[摘要] 目的 探讨载脂蛋白C3（APOC3）在动脉粥样硬化病人血清中的表达及对肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和连接黏附分子-1（JAM-1）表达影响。
　　方法 收集24例冠状动脉无狭窄和56例冠状动脉有狭窄心脏病病人外周血清，采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白质印迹法（Western blot）检测APOC3基因和蛋白表达水平。体外培养人血管内皮细胞，用不同浓度的APOC3或TNF-α作用后，应用qRT-PCR和Western blot检测TNF-α和（或）JAM-1基因和蛋白表达水平。
　　结果 APOC3在冠状动脉有狭窄心脏病病人外周血清中的表达水平为（7.42±1.68）g/L，明显高于冠状动脉无狭窄病人的（9.36±3.65）g/L，差异有显著性（t=2.790，P<0.05）。APOC3作用后的人血管内皮细胞中TNF-α、JAM-1基因和蛋白表达水平明显升高（F=28.746～178.421，P<0.001）。TNF-α作用后的人血管内皮细胞中JAM-1基因和蛋白表达水平明显升高（t=8.167、15.589，P<0.001）。
　　結论
　　APOC3在动脉粥样硬化病人外周血清中高表达。APOC3能够促进血管内皮细胞中TNF-α、JAM-1的表达，而TNF-α能够促进血管内皮细胞中JAM-1的表达。
　　[关键词] 冠状动脉疾病;载脂蛋白CⅢ;连接黏附分子-1;肿瘤坏死因子α;内皮细胞
　　[中图分类号] R541.4;R977.6
　　[文献标志码] A
　　[文章编号] 2096-5532（2020）03-301-04
　　doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.104
　　[开放科学（资源服务）标识码（OSID）]
　　[网络出版] http：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.r.20200528.0827.001.html;2020-05-28 13：05
　　MEASUREMENT OF APOC3 IN THE SERUM OF ATHEROSCLEROTIC PATIENTS AND ITS EFFECT ON THE EXPRESSION OF TNF-α AND JAM-1
　　SHI Shuaitao， WANG Guoquan， LI Xiaojian， HAN Wenhao， ZHAI Shuiting
　　（Department of Vascular Surgery， Fuwai Central China Cardiovascular Hospital （Henan People’s Hospital）， Zhengzhou， 450000， China）
　　[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the expression of apolipoprotein C3 （APOC3） in the serum of patients with atherosclerosis and its effect on the expression of tumor necrosis factor-α （TNF-α） and junctional adhesion molecule 1 （JAM-1）.
　　Me-
　　thodsPeripheral sera were collected from 24 heart disease patients without coronary artery stenosis and 56 patients with coronary artery stenosis， and quantitative real-time PCR （qRT-PCR） and Western blot were used to determine the expression levels of APOC3 mRNA and protein. Human vascular endothelial cells were cultured in vitro and treated with different concentrations of APOC3 or TNF-α; then qRT-PCR and Western blot were performed to determine the expression levels of TNF-α and/or JAM-1 mRNA and protein.
　　ResultsThe heart disease patients with coronary artery stenosis had a significantly higher expression level of APOC3 in peripheral serum than those without coronary artery stenosis （（7.42±1.68） g/L vs （9.36±3.65） g/L;t=2.790，P<0.05）. Human vascular endothelial cells had significantly increased mRNA and protein expression of TNF-α and JAM-1 after being treated with APOC3 （F=28.746-178.421，P<0.001）， and had significantly increased mRNA and protein expression of JAM-1 after being treated with TNF-α （t=8.167，15.589;P<0.001）. 　　ConclusionAPOC3 is highly expressed in the peripheral serum of patients with atherosclerosis. APOC3 can promote the expression of TNF-α and JAM-1 in vascular endothelial cells， while TNF-α can promote the expression of JAM-1 in vascular endothelial cells.
　　[KEY WORDS]coronary artery disease; apolipoprotein C-Ⅲ;  junction adhesion molecule 1; tumor necrosis factor-alpha; endothelial cells
　　
　　心血管系统疾病的致死率在全部疾病中位居首位，心血管疾病严重危害着人类的生命健康[1]。动脉粥样硬化是一种常见的发生于心血管系统的疾病，也是心血管疾病发生的征兆[2]。高血压、高脂血症、糖尿病、肥胖等均能夠引发动脉粥样硬化[3]。冠心病是动脉粥样硬化导致的较为典型的心血管疾病[4]。动脉粥样硬化的发病机制是目前研究的热点。载脂蛋白C3（APOC3）广泛存在于人体内，在循环血浆中稳定表达[5]。APOC3与冠心病、高血压、糖尿病等疾病的发生密切相关[6]。血管内皮细胞存在于血管的最内层，在动脉粥样硬化的发生过程中具有重要的作用，而APOC3是血管内皮细胞功能的障碍因子[7]。目前，关于APOC3对血管内皮细胞肿瘤坏死因子-α（TNF-α）与连接黏附分子-1（JAM-1）表达的影响还不明确。本研究分别收集了冠状动脉有狭窄和无狭窄心脏病病人外周血清，检测APOC3的表达水平，并以血管内皮细胞为研究对象，
　　探讨APOC3对TNF-α与JAM-1表达影响，以期为进一步研究动脉粥样硬化的发病机制奠定基础。
　　现将结果报告如下。
　　1 资料与方法
　　1.1 一般资料
　　2017年12月—2018年10月，选取在我院行手术或冠状动脉造影检测的心脏病病人80例，男性42例，女性38例，平均年龄48岁。其中有冠状动脉狭窄者56例，无狭窄者24例。均符合文献的诊断标准[8]。冠状动脉狭窄病人与无狭窄者的年龄、性别等均匹配。本研究病人及家属均知情同意，并经过医院伦理委员会批准。
　　1.2 实验材料
　　人脐静脉血管内皮细胞购自美国ATCC公司。APOC3、TNF-α试剂购自Prepro Tech公司;TNF-α、JAM-1、GAPDH单克隆抗体购自美国CTS公司;人APOC3 ELISA检测试剂盒购自上海超研生物科技有限公司;CO2培养箱购自美国Thermo公司;倒置显微镜购自日本尼康公司。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）试剂盒、cDNA合成试剂盒均购自天根生化科技（北京）有限公司;CFX 96Touch荧光定量PCR仪、GelDoc 2000凝胶成像系统均购自美国Bio-Rad公司。
　　1.3 实验方法
　　1.3.1 血清APOC3水平检测 采集80例心脏病病人空腹12 h后的外周静脉血3 mL。血液凝固后分离出血清。采用ELISA法检测血清中APOC3含量。按照试剂盒说明书操作。
　　1.3.2 细胞培养 取出保存于液氮罐中的人血管内皮细胞，置37 ℃培养箱中融化后，加入含有体积分数0.10胎牛血清（FBS）的DMEM细胞培养液，混匀后以1 000 r/min离心10 min，弃上清液，用5 mL细胞培养液悬浮细胞，接种到细胞培养瓶中，置37 ℃、体积分数0.05 CO2培养箱中培养。48 h后，观察细胞约为90%融合时，弃掉细胞悬浮液，用PBS洗涤细胞2次。加入2.5 g/L胰蛋白酶消化细胞，离心后用细胞培养液悬浮细胞，接种到细胞培养瓶中继续培养。
　　1.3.3 qRT-PCR检测人血管内皮细胞中TNF-α、JAM-1 mRNA表达 取培养至对数生长期的人血管内皮细胞，加入胰蛋白酶消化细胞后，再加入细胞培养液悬浮细胞，接种到12孔细胞培养板中，调整细胞密度使每孔中加入的细胞数为4×105个。置37 ℃、体积分数0.05 CO2培养箱中培养24 h后，弃上清液。在细胞中分别加入终浓度为0、15、30、60、120 mg/L的APOC3作用16 h后，用PBS洗涤细胞2次。加入Trizol细胞裂解液，提取细胞RNA，按照荧光定量PCR试剂盒说明书分别检测TNF-α、JAM-1 mRNA水平。所用引物及其序列见表1。实验重复3次，每次3个复孔。
　　1.3.4 Western blot检测人血管内皮细胞TNF-α、JAM-1蛋白表达 人血管内皮细胞分别经0、15、30、60、120 mg/L的APOC3作用16 h后，收集细胞，加入细胞裂解液，放置于冰上裂解30 min。4 ℃下12 000 r/min离心15 min，取蛋白上清至新EP管中，用BCA蛋白浓度检测试剂盒检测提取的蛋白浓度。蛋白样品与Loading buffer煮沸变性后，加入到SDS-PAGE凝胶孔中，每孔中加入变性蛋白样品50 μL，以初始电压为80 V电泳30 min后，调整电压为120 V至电泳结束。取出蛋白凝胶在4 ℃下转印至PVDF膜上。经50 g/L脱脂奶粉封闭后，依次与一抗（1∶500）、二抗（1∶1 000）反应后，转移至暗室中滴加显色液，曝光后以GAPDH为内参，分析蛋白表达率。实验重复3次，每次3个复孔。
　　1.3.5 TNF-α对人血管内皮细胞JAM-1 mRNA和蛋白表达影响 取培养至对数生长期的人血管内皮细胞，弃细胞培养液，用胰蛋白酶消化后，接种到12孔细胞培养板中，置37 ℃、体积分数0.05 CO2培养箱中培养24 h后，将细胞培养液换成含有终浓度为0、1.0 mg/L的TNF-α细胞培养液，培养16 h后收集细胞。采用qRT-PCR、Western blot检测细胞中JAM-1 mRNA和蛋白表达水平。步骤同1.3.3和1.3.4。实验重复3次，每次3个复孔。 　　1.4 统计学处理
　　采用SPSS 22.0统计学软件进行分析，计量资料数据以±s表示，两组均数比较用t检验，多组比较采用单因素设计方差分析。以P<0.05為差异有显著性。
　　2 结果
　　2.1 病人血清中APOC3含量检测
　　结果表明，56例冠状动脉有狭窄病人血清APOC3为（9.36±0.95）g/L，明显高于24例无狭窄病人的（7.42±0.74）g/L，差异有显著性（t=2.790， P<0.01）。
　　2.2 APOC3对血管内皮细胞JAM-1 mRNA和蛋白表达影响
　　采用15、30、60、120 mg/L的APOC3作用后，血管内皮细胞中JAM-1 mRNA和蛋白水平均高于0 mg/L者;血管内皮细胞中JAM-1 mRNA和蛋白水平随着15、30、60 mg/L 的APOC3作用浓度的增加而增加（F=69.633、178.421，t=9.137～17.473，P<0.01）。而120 mg/L的APOC3作用后，细胞中JAM-1 mRNA和蛋白水平较60 mg/L者有所下降。见表2。
　　2.3 APOC3对血管内皮细胞TNF-α mRNA和蛋白表达影响
　　采用15、30、60、120 mg/L的APOC3作用16 h后，血管内皮细胞中 TNF-α mRNA和蛋白均明显高于0 mg/L者（F=28.746、50.426，P<0.01）。TNF-α mRNA和蛋白水平没有随着APOC3作用浓度的升高而增加。见表2。
　　2.4 TNF-α对血管内皮细胞中JAM-1 mRNA和蛋白表达影响
　　采用1.0 μg/L的TNF-α作用后，血管内皮细胞中JAM-1 mRNA和蛋白水平均明显高于0 μg/L者，差异有显著性（t=8.167、15.589，P<0.01）。见表3。
　　
　　3 讨论
　　动脉粥样硬化是一种常见的动脉硬化血管疾病。动脉粥样硬化形成与复合糖类和脂质的聚集、血栓的形成、纤维组织增生的出现、动脉中层的钙化等有关。当病变逐渐累积到阻塞动脉腔时，由该动脉供应的组织器官出现缺血甚至坏死[9]。动脉粥样硬化血管弹性减弱，管壁上出现类似于米粒样的脂类[10-11]。另外，动脉粥样硬化会导致动脉腔变窄，进而引发高血压心脏病的发生。
　　载脂蛋白是指血浆脂蛋白中的蛋白成分，可以分为A、B、C、D、E等5类[11]。载脂蛋白是脂类物质的运输载体，其中部分载脂蛋白还具有脂蛋白代谢酶激活、受体的识别等作用[12]。载脂蛋白C具有水溶性，能够调控肝脂酶和脂蛋白脂酶的活性[13]。APOC3基因全长为3.1 kb，位于第11号染色体上[14]。临床研究结果表明，APOC3能够引起冠心病的发生，与高血压、高脂血症、肥胖等均有密切关系[15]。过表达APOC3小鼠的高三酰甘油血症明显加重，经过饲喂高脂饲料后，小鼠出现脂肪肝变性和明显的胰岛素抵抗[16]。已有研究结果显示，冠状动脉狭窄病人血清总APOC3浓度明显升高[17]。本文研究结果也显示，APOC3在冠状动脉狭窄病人血清中的表达明显增高。
　　免疫炎症是目前研究较多的动脉粥样硬化的发病机制。脂质的积累和炎症的共同长期作用导致动脉粥样硬化的发生[18]。APOC3、TNF-α、JAM-1等均与动脉粥样硬化的发生有关[19]。有研究结果表明，JAM-1在动脉粥样硬化斑块组织中的表达增高[20]。TNF-α是一种具有多重作用的细胞因子，具有调节血管内皮功能的作用，与动脉粥样硬化的形
　　成密切相关[21]。本研究用不同浓度的APOC3作用血管内皮细胞，观察TNF-α、JAM-1 mRNA和蛋白表达的变化。本文结果表明，TNF-α、JAM-1 mRNA和蛋白表达均上调。其中JAM-1 mRNA和蛋白表达水平在一定浓度范围内呈现浓度依赖，而TNF-α mRNA和蛋白表达水平并没有出现浓度依赖。采用TNF-α作用后，血管内皮细胞中JAM-1 mRNA和蛋白表达升高，提示APOC3可能通过诱导TNF-α表达进而促进血管内皮细胞中JAM-1的表达。
　　综上所述，APOC3在动脉粥样硬化病人血清中表达上调。APOC3可能通过诱导TNF-α表达进而促进血管内皮细胞中JAM-1的表达，APOC3可能是炎症、细胞黏附的连接分子，有望成为预防和治疗动脉粥样硬化的靶点。本研究为进一步探讨动脉粥样硬化的发病机制奠定了基础，为治疗动脉粥样硬化提供了新思路。由于动脉粥样硬化发病机制极其复杂，对APOC3在动脉粥样硬化中的具体作用机制，有待于进一步研究。
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　　（本文编辑 于国艺）
　　
　　[收稿日期]2019-08-20; [修订日期]2020-05-09
　　[基金项目]河南省医学科技攻关计划项目（2018020440）
　　[第一作者]史帅涛（1975-），男，硕士，主治医师。
　　[通信作者]翟水亭（1964-），男，主任医师。E-mail：zhaishui-ting2007@163.com。