论文部分内容阅读
[摘要]目的：采用高效液相法测定健脑补肾丸中连翘苷的含量。方法：采用Agilent C18（150×4.6mm，5μm）色谱柱，以乙腈-水（25：75）为流动相，流速1.0 mL·min-1，检测波长277nm，柱温25℃。结果：连翘苷浓度在20.0～100.0μg·mL-1范围内，与峰面积呈良好线性关系；平均加样回收率为98.04%，RSD为0.85%。结论：该方法简便、准确、重复性好，可作为健脑补肾丸质量控制方法。
[关键词]高效液相色谱法；健脑补肾丸；连翘苷；含量测定；质量控制
[中图分类号]R421.3+81 [文献标识码]A [文章编号]1672-5018（2016）12-030-02
健脑补肾丸是由人参、鹿茸、狗鞭、肉桂、连翘、金樱子、杜仲（炭）、当归等25味药材提炼制成，具有健脑补肾，益气健脾，安神定志等功效。连翘苷是连翘中的重要有效成分之一，为木脂类化合物，在抗炎解热方面具有突出作用。目前，对于健脑补肾丸的质量研究多集中于芍药苷和绿原酸等成分的含量测定，未见对连翘苷成分的含量测定的相关文献报道。健脑补肾丸成分复杂，现行质量标准过于简单，不够完善。本实验建立了高效液相色谱法测定其中连翘苷的含量，方法简便快速，对于健脑补肾丸的质量控制具有一定意义。
1仪器和试药
1.1仪器
美国Waters 2695高效液相色谱仪（walers 2996 PDA检测器，Empower色谱工作站），十万分之一电子天平（Mettler Toledo公司），DQHZ-2001A恒温振荡器（江苏太仓华美生化仪器厂），DGG-9053A超声波清洗器（常州国华电器有限公司）。
1.2试药
健腦补肾丸（山东临清华威药业有限），对照品连翘苷（中国药品与生物制品检定研究院），甲醇为色谱纯（江苏汉邦科技有限公司），无水乙醇（AR，江苏彤晟化学试剂有限公司），中性氧化铝（国药集团化学试剂有限公司），超纯水。
2方法与结果
2.1测定方法照高效液相色谱法（通则0512测定）。
色谱条件与系统适用性试验采用Agflent C18（150mm×4.6mm，5μm）色谱柱，以乙腈-水（25：75）为流动相，流速为1.0mL/min，检测波长为277nm，柱温为25℃，进样量为20μL，采集时间为60min。理论板数按连翘苷峰计算应不低于5000，连翘苷峰与相邻峰的分离度应符合要求。
对照品溶液的制备精密称取连翘苷对照品10.00mg，加甲醇制成0.10mg·mL-1连翘苷对照品溶液，即得。
供试品溶液的制备取健脑补肾丸样品适量，于研钵中研细，精密称取研细后的粉末1g，精密加入甲醇15mL，至具塞锥形瓶中，密塞，称定其重量，记录数据，放置12h。超声处理25min，放冷至室温，补足失重，滤过。精密吸取续滤液5mL，于蒸发皿中水浴蒸至约0.5mL，加中性氧化铝粉末0.5g拌样后，蒸干，加于处理好的中性氧化铝柱（100～200目，1.5g，内径15mm）上，用75%乙醇60mL洗脱，收集洗脱液，置水浴上再次蒸干，用50%甲醇溶解，并转入5mL量瓶中，定容到刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液作为供试品溶液。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
2.2方法验证
2.2.1连翘苷的定性
分别取供试品溶液和对照品溶液，按2.1色谱条件，进行色谱图采集。实验结果表明，供试品溶液中主峰的色谱保留时间与连翘苷对照品的保留时间一致。
2.2.2线性关系
精密量取对照品溶液适量，分别制成浓度为20.0、40.0、60.0、80.0、100μg/mL的溶液，按2.1色谱条件进行进样分析，记录色谱图。以对照品溶液浓度为横坐标x，测得的峰面积为纵坐标Y，进行线性回归，得回归方程为Y=8875.7X+13970，R2=0.9994，结果表明，连翘苷在20.0～100.0μg/ml范围内线性关系良好。
2.2.3精密度试验
按2.1色谱条件，取同一对照品溶液（60.0μg/mL），连续进样6次，记录色谱图，以连翘苷峰面积计算，RSD（n=6）为0.31%。结果表明精密度良好。
2.2.4稳定性试验
取同一供试品溶液，分别在0、2、4、8、16、24h，按2.1项色谱条件进样测定，记录色谱图。连翘苷峰面积的RSD为0.13%，表明供试品溶液在24h内稳定。
2.5.4重复性试验
取同一批次样品，按2.1项色谱条件平行测定6次，记录色谱图，计算连翘苷的含量。结果含量为0.9076mg/g，RSD=1.5%，表明方法重复性良好。
2.5.5回收率试验
取已知含量的样品（0.9076mg/g）9份，每份0.5g，分别加入浓度为4.0、6.0、8.0 mg/mL连翘苷对照品溶液各1ml，每个浓度组平行3份，混匀，制成低、中、高3种浓度的待测溶液，按前述实验方法和条件，分别测定，计算回收率，结果见表1。由此可见，低、中、高3种浓度的回收率均在96.56%-99.07%之间，平均回收率为98.04%，RSD为0.85%。表明本定量分析的测定结果准确性较高。
2.5.6含量测定
分别取3个批号的健脑补肾丸，每个样品取2份，按2.1项下方法测定，结果见表2。
3讨论
3.1波长的选择
参考有关文献发现测定连翘苷含量的研究大多使用280hm和277nm波长，极少的研究中使用205nm或228nm的波长。通过实验比较，采用277nm的色谱图基线更加平稳，检出结果中有干扰作用的的杂质峰少，故选择277 nm作为检测波长。
3.2流动相的选择
分别考察了乙腈一水系统和乙腈-0.5%磷酸系统作为流动相，实验结果显示，以乙腈-水系统为流动相，所得色谱峰峰形好，分离效果佳，故选择乙腈-水作为流动相。
3.3提取工艺的考察
在条件摸索过程中，我们根据资料查阅尝试过多中提取方法，其中具有对比价值的实验方法为：取本品细粉适量，置于70%烘箱中干燥18个小时，精密称定2.0g，置索氏提取器中，加入适量甲醇，水浴回流至提取液无色（约6h），回收甲醇至近干，加中性氧化铝0.5g拌样后，蒸干，加于处理好的中性氧化铝柱（100～200目，1.5g，内径15mm）上，用75%乙醇60ml洗脱，收集洗脱液，置水浴上蒸干，用50%甲醇溶解，并转入10ml量瓶中，定容到刻度，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，滤液作为供试品溶液。但是由于该处理方法耗时长，过程繁琐，故最终采用本实验的提取方法。
本实验最终确立了高效液相色谱法测定健脑补肾丸中连翘苷含量，该方法稳定性高，重复性好，分离效果好，样品易处理，为健脑补肾丸的质量控制提供了更为全面的研究依据。
[关键词]高效液相色谱法；健脑补肾丸；连翘苷；含量测定；质量控制
[中图分类号]R421.3+81 [文献标识码]A [文章编号]1672-5018（2016）12-030-02
健脑补肾丸是由人参、鹿茸、狗鞭、肉桂、连翘、金樱子、杜仲（炭）、当归等25味药材提炼制成，具有健脑补肾，益气健脾，安神定志等功效。连翘苷是连翘中的重要有效成分之一，为木脂类化合物，在抗炎解热方面具有突出作用。目前，对于健脑补肾丸的质量研究多集中于芍药苷和绿原酸等成分的含量测定，未见对连翘苷成分的含量测定的相关文献报道。健脑补肾丸成分复杂，现行质量标准过于简单，不够完善。本实验建立了高效液相色谱法测定其中连翘苷的含量，方法简便快速，对于健脑补肾丸的质量控制具有一定意义。
1仪器和试药
1.1仪器
美国Waters 2695高效液相色谱仪（walers 2996 PDA检测器，Empower色谱工作站），十万分之一电子天平（Mettler Toledo公司），DQHZ-2001A恒温振荡器（江苏太仓华美生化仪器厂），DGG-9053A超声波清洗器（常州国华电器有限公司）。
1.2试药
健腦补肾丸（山东临清华威药业有限），对照品连翘苷（中国药品与生物制品检定研究院），甲醇为色谱纯（江苏汉邦科技有限公司），无水乙醇（AR，江苏彤晟化学试剂有限公司），中性氧化铝（国药集团化学试剂有限公司），超纯水。
2方法与结果
2.1测定方法照高效液相色谱法（通则0512测定）。
色谱条件与系统适用性试验采用Agflent C18（150mm×4.6mm，5μm）色谱柱，以乙腈-水（25：75）为流动相，流速为1.0mL/min，检测波长为277nm，柱温为25℃，进样量为20μL，采集时间为60min。理论板数按连翘苷峰计算应不低于5000，连翘苷峰与相邻峰的分离度应符合要求。
对照品溶液的制备精密称取连翘苷对照品10.00mg，加甲醇制成0.10mg·mL-1连翘苷对照品溶液，即得。
供试品溶液的制备取健脑补肾丸样品适量，于研钵中研细，精密称取研细后的粉末1g，精密加入甲醇15mL，至具塞锥形瓶中，密塞，称定其重量，记录数据，放置12h。超声处理25min，放冷至室温，补足失重，滤过。精密吸取续滤液5mL，于蒸发皿中水浴蒸至约0.5mL，加中性氧化铝粉末0.5g拌样后，蒸干，加于处理好的中性氧化铝柱（100～200目，1.5g，内径15mm）上，用75%乙醇60mL洗脱，收集洗脱液，置水浴上再次蒸干，用50%甲醇溶解，并转入5mL量瓶中，定容到刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液作为供试品溶液。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
2.2方法验证
2.2.1连翘苷的定性
分别取供试品溶液和对照品溶液，按2.1色谱条件，进行色谱图采集。实验结果表明，供试品溶液中主峰的色谱保留时间与连翘苷对照品的保留时间一致。
2.2.2线性关系
精密量取对照品溶液适量，分别制成浓度为20.0、40.0、60.0、80.0、100μg/mL的溶液，按2.1色谱条件进行进样分析，记录色谱图。以对照品溶液浓度为横坐标x，测得的峰面积为纵坐标Y，进行线性回归，得回归方程为Y=8875.7X+13970，R2=0.9994，结果表明，连翘苷在20.0～100.0μg/ml范围内线性关系良好。
2.2.3精密度试验
按2.1色谱条件，取同一对照品溶液（60.0μg/mL），连续进样6次，记录色谱图，以连翘苷峰面积计算，RSD（n=6）为0.31%。结果表明精密度良好。
2.2.4稳定性试验
取同一供试品溶液，分别在0、2、4、8、16、24h，按2.1项色谱条件进样测定，记录色谱图。连翘苷峰面积的RSD为0.13%，表明供试品溶液在24h内稳定。
2.5.4重复性试验
取同一批次样品，按2.1项色谱条件平行测定6次，记录色谱图，计算连翘苷的含量。结果含量为0.9076mg/g，RSD=1.5%，表明方法重复性良好。
2.5.5回收率试验
取已知含量的样品（0.9076mg/g）9份，每份0.5g，分别加入浓度为4.0、6.0、8.0 mg/mL连翘苷对照品溶液各1ml，每个浓度组平行3份，混匀，制成低、中、高3种浓度的待测溶液，按前述实验方法和条件，分别测定，计算回收率，结果见表1。由此可见，低、中、高3种浓度的回收率均在96.56%-99.07%之间，平均回收率为98.04%，RSD为0.85%。表明本定量分析的测定结果准确性较高。
2.5.6含量测定
分别取3个批号的健脑补肾丸，每个样品取2份，按2.1项下方法测定，结果见表2。
3讨论
3.1波长的选择
参考有关文献发现测定连翘苷含量的研究大多使用280hm和277nm波长，极少的研究中使用205nm或228nm的波长。通过实验比较，采用277nm的色谱图基线更加平稳，检出结果中有干扰作用的的杂质峰少，故选择277 nm作为检测波长。
3.2流动相的选择
分别考察了乙腈一水系统和乙腈-0.5%磷酸系统作为流动相，实验结果显示，以乙腈-水系统为流动相，所得色谱峰峰形好，分离效果佳，故选择乙腈-水作为流动相。
3.3提取工艺的考察
在条件摸索过程中，我们根据资料查阅尝试过多中提取方法，其中具有对比价值的实验方法为：取本品细粉适量，置于70%烘箱中干燥18个小时，精密称定2.0g，置索氏提取器中，加入适量甲醇，水浴回流至提取液无色（约6h），回收甲醇至近干，加中性氧化铝0.5g拌样后，蒸干，加于处理好的中性氧化铝柱（100～200目，1.5g，内径15mm）上，用75%乙醇60ml洗脱，收集洗脱液，置水浴上蒸干，用50%甲醇溶解，并转入10ml量瓶中，定容到刻度，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，滤液作为供试品溶液。但是由于该处理方法耗时长，过程繁琐，故最终采用本实验的提取方法。
本实验最终确立了高效液相色谱法测定健脑补肾丸中连翘苷含量，该方法稳定性高，重复性好，分离效果好，样品易处理，为健脑补肾丸的质量控制提供了更为全面的研究依据。