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摘 要：为提高淫羊藿药渣中复合氨基酸的检测分析准确度，该试验对其复合氨基酸水解液进行脱色工艺优化。首先筛选最佳脱色剂，然后通过响应面法优化复合氨基酸水解液脱色工艺条件，使水解液脱色率和氨基酸回收率最佳。通过筛选，AB-8大孔树脂适合用于淫羊藿药渣复合氨基酸水解液脱色，响应面法优化得到的最佳脱色工艺条件为：树脂用量0.22 g，脱色时间27 min，脱色温度24℃，经验证，该条件下，水解液脱色率为79.05%，氨基酸回收率为90.88%。应用响应面法能优化脱色工艺条件，用以满足检测分析的精度要求。
关键词：淫羊藿药渣;脱色;响应面法
中图分类号：S38;R931
文献标识码：A
文章编号：1008-0457（2019）03-00-0 国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2019.03.001
Abstract：To improve accuracy of the detection and analysis of amino acid mixture in the Epimedium drug residue，the decolorization process for the hydrolysate of amino acid mixture was optimized in this study. Firstly，the optimum decolorizer was screened，and then the decolorization conditions for the hydrolysate of amino acid mixture were optimized by the response surface method to optimize the decolorization rate and the recovery rate of the amino acid mixture. AB-8 macroporous resin was suitable for the decolorization of amino acid hydrolysate. The optimum decolorization conditions were as follows：resin dosage，0.22 g; decolorization time，27 min; decolorization temperature，24℃. it was verified that under this condition，the decolorization rate of the hydrolyzate was 79.05%，and the amino acid recovery rate was 90.88%. The response surface method can be used to optimize the decolorization process conditions to meet the accuracy requirements of detection and analysis.
Key words：epimedium drug residue; decolorization; response surface analysis
中藥渣作为一种植物源性废料，仍含有氮、磷、钾等植物生长所必需的多种营养成分[1]。经水提之后的淫羊藿药渣剩余功能性成分很少被有效开发与利用，如黄酮类、三萜类、鞣质等。准确分析其中的碳源、氮源有效成分的含量，以便于科学地开发与利用。
淫羊藿药渣经水解后，水解液中的色素对氨基酸的定性与定量分析均有严重的干扰[2]。因此，分析前应进行纯化脱色。目前大多数研究都是基于活性炭脱色工艺的研究，利用响应面法优化大孔树脂脱色工艺的研究报道较少。响应面法在优化反应条件、研究多因素间相互作用的过程中较正交试验更直观、连续、简便[3]。在脱色流程中，尽管活性炭脱色效果良好[4]，但氨基酸保留率较低，且脱色时间长，难于过滤。而大孔树脂具有理化稳定性高、处理能力大、选择性好、脱色时间短、解吸条件温和及再生处理方便等优点[5-7]。但是，大孔树脂脱色受环境因素影响较大[8]，在不同条件下，表现出不同的脱色效果以及对目标产物的吸附性也不一样，影响目标产物的检测分析结果的准确度。因此，需要严格控制脱色工艺条件，优化脱色工艺条件，有利于提高大孔树脂的脱色性能，同时提高目标产物较高的回收率，对精确定量分析有重要意义。本试验首先通过筛选不同的脱色剂，在单因素试验的基础上，利用响应面法优化淫羊藿药渣中复合氨基酸水解液脱色工艺条件，确定合理的脱色工艺参数，以提高检测淫羊藿药渣氨基酸定量分析[9]的准确度提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
淫羊藿药渣（贵州同济堂制药有限公司提供），活性炭（国药集团化学试剂有限公司），AB-8大孔树脂、732强酸型大孔树脂、122弱酸型大孔树脂、330弱碱型大孔树脂、硅藻土（陕西蓝深特种树脂有限公司），浓盐酸、氢氧化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、茚三酮（2，2-二羟基二氢化茚-1，3-二酮）、氯化亚锡均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
UV-1800紫外可见分光光度计（岛津仪器（苏州）有限公司），FE-20KpH计（梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司），GZX-9023电热鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司），分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司），GST25-20赶酸仪（天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司），HH-4恒温水浴锅（江苏省金坛市友联仪器研究所），SH2-88水浴恒温振荡器（太仓市实验设备厂）。 1.3 试验方法
1.3.1 复合氨基酸水解液制备及脱色剂预处理
精密称取干燥至恒重的淫羊藿药渣粉末100.0 mg于水解管中，加6.0 mol/L浓盐酸水解，冷冻，抽真空，充氮气，密封条件下110℃水解22～24小时[10]。赶酸[11]，减压浓缩，底部留有少许固体或痕渍为止。加缓冲液溶解，转移至50 mL容量瓶，定容，作为供试品溶液。
活性炭、AB-8大孔树脂、732型大孔树脂、122型大孔树脂、330型大孔树脂、硅藻土的预处理方法参照相关文献[12-14]。
1.3.2 复合氨基酸水解液脱色率与回收率的计算
氨基酸的检测采用茚三酮显色法：取8支试管，分别量取100 mg/mL天冬氨酸标准溶液0，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2 mL，加蒸馏水稀释至2.0 mL，加pH值为6.5的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液2.0 mL，最后每一管加2%茚三酮溶液[15]1.0 mL，摇匀。100 ℃水浴加热15 min，于567 nm处测定吸光度[16]，平行测定三次。供试品同法操作测定吸光度。以氨基酸含量x为横坐标，以吸光度y为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为y= 0.0185 x - 0.7901，r2=0.9951 。氨基酸脱色率（D）与回收率（R）计算公式：
D（%）=（脱色前吸光度-脱色后吸光度）/ 脱色前吸光度×100%[17]
R（%）= 脱色后多糖含量（ug）/ 脱色前多糖含量（ug）×100%[18]
1.3.3 脱色剂筛选
静态吸附法[19]：取5 mL供试品溶液置于25 mL具塞试管中，再加入适量预处理后的脱色剂，将各试管置于恒温水浴振荡箱中，30℃恒温水浴振荡60 min[20]，测定并计算溶液的脱色率和氨基酸回收率。
1.3.4 AB-8大孔树脂脱色工艺优化
（1）单因素试验考察：分别考察三个单因素[21]，即树脂用量（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g），脱色时间（20、30、40、50、60 min），脱色温度（20、25、30、35、40℃）对供试品溶液脱色率和氨基酸回收率的影响。（2）响应面法优化脱色工艺：根据单因素考察的试验结果[22]，设计三因素三水平的中心点组合试验，考察树脂用量（A）、脱色时间（B）、脱色温度（B）三个因素对水解液脱色率和回收率的综合影响。
2 结果与分析
2.1 脱色剂的筛选
由图1可看出，活性炭的脱色率最高，122弱酸型阳离子交换树脂的氨基酸回收率最高，而AB-8大孔树脂在保证较高的脱色率（66.82%）的条件下，氨基酸回收率（90.54%）仍然很高。因此，本试验使用AB-8大孔树脂作为淫羊藿药渣复合氨基酸水解液的脱色剂。
2.2 单因素试验考察结果
由图2可知，随着大孔树脂用量的增加，水解液脱色率逐渐升高，氨基酸回收率逐渐降低，树脂用量在0.1～0.3 g范围内，水解液脱色率有显著升高的趋势，同时氨基酸回收率降低趋势不明显，因此，应用响应面法筛选的树脂用量的梯度范围为0.1～0.3 g;由图3可知，随着脱色时间的延长，水解液脱色率逐渐升高，氨基酸回收率逐渐降低，脱色时间在20～40 min范围内，水解液脱色率有显著升高的趋势，同时氨基酸回收率降低趋势不明显，因此，应用响应面法筛选的脱色时间梯度范围为20～40 min;由图4可知，随着脱色温度的升高，水解脱色率逐渐降低，氨基酸回收率略有升高，脱色温度在20～30℃范围内，水解液脱色率降低趋势不明显，同时氨基酸回收率仍然处于很高水平，因此，应用响应面法筛选的脱色温度梯度范围为20 ～ 30℃。响应面设计因素水平表见表1。
2.3 响应面设计试验结果
采用Design-Expert 8.05b软件对响应值与各因素进行回归拟合后，分别得到脱色率回归方程与回收率回归方程：
脱色率（%）= 77.87 + 5.67 A - 3.05 B - 3.43 C - 6.36 AB + 2.58 AC + 0.22 BC - 22.04 A2 - 7.37 B2 - 10.08 C2，该方程R2 = 0.9991;
回收率（%）= 89.94 + 5.83 A - 3.29 B - 5.61 C - 4.33 AB - 5.37 AC - 3.00 BC - 15.47 A2- 10.73 B2 - 11.64 C2，該方程R2 = 0.9997。这两个方程的相关系数表明，回归分析方程的可信度较好[23]，能够分析和预测优化后的脱色率和回收率。脱色率回归方程的分析结果表明，该模型的F值为1172.38，且P<0.001（表明该模型具有极显著性差异），具有统计学意义，与纯误差正相关的失拟项的F值为2.84，不显著（P>0.05），说明该方法与实际试验差异较小，拟合程度较好[24]，脱色率预测值能符合实际检验结果。脱色率的回归方程各项方差分析结果表明，树脂用量（A）、脱色时间（B）、脱色温度（C）三个因素均对响应值脱色率有极显著影响，三个因素的影响程度由大到小依次为：A > C > B，且A与B、A与C之间存在一定程度交联影响，但B与C之间无交联影响;回收率回归方程的分析结果同样表明，该模型的F值为3342.61，且P < 0.001（表明该模型具有极显著性差异），该模型具有统计学意义，与纯误差正相关的失拟项的F值为4.33，不显著（P>0.05），说明该方法与实际试验差异较小，拟合程度较好，回收率预测值能符合实际检验结果。回收率的回归方程各项方程分析结果表明，A、B、C三个因素均对响应值脱色率有极显著影响，三个因素的影响程度由大到小依次为：A > C > B，且A与B、A与C、B与C之间均存在一定程度交联影响。 2.4 验证试验
根据响应面法优化得到的最佳脱色工艺条件为：树脂用量0.22 g，脱色时间27.12 min，脱色温度24.07℃，结合实验室实际情况，将该条件调整为：树脂用量0.22 g，脱色时间27 min，脱色温度24℃。经过5次平行试验验证，该条件下水解液的脱色率平均值为79.05%，氨基酸回收率的平均值为90.88%。因此，证明通过响应面法能优化复合氨基酸水解液的脱色工艺条件，同时能较好地分析与预测最终试验结果。
3 结论与讨论
该试验通过响应面法优化复合氨基酸水解液脱色工艺条件，通过考察树脂用量、脱色时间、脱色温度三个因素对该试样脱色率和回收率的影响，结果表明，三个因素均能对水解液脱色率和氨基酸回收率产生极显著影响，且影响程度大小均为：树脂用量 > 脱色温度 > 脱色时间。经响应面法优化，得到最佳脱色工艺条件为：树脂用量0.22 g，脱色时间27 min，脱色温度24℃。经验证，该条件下，水解液脱色率为79.05%，氨基酸回收率为90.88%，与模型预测值接近，很好地证明了该模型的可靠性。
大多数常见氨基酸的等电点范围是5～7[25]，将复合氨基酸缓冲溶液的pH值控制在8～ 10，使这些氨基酸的极性增强，能提高其溶解度。该试验中选取弱极性的AB-8大孔树脂作为脱色剂，因为其能选择性吸附弱极性有色物质，而达到脱色的目的，同时最大程度地保留目标产物，但是仍然有少部分等电点大于7的氨基酸会被树脂吸附而损失掉，如赖氨酸、精氨酸、组氨酸。当AB-8大孔树脂用量过多，也会造成目标产品损失过多;另一方面，AB-8大孔树脂在高温的条件下，容易发生解吸附，造成脱色率下降，因此，控制好树脂用量与脱色温度是进行该项研究的关键。该试验对复合氨基酸水解液脱色工艺优化，能优化该试样的纯化工艺流程，便于建立高效快捷的检测分析方法，为此提供可行参考依据。
参 考 文 献：
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关键词：淫羊藿药渣;脱色;响应面法
中图分类号：S38;R931
文献标识码：A
文章编号：1008-0457（2019）03-00-0 国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2019.03.001
Abstract：To improve accuracy of the detection and analysis of amino acid mixture in the Epimedium drug residue，the decolorization process for the hydrolysate of amino acid mixture was optimized in this study. Firstly，the optimum decolorizer was screened，and then the decolorization conditions for the hydrolysate of amino acid mixture were optimized by the response surface method to optimize the decolorization rate and the recovery rate of the amino acid mixture. AB-8 macroporous resin was suitable for the decolorization of amino acid hydrolysate. The optimum decolorization conditions were as follows：resin dosage，0.22 g; decolorization time，27 min; decolorization temperature，24℃. it was verified that under this condition，the decolorization rate of the hydrolyzate was 79.05%，and the amino acid recovery rate was 90.88%. The response surface method can be used to optimize the decolorization process conditions to meet the accuracy requirements of detection and analysis.
Key words：epimedium drug residue; decolorization; response surface analysis
中藥渣作为一种植物源性废料，仍含有氮、磷、钾等植物生长所必需的多种营养成分[1]。经水提之后的淫羊藿药渣剩余功能性成分很少被有效开发与利用，如黄酮类、三萜类、鞣质等。准确分析其中的碳源、氮源有效成分的含量，以便于科学地开发与利用。
淫羊藿药渣经水解后，水解液中的色素对氨基酸的定性与定量分析均有严重的干扰[2]。因此，分析前应进行纯化脱色。目前大多数研究都是基于活性炭脱色工艺的研究，利用响应面法优化大孔树脂脱色工艺的研究报道较少。响应面法在优化反应条件、研究多因素间相互作用的过程中较正交试验更直观、连续、简便[3]。在脱色流程中，尽管活性炭脱色效果良好[4]，但氨基酸保留率较低，且脱色时间长，难于过滤。而大孔树脂具有理化稳定性高、处理能力大、选择性好、脱色时间短、解吸条件温和及再生处理方便等优点[5-7]。但是，大孔树脂脱色受环境因素影响较大[8]，在不同条件下，表现出不同的脱色效果以及对目标产物的吸附性也不一样，影响目标产物的检测分析结果的准确度。因此，需要严格控制脱色工艺条件，优化脱色工艺条件，有利于提高大孔树脂的脱色性能，同时提高目标产物较高的回收率，对精确定量分析有重要意义。本试验首先通过筛选不同的脱色剂，在单因素试验的基础上，利用响应面法优化淫羊藿药渣中复合氨基酸水解液脱色工艺条件，确定合理的脱色工艺参数，以提高检测淫羊藿药渣氨基酸定量分析[9]的准确度提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
淫羊藿药渣（贵州同济堂制药有限公司提供），活性炭（国药集团化学试剂有限公司），AB-8大孔树脂、732强酸型大孔树脂、122弱酸型大孔树脂、330弱碱型大孔树脂、硅藻土（陕西蓝深特种树脂有限公司），浓盐酸、氢氧化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、茚三酮（2，2-二羟基二氢化茚-1，3-二酮）、氯化亚锡均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
UV-1800紫外可见分光光度计（岛津仪器（苏州）有限公司），FE-20KpH计（梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司），GZX-9023电热鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司），分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司），GST25-20赶酸仪（天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司），HH-4恒温水浴锅（江苏省金坛市友联仪器研究所），SH2-88水浴恒温振荡器（太仓市实验设备厂）。 1.3 试验方法
1.3.1 复合氨基酸水解液制备及脱色剂预处理
精密称取干燥至恒重的淫羊藿药渣粉末100.0 mg于水解管中，加6.0 mol/L浓盐酸水解，冷冻，抽真空，充氮气，密封条件下110℃水解22～24小时[10]。赶酸[11]，减压浓缩，底部留有少许固体或痕渍为止。加缓冲液溶解，转移至50 mL容量瓶，定容，作为供试品溶液。
活性炭、AB-8大孔树脂、732型大孔树脂、122型大孔树脂、330型大孔树脂、硅藻土的预处理方法参照相关文献[12-14]。
1.3.2 复合氨基酸水解液脱色率与回收率的计算
氨基酸的检测采用茚三酮显色法：取8支试管，分别量取100 mg/mL天冬氨酸标准溶液0，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2 mL，加蒸馏水稀释至2.0 mL，加pH值为6.5的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液2.0 mL，最后每一管加2%茚三酮溶液[15]1.0 mL，摇匀。100 ℃水浴加热15 min，于567 nm处测定吸光度[16]，平行测定三次。供试品同法操作测定吸光度。以氨基酸含量x为横坐标，以吸光度y为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为y= 0.0185 x - 0.7901，r2=0.9951 。氨基酸脱色率（D）与回收率（R）计算公式：
D（%）=（脱色前吸光度-脱色后吸光度）/ 脱色前吸光度×100%[17]
R（%）= 脱色后多糖含量（ug）/ 脱色前多糖含量（ug）×100%[18]
1.3.3 脱色剂筛选
静态吸附法[19]：取5 mL供试品溶液置于25 mL具塞试管中，再加入适量预处理后的脱色剂，将各试管置于恒温水浴振荡箱中，30℃恒温水浴振荡60 min[20]，测定并计算溶液的脱色率和氨基酸回收率。
1.3.4 AB-8大孔树脂脱色工艺优化
（1）单因素试验考察：分别考察三个单因素[21]，即树脂用量（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g），脱色时间（20、30、40、50、60 min），脱色温度（20、25、30、35、40℃）对供试品溶液脱色率和氨基酸回收率的影响。（2）响应面法优化脱色工艺：根据单因素考察的试验结果[22]，设计三因素三水平的中心点组合试验，考察树脂用量（A）、脱色时间（B）、脱色温度（B）三个因素对水解液脱色率和回收率的综合影响。
2 结果与分析
2.1 脱色剂的筛选
由图1可看出，活性炭的脱色率最高，122弱酸型阳离子交换树脂的氨基酸回收率最高，而AB-8大孔树脂在保证较高的脱色率（66.82%）的条件下，氨基酸回收率（90.54%）仍然很高。因此，本试验使用AB-8大孔树脂作为淫羊藿药渣复合氨基酸水解液的脱色剂。
2.2 单因素试验考察结果
由图2可知，随着大孔树脂用量的增加，水解液脱色率逐渐升高，氨基酸回收率逐渐降低，树脂用量在0.1～0.3 g范围内，水解液脱色率有显著升高的趋势，同时氨基酸回收率降低趋势不明显，因此，应用响应面法筛选的树脂用量的梯度范围为0.1～0.3 g;由图3可知，随着脱色时间的延长，水解液脱色率逐渐升高，氨基酸回收率逐渐降低，脱色时间在20～40 min范围内，水解液脱色率有显著升高的趋势，同时氨基酸回收率降低趋势不明显，因此，应用响应面法筛选的脱色时间梯度范围为20～40 min;由图4可知，随着脱色温度的升高，水解脱色率逐渐降低，氨基酸回收率略有升高，脱色温度在20～30℃范围内，水解液脱色率降低趋势不明显，同时氨基酸回收率仍然处于很高水平，因此，应用响应面法筛选的脱色温度梯度范围为20 ～ 30℃。响应面设计因素水平表见表1。
2.3 响应面设计试验结果
采用Design-Expert 8.05b软件对响应值与各因素进行回归拟合后，分别得到脱色率回归方程与回收率回归方程：
脱色率（%）= 77.87 + 5.67 A - 3.05 B - 3.43 C - 6.36 AB + 2.58 AC + 0.22 BC - 22.04 A2 - 7.37 B2 - 10.08 C2，该方程R2 = 0.9991;
回收率（%）= 89.94 + 5.83 A - 3.29 B - 5.61 C - 4.33 AB - 5.37 AC - 3.00 BC - 15.47 A2- 10.73 B2 - 11.64 C2，該方程R2 = 0.9997。这两个方程的相关系数表明，回归分析方程的可信度较好[23]，能够分析和预测优化后的脱色率和回收率。脱色率回归方程的分析结果表明，该模型的F值为1172.38，且P<0.001（表明该模型具有极显著性差异），具有统计学意义，与纯误差正相关的失拟项的F值为2.84，不显著（P>0.05），说明该方法与实际试验差异较小，拟合程度较好[24]，脱色率预测值能符合实际检验结果。脱色率的回归方程各项方差分析结果表明，树脂用量（A）、脱色时间（B）、脱色温度（C）三个因素均对响应值脱色率有极显著影响，三个因素的影响程度由大到小依次为：A > C > B，且A与B、A与C之间存在一定程度交联影响，但B与C之间无交联影响;回收率回归方程的分析结果同样表明，该模型的F值为3342.61，且P < 0.001（表明该模型具有极显著性差异），该模型具有统计学意义，与纯误差正相关的失拟项的F值为4.33，不显著（P>0.05），说明该方法与实际试验差异较小，拟合程度较好，回收率预测值能符合实际检验结果。回收率的回归方程各项方程分析结果表明，A、B、C三个因素均对响应值脱色率有极显著影响，三个因素的影响程度由大到小依次为：A > C > B，且A与B、A与C、B与C之间均存在一定程度交联影响。 2.4 验证试验
根据响应面法优化得到的最佳脱色工艺条件为：树脂用量0.22 g，脱色时间27.12 min，脱色温度24.07℃，结合实验室实际情况，将该条件调整为：树脂用量0.22 g，脱色时间27 min，脱色温度24℃。经过5次平行试验验证，该条件下水解液的脱色率平均值为79.05%，氨基酸回收率的平均值为90.88%。因此，证明通过响应面法能优化复合氨基酸水解液的脱色工艺条件，同时能较好地分析与预测最终试验结果。
3 结论与讨论
该试验通过响应面法优化复合氨基酸水解液脱色工艺条件，通过考察树脂用量、脱色时间、脱色温度三个因素对该试样脱色率和回收率的影响，结果表明，三个因素均能对水解液脱色率和氨基酸回收率产生极显著影响，且影响程度大小均为：树脂用量 > 脱色温度 > 脱色时间。经响应面法优化，得到最佳脱色工艺条件为：树脂用量0.22 g，脱色时间27 min，脱色温度24℃。经验证，该条件下，水解液脱色率为79.05%，氨基酸回收率为90.88%，与模型预测值接近，很好地证明了该模型的可靠性。
大多数常见氨基酸的等电点范围是5～7[25]，将复合氨基酸缓冲溶液的pH值控制在8～ 10，使这些氨基酸的极性增强，能提高其溶解度。该试验中选取弱极性的AB-8大孔树脂作为脱色剂，因为其能选择性吸附弱极性有色物质，而达到脱色的目的，同时最大程度地保留目标产物，但是仍然有少部分等电点大于7的氨基酸会被树脂吸附而损失掉，如赖氨酸、精氨酸、组氨酸。当AB-8大孔树脂用量过多，也会造成目标产品损失过多;另一方面，AB-8大孔树脂在高温的条件下，容易发生解吸附，造成脱色率下降，因此，控制好树脂用量与脱色温度是进行该项研究的关键。该试验对复合氨基酸水解液脱色工艺优化，能优化该试样的纯化工艺流程，便于建立高效快捷的检测分析方法，为此提供可行参考依据。
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