种群败育率有明显增加或减少的现象。据此推断，海菜花雌蕊的败育现象与生长地区的海拔、温度、水质等环境有一定的关系，但关联度有待研究。
33雌花中雄蕊退化的系统学启示
在海菜花花部器官的解剖中发现，雄花中心有雌蕊退化的痕迹，雌花中有雄蕊退化的痕迹。由此推测，其原始祖先为两性花，在长期的演化过程中，花部器官逐渐发生了变化，由两性花演变为单性花，且雌雄异株，这种改变带来的生物学意义是显而易见的。可以避免自交带来的遗传多样性降低的不利影响，促进个体间甚至是居群间的基因交流。其雄花与雌花均轮状着生，由内向外发育，这使得每一个花序的开放周期变长，提高了雄蕊的传粉、花粉的扩散及花粉输出率等，增强了雌蕊接受外来花粉与受精的概率，从而使雄花与雌花的开放时间与周期得以改变，保证优良性状的稳定遗传，进而使得海菜花可以更好地适应当地环境，维持种群的生存[14]。
通过对海菜花花的形态结构与胚胎发育过程研究，为海菜花属植物的繁殖生物学和传粉生物学提供理论依据，为探讨海菜花属植物在水鳖科中的分类地位及亲缘关系提供胚胎学资料，为该种植物的栽培、引种驯化及保育提供科学依据。
参考文献：
傅立国，金鉴明 中国植物红皮书稀有瀕危植物（第一册）[M] 北京：科学出版社，1992
王斌 波叶海菜花种子储存条件与萌发初步研究[J] 种子，2011，30（9）：5-7
[3]蒋柱檀，李恒，刀志灵，等 云南传统食用植物海菜花（Ottelia acuminata）的民族植物学研究[J] 内蒙古师大学报（自然科学汉文版），2010，39（2）：163-168
[4]翟书华，樊传章，侯思名，等 海菜花花粉母细胞微核技术监测滇池水质污染状况 水资源保护，27（4）：55-57，2011
[5]李恒 滇池海菜花的盛衰[J] 云南大学学报（自然科学版），1985，7（增刊1）：142-146
[6]何景彪，孙祥钟，钟扬，等 海菜花Ottelia acuminata（Gagnep） Dandy的种下分类研究[J] 武汉大学学报（理学版），1991，03：114-120
[7]罗闰良，王徽勤 水车前属的细胞分类学初步研究[J] 武汉大学学报（理学版），1990（1）：111-118
[8]李恒 海菜花属的分类，地理分布和系统发育[J] 中国科学院大学学报，1981，19（1）：29-42
[9]翟书华，王斌，王定康，等 路南海菜花的核型分析及其海菜花属的演化探讨[J] 湖泊科学，2010，22（5）：735-738[HJ17mm]
[10]翟书华，郭庆，樊传章，等 珍稀濒危植物路南海菜花的生物学特性及保护研究[J] 北方园艺，2012，08：81-83
[11]王玉国，唐赛春，刘演，等 路南海菜花的花器官发生[D] 全国系统与进化植物学青年学术研讨会，2002
[12]李杰，王洋，刘红敏，等 海菜花[Ottelia acuminata（Gagnep） Dandy]种植水对藻类生长的影响[J] 贵州科学，2007，25（4）：77-79
[13][JP 1]滕年军，陈发棣，马旭，等 菊花脑大孢子发生、雌配子体与胚胎发育的研究[J] 南京农业大学学报，2008，31（4）：32-36
[14]任明迅 花内雄蕊分化及其适应意义[J] 植物生态学报，2009，33（1）：222-236
关键词：海菜花；大孢子；发生；雌配子体；雌花形态结构；发育形态；繁殖；生物学特性；胚胎学特征；雄蕊退化
中图分类号： S6823201文献标志码：
文章编号：1002-1302（2017）16-0229-02
收稿日期：2017-04-09
基金项目：国家自然科学基金（编号：3136O065）。
作者简介：翟书华（1963—），男，教授，从事资源植物学与生理生态学的教学和研究。E-mail：937701466@qqcom。
通信作者：殷根深，博士，实验师，主要从事植物学教学和研究。E-mail：252351015@qqcom。
海菜花[Ottelia acuminata（Gagnep） Dandy]为水鳖科（Hydrocharitaceae）水车前属植物，别称异叶水车前、龙爪菜、海菜等，多年生大型沉水植物，是中国特有的国家三级重点保护珍稀濒危水生植物[1-2]。曾经广泛分布于中国西南、华南诸省，特别是在广西西南部高原台地的河溪与云南湖泊中能形成稳定的沉水植物群落。可供观赏、食用、药用，也可作为鸟类、鱼类等动物的饲料，另外还可以用于环境监测[3-4]。但是，由于水体污染、干旱、水位下降、人类的过度采捞等，导致海菜花的数量急剧下降[4]。近年来，海菜花属植物在分类学、生态学、核型研究等方面的报道不断增多[5-10]，但是对海菜花有性生殖过程中大孢子的发生和雌配子体的发育未见报道。本研究对海菜花大孢子的发生和雌配子体的发育情况进行显微观察，从生殖生物学的角度探讨海菜花是否存在生殖障碍，为其濒危机制、繁育和保护研究提供理论依据。
1材料与方法
11材料的采集与栽培
活体材料采自于云南省鹤庆县黑龙潭（编号为HQH-1，100°10′044″E、26°35′400″N，海拔2 192 m）和剑川县金华乡格美江（编号为JCJ-1，96°56′590″E、26°31′134″N，海拔 2 140 m），移栽到昆明学院生命科学与技术系实验楼中，栽培基质为营养土（3份沙 ∶6份红壤土 ∶1份腐殖质土 ∶005份有机肥，均为质量比，本试验所用单位为kg），沉入玻璃缸中，定期人工加水、换水、施肥、打捞藻类、螺类和换土等。
12方法
在开花期间采集雌花，根据花蕾大小分组，清洗后用FAA固定，置于4 ℃冰箱中保存备用。在解剖镜下對雌花进行解剖，观察其形态特征，并记录拍照。铁钒-苏木精整体染色，石蜡切片法制片，切片厚度8～12 μm，中性树胶封片，徕卡数码显微镜（DM2500）下观察并拍照。
2结果与分析
21雌花的形态结构
海菜花为单性花，雌雄异株，据笔者20多年的观察，只要气温适宜即可常年开花。每个雌花花序有3枚绿色总苞，佛焰苞中有2～4枚雌花，雌花有花萼3枚，绿色披针形，花瓣3枚，长1～35 cm，基部黄色，上部白色，倒心形，花柱3枚，橙黄色，分2叉，长约14 cm，退花雄蕊3枚，黄色，线形。雌蕊3心皮3室，子房下位，呈狭长的不规则三棱柱状，子房内有3列倒生的胚珠，胚珠多数。
22大孢子发生
海菜花的胚珠着生于心皮的侧膜胎座（图1-a）上，子房壁内表皮下的细胞平周分裂，产生胚珠原基（图1-a），胚珠原基继续分裂分化，顶端发育成珠心，基部发育成珠柄（图1-b）。珠心表皮细胞下分化出1个孢原细胞，孢原细胞不断发育，体积逐渐增大，细胞核大而明显，易区别于周围的珠心细胞，孢原细胞经过平周分裂形成周缘细胞和造孢细胞，周缘细胞经过平周分裂和垂周分裂形成珠心组织，造孢细胞发育成1个胚囊母细胞（图1-c），与周围的珠心细胞、表皮细胞相比，其体积较大、细胞质浓、细胞核大，胚囊母细胞经过2次分裂形成4个细胞，其中1个为功能性大孢子，功能性大孢子逐渐发育成单核胚囊（图1-d），随即进入雌配子体发育。在大孢子发生的过程中，内外珠被细胞也在不断分裂发育并逐渐包围珠心，最后生长到胚珠顶端，与胚珠顶端愈合在一起，并且在愈合处形成珠孔，为成熟的花粉粒进入胚珠内与卵细胞结合提供通道。
23雌配子体发育
单核胚囊经过1次分裂，形成2个核，2个核分别反方向向胚囊两端移动， 形成二核胚囊（图1-e），二核胚囊不断发
育成熟，再次分裂为四核胚囊（图1-f），四核胚囊发育成熟后再次进行分裂，形成八核胚囊，胚囊近珠孔端有3个细胞，合点端有3个细胞，中央有2个极核（图1-g），胚囊发育属蓼型。随着胚囊的继续发育，合点端的3个反足细胞一段时间后逐渐退化消失。珠孔端为2个助细胞和1个卵细胞形成的卵器，中央的2个极核形成1个中央细胞。分化的卵细胞细胞核较大且明显，细胞质较浓，随后细胞体积增大。卵细胞是胚囊的核心部分，是雌配子。助细胞刚分化时呈楔形，2个助细胞与卵细胞构成卵器，位于细胞的珠孔端，助细胞成熟后，珠孔端会分化出丝状器（图1-h）延伸到2个助细胞中部与之联合，在成熟胚囊里助细胞没有退化。反足细胞位于胚囊的合点端，3个反足细胞分化后很快就开始退化，细胞退化开始的时间比胚囊内其他细胞早一些，成熟的胚囊中有时仅见胚囊的合点端有一些染色较深的反足细胞退化团块（图1-i）。
3讨论与结论
31海菜花的生物学特征
海菜花为单子叶植物，单性花，雌雄异株，雄花和雌花都形成花葶，发育顺序外向式，这一结果与王玉国等报道的路南海菜花的花器官发生的结论[11]相一致。据笔者20余年的栽培观察，其主要繁殖方式为有性生殖，当种子成熟后落入水中萌发或进入泥土后萌发繁殖，也有观察到海菜花克隆繁殖的现象。在海菜花栽培过程中，要求水质清澈，须经常换水，否则易滋生大量藻类，吸附在海菜花叶片上，严重影响生长繁殖，随着藻类数量的增加而导致死亡，这与李杰等报道的海菜花生长抑制藻类的结论[12]有不同的情况。 32海菜花的胚胎学特征
在被子植物中，大孢子母细胞经过减数分裂之后形成的四分体一般呈线形排列或T形排列，在本试验中观察到呈线形排列的四分体，但没有观察到T形排列的四分体；而海菜花功能大孢子是移动到珠孔端，而不是合点端，这与多数功能大孢子位于合点端的被子植物不同，但与王玉国等的结果[11]相同，是海菜花的一个重要生殖特征。
笔者还观察到大孢子发生、雌配子体形成与胚胎发育中均发现了败育现象，其中不同地区的败育率不同，在大孢子发生阶段败育低，而在之后发育阶段中，败育率明显增加，但败育率有所不同，同一采集点同一发育阶段败育率差别不大，也有极少数种群败育率有明显增加或减少的现象。据此推断，海菜花雌蕊的败育现象与生长地区的海拔、温度、水质等环境有一定的关系，但关联度有待研究。
33雌花中雄蕊退化的系统学启示
在海菜花花部器官的解剖中发现，雄花中心有雌蕊退化的痕迹，雌花中有雄蕊退化的痕迹。由此推测，其原始祖先为两性花，在长期的演化过程中，花部器官逐渐发生了变化，由两性花演变为单性花，且雌雄异株，这种改变带来的生物学意义是显而易见的。可以避免自交带来的遗传多样性降低的不利影响，促进个体间甚至是居群间的基因交流。其雄花与雌花均轮状着生，由内向外发育，这使得每一个花序的开放周期变长，提高了雄蕊的传粉、花粉的扩散及花粉输出率等，增强了雌蕊接受外来花粉与受精的概率，从而使雄花与雌花的开放时间与周期得以改变，保证优良性状的稳定遗传，进而使得海菜花可以更好地适应当地环境，维持种群的生存[14]。
通过对海菜花花的形态结构与胚胎发育过程研究，为海菜花属植物的繁殖生物学和传粉生物学提供理论依据，为探讨海菜花属植物在水鳖科中的分类地位及亲缘关系提供胚胎学资料，为该种植物的栽培、引种驯化及保育提供科学依据。
参考文献：
傅立国，金鉴明 中国植物红皮书稀有瀕危植物（第一册）[M] 北京：科学出版社，1992
王斌 波叶海菜花种子储存条件与萌发初步研究[J] 种子，2011，30（9）：5-7
[3]蒋柱檀，李恒，刀志灵，等 云南传统食用植物海菜花（Ottelia acuminata）的民族植物学研究[J] 内蒙古师大学报（自然科学汉文版），2010，39（2）：163-168
[4]翟书华，樊传章，侯思名，等 海菜花花粉母细胞微核技术监测滇池水质污染状况 水资源保护，27（4）：55-57，2011
[5]李恒 滇池海菜花的盛衰[J] 云南大学学报（自然科学版），1985，7（增刊1）：142-146
[6]何景彪，孙祥钟，钟扬，等 海菜花Ottelia acuminata（Gagnep） Dandy的种下分类研究[J] 武汉大学学报（理学版），1991，03：114-120
[7]罗闰良，王徽勤 水车前属的细胞分类学初步研究[J] 武汉大学学报（理学版），1990（1）：111-118
[8]李恒 海菜花属的分类，地理分布和系统发育[J] 中国科学院大学学报，1981，19（1）：29-42
[9]翟书华，王斌，王定康，等 路南海菜花的核型分析及其海菜花属的演化探讨[J] 湖泊科学，2010，22（5）：735-738[HJ17mm]
[10]翟书华，郭庆，樊传章，等 珍稀濒危植物路南海菜花的生物学特性及保护研究[J] 北方园艺，2012，08：81-83
[11]王玉国，唐赛春，刘演，等 路南海菜花的花器官发生[D] 全国系统与进化植物学青年学术研讨会，2002
[12]李杰，王洋，刘红敏，等 海菜花[Ottelia acuminata（Gagnep） Dandy]种植水对藻类生长的影响[J] 贵州科学，2007，25（4）：77-79
[13][JP 1]滕年军，陈发棣，马旭，等 菊花脑大孢子发生、雌配子体与胚胎发育的研究[J] 南京农业大学学报，2008，31（4）：32-36
[14]任明迅 花内雄蕊分化及其适应意义[J] 植物生态学报，2009，33（1）：222-236