目的建立一种相同供体来源人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)的多批次原代分离技术,提高脐带标本利用度和干细胞产量。方法采用组织块贴壁法分离hUC-MSCs。脐带组织块贴壁培养前预先用血清浸泡;收获首批hUC-MSCs的同时,回收仅利用1次的脐带组织块,重新铺板培养,相同供体来源的脐带组织块共反复培养3次,即:分3批次从组织块中分离hUC-MSCs;同时,收集第1、2批次原代培养体系的培养上清,转瓶后单独孵育,从中收获hUC-MSCs。比较各批次hUC-MSCs的最早出现时间、第1次传代时间、细胞数量等,并鉴定其细胞形态、免疫表型、增殖及分化能力。结果用血清预先浸泡脐带组织块,可显著缩短原代细胞收获时间、提高组织块培养成功率和增加细胞产量。与初次培养的脐带组织块相比,回收的脐带组织块及其培养上清均可在较短时间内获得数量更多的原代细胞。脐带组织块通过3次贴壁培养和2次上清回收孵育所获得的原代细胞总数,为相同实验条件下传统分离方法的(27.48±3.98)倍。各批次细胞均具有典型的间充质干细胞形态、免疫表型,以及正常和相近的增殖、分化能力。结论脐带组织块具有持续多次产出hUC-MSCs的能力,其培养上清也可作为hUC-MSCs的来源,基于此建立的多批次分离方法极大地提高了源自同一脐带标本的原代干细胞的分离效率和产量,实现了相同供体hUC-MSCs的高质量、多批次稳定分离。