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摘要： 本研究以稻草粉为主要原料，通过单因素实验和正交实验，对黄孢原毛平革菌和金顶侧耳混合发酵产纤维素酶条件进行优化。结果表明，最适产酶的发酵培养基：稻草粉+可溶性淀粉25克/升，豆粕5克/升，KH2 PO4 3.0 克/升，VB11.0 毫克/升，MgSO4 · 7H2O 1.5 克/升，FeSO4· 7H2O 0.2 克/升，MnSO4 · H2O 0.2 克/升，CuSO4 ·5H2O 0.015克/升，CaCl2 0.4 克/升， pH值5.0；接菌比例为3∶2，转速 150 转/分钟，发酵到第6 天左右时的粗酶液酶活力最高，达到 0.86 U/mL，为今后秸秆资源的充分利用及纤维素酶的大规模生产提供依据。
关键词：黄孢原毛平革菌；金顶侧耳；混合发酵；纤维酶；优化
项目基金：吉林农业科技学院微生物重点学科项目资助（吉农院合字〔2013〕第x007号）
中图分类号： Q93 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/j.cnki.jlny.2015.21.028
纤维素作为植物光合作用的主要多糖类产物， 是地球上最丰富、 最廉价的可再生资源， 约占农作物秸秆的 30%～50%[1] 。然而，约80%的秸秆资源未被开发利用，综合加工利用潜力极大。
纤维素酶是降解纤维素最有效的生物催化剂，其活性直接影响纤维素的利用效率[2-3]。目前单一菌种生产的纤维素酶存在组分不全和酶活性低、对纤维素分解能力弱、发酵周期长等缺点，严重制约了其工业化应用[4-6]。而混合发酵可以充分发挥各酶之间的协同作用，进而使纤维素酶的活性达到较高水平[7]。白腐真菌具有较强的木质素降解能力而备受重视[8-10]。
本研究以廉价的稻草粉为主要发酵原料，考察黄孢原毛平革菌和金顶侧耳混合发酵产纤维素酶的影响因素，进一步对固态发酵产酶条件进行优化，以期获得高活力的纤维素酶，降低纤维素酶的生产成本，为纤维素酶的工业化生产奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料与试剂
菌株。黄孢原毛平革菌由吉林农业科技学院生物专业实验室分离鉴定并保存；金顶侧耳菌株由吉林农业科技学院食用菌研究所保存。
材料。稻草取自于学校周边农田，粉碎过20目筛， 灭菌锅高温处理1小时，烘干保存备用。
试剂。葡萄糖、MgSO4 · 7H2O、FeSO4· 7H2O、KH2 PO4等购自北京化工试剂，均为分析纯；牛肉膏、酵母浸粉、蛋白胨均购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。
培养基。PDA 培养基：取洗净去皮马铃薯200克，切碎，加适量水煮沸20分钟，纱布过滤后，加葡萄糖20克和琼脂17克，加水补足至1000毫升，高压灭菌备用。
种子培养液：酵母浸粉10克/升，葡萄糖20克/升， 蛋白胨20克/升， 121℃灭菌 20分钟备用。
基础发酵产酶培养液。 葡萄糖20克/升，蛋白胨5克/升，KH2 PO4 3.0 克/升，VB11.0 克/升，MgSO4 · 7H2O 1.5 克/升，FeSO4· 7H2O 0.2 克/升，MnSO4 · H2O 0.2 克/升，CuSO4 ·5H2O 0.015克/升，CaCl2 0.4 克/升，自来水1000毫升备用。
1.2 方法
1.2.1 种子培养液的制备 将在PDA平板上黄孢原毛平革菌和金顶侧耳菌株培养1周左右，选取菌丝长势旺盛的平板，使用灭菌打孔器取菌苔前端菌块，接种于液体种子培养基，28℃，150转/分钟振荡培养 3～5天，长出可见的白色菌丝球，即可作为种子液使用。
1.2.2 混合发酵培养产酶 取黄孢原毛平革菌和金顶侧耳种子液共 10亳升（设置不同接种比例），接种于装载有 100亳升的发酵培养基的 500亳升的三角瓶中，150转/分钟 恒温振荡培养。考察发酵时间、接种比例、温度、pH、碳源、氮源等对混合发酵产纤维素酶的影响，进一步采用正交试验对黄孢原毛平革菌与金顶侧耳混合发酵产纤维素酶条件进行优化。
1.2.3 粗酶液的制备 发酵液经 5000 转/分钟 离心 10分钟， 取上清液即为粗酶液测定酶活力。
1.2.4 CMC酶活测定 取1亳升的酶液加入到 2毫升 CMC- Na溶液中，50℃水浴保温反应 30分钟，采用DNS法测定还原糖含量。
2 结果与分析
2.1 发酵时间对产酶的影响
为分析培养时间对纤维素酶活的影响，将黄孢原毛平革菌和金顶侧耳菌混合培养2～10天，每隔2天，取1毫升发酵液测定酶活力。结果见图1所示，混合发酵最适的混合发酵时间为 6天。
图1 发酵时间对产酶的影响
2.2 接种比例对产酶的影响
设定种子液接种比例分别为 1∶4、2∶3、1∶1、3∶2、4∶1，分别接种于发酵培养基中，于30℃培养，摇床发酵6天，测酶活。由图2可知，菌种接种比例为3∶2时，所得纤维素酶活最高。
图2 接种比例对产酶的影响
2.3 初始pH值对混合发酵产酶的影响
用醋酸缓冲液，将基础液体培养基的初始pH值分别调为3.0，4.0，5.0，6.0和7.0，培养6天 ，测定酶活性。由图3可知，该菌种在较广泛的 pH 条件下均可产漆酶，特别是在偏酸性条件下纤维素酶活较高。最有利的产酶 pH 在 5.0 左右。
图3 pH值对产酶的影响
2.4 碳源对混合发酵产酶的影响
本研究以稻草粉为主要碳源，考虑到菌株的转化问题。在基础产酶培养基碳源总浓度为20克/升的情况下，分别以稻草粉、稻草粉与蔗糖、稻草粉与葡萄糖，稻草粉与可溶性淀粉，稻草粉与玉米秸秆粉作为碳源，振荡培养6天后，测酶活，确定最佳碳源。 图4 碳源对产酶的影响
由图4可知，在碳源中添加适当比例的葡萄糖和可溶性淀粉，更有利菌丝的生长，因此产酶活性也较高。从产酶效果及成本角度考虑，可采用稻草粉+可溶性淀粉作为培养基的碳源。
2.5 氮源对混合发酵产酶的影响
在基础产酶培养基中分别加入浓度为5克/升的氨基乙酸、（NH4）2·SO4、蛋白胨、酒石酸铵和豆粕作为氮源，培养6天后，测酶活。由图5可知，以酒石酸铵和豆粕作为发酵培养基的氮源时，都具有较好的产酶活性，从价格、来源、产酶效果考虑，豆粕比酒石酸铵更适合于作为发酵培养基的氮源。
图5 氮源对产酶的影响
2.6 最佳产酶条件的确定
在单因素实验的基础上，选取菌种接种比例、碳源浓度、氮源浓度及pH值进行4因素3水平正交设计实验，以CMC酶活为考察指标，优化产酶条件，正交设计见表1，正交实验及结果见表2。
通过正交实验分析可得如下结论， 碳源对纤维素酶活力影响最大，其次分别为氮源和接种比例，培养基的pH值对酶活的影响最小。优化后的最佳组合为A2B3C1D2，即适合稻草粉25克/升，豆粕4克/升，pH 5.0，接菌比例为3∶2。
3 结论
本研究采用单因素实验结合多因素正交实验研究黄孢原毛平革菌和金顶侧耳的产纤维素酶发酵条件，得出该菌种最适产酶条件为：培养基配方：稻草粉+可溶性淀粉25克/升，豆粕5克/升，KH2 PO4 3.0克/升，VB11.0 毫克/升，MgSO4·7H2O 1.5克/升，FeSO4·7H2O 0.2克/升，MnSO4·H2O 0.2克/升，CuSO4·5H2O 0.015克/升，CaCl2 0.4克/升， pH 值 5.0，接菌比例为3∶2，转速 150 转/分钟，发酵到第6天左右时的粗酶液酶活力最高，达到 0.86 U/mL。本研究以废弃农作物为原料进行混合发酵产纤维素酶条件的探索，可降低纤维素酶的生产成本，同时为纤维素酶混合发酵的工业化生产奠定基础。
参考文献
[1] 王顺鹏.菇渣中纤维素酶及其在沼气发酵中的作用[J]. 南京农业大学学报， 1991，14（02）：65-68.
[2] SUKUMA RANRK， SINGHANIA RR， MATHEW
GM， et al. Cellulase production using biomass feed stock and its application in lignocellulose saccharification for bio-ethanol production[J].Renewable Energy， 2009， 34（02）： 421-424.
[3] WEN ZY， LIAO W， CHEN SL. Production of cellu
lase/beta- glucosidase by mixed fungi culture Trichoderma reesei and Aspergillus phoenicis on dairy manure[J]. Process Biochemistry， 2005， 40（09）： 3087-3094.
[4] 刘凯， 林建强， 曲音波. 纤维素酶生产技术[J].生物产业技术，2008（04）： 54-60.
[5] 谢天文， 刘晓风， 袁月祥， 等. 真菌产纤维素酶的诱导物及其调控机理研究进展[J]. 应用与环境生物学报，2010，16（02）：440-444.
[6] 陈娜，顾金刚，徐凤花，等.产纤维素酶真菌混合发酵研究进展[J]. 中国土壤与肥料，2007（04）：16-21.
[7] 涂璇， 薛泉宏， 司美茹， 龚明福. 多元混菌发酵对纤维素酶活性的影响[J].工业微生物，2004（34）：30-34.
[8] 林刚，文湘华，钱易. 应用白腐真菌技术处理难降解有机物的研究进展[J].环境污染治理技术与设备，2001， 2（04）：1-8.
[9] 关艳丽，李莉，陈飞，等.1株产漆酶白腐真菌的筛选和鉴定[J]. 微生物学，2010（03）： 74-77.
[10] 费尚芬， 鹿宁， 刘坤， 等. 白腐菌纤维素酶高酶活菌株的筛选[J]. 安徽农业科学，2006，34（01）： 22- 23.
作者简介：刘晓丹，吉林农业科技学院生物工程学院，讲师， 研究方向：基因工程与酶工程教学与研究。
关键词：黄孢原毛平革菌；金顶侧耳；混合发酵；纤维酶；优化
项目基金：吉林农业科技学院微生物重点学科项目资助（吉农院合字〔2013〕第x007号）
中图分类号： Q93 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/j.cnki.jlny.2015.21.028
纤维素作为植物光合作用的主要多糖类产物， 是地球上最丰富、 最廉价的可再生资源， 约占农作物秸秆的 30%～50%[1] 。然而，约80%的秸秆资源未被开发利用，综合加工利用潜力极大。
纤维素酶是降解纤维素最有效的生物催化剂，其活性直接影响纤维素的利用效率[2-3]。目前单一菌种生产的纤维素酶存在组分不全和酶活性低、对纤维素分解能力弱、发酵周期长等缺点，严重制约了其工业化应用[4-6]。而混合发酵可以充分发挥各酶之间的协同作用，进而使纤维素酶的活性达到较高水平[7]。白腐真菌具有较强的木质素降解能力而备受重视[8-10]。
本研究以廉价的稻草粉为主要发酵原料，考察黄孢原毛平革菌和金顶侧耳混合发酵产纤维素酶的影响因素，进一步对固态发酵产酶条件进行优化，以期获得高活力的纤维素酶，降低纤维素酶的生产成本，为纤维素酶的工业化生产奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料与试剂
菌株。黄孢原毛平革菌由吉林农业科技学院生物专业实验室分离鉴定并保存；金顶侧耳菌株由吉林农业科技学院食用菌研究所保存。
材料。稻草取自于学校周边农田，粉碎过20目筛， 灭菌锅高温处理1小时，烘干保存备用。
试剂。葡萄糖、MgSO4 · 7H2O、FeSO4· 7H2O、KH2 PO4等购自北京化工试剂，均为分析纯；牛肉膏、酵母浸粉、蛋白胨均购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。
培养基。PDA 培养基：取洗净去皮马铃薯200克，切碎，加适量水煮沸20分钟，纱布过滤后，加葡萄糖20克和琼脂17克，加水补足至1000毫升，高压灭菌备用。
种子培养液：酵母浸粉10克/升，葡萄糖20克/升， 蛋白胨20克/升， 121℃灭菌 20分钟备用。
基础发酵产酶培养液。 葡萄糖20克/升，蛋白胨5克/升，KH2 PO4 3.0 克/升，VB11.0 克/升，MgSO4 · 7H2O 1.5 克/升，FeSO4· 7H2O 0.2 克/升，MnSO4 · H2O 0.2 克/升，CuSO4 ·5H2O 0.015克/升，CaCl2 0.4 克/升，自来水1000毫升备用。
1.2 方法
1.2.1 种子培养液的制备 将在PDA平板上黄孢原毛平革菌和金顶侧耳菌株培养1周左右，选取菌丝长势旺盛的平板，使用灭菌打孔器取菌苔前端菌块，接种于液体种子培养基，28℃，150转/分钟振荡培养 3～5天，长出可见的白色菌丝球，即可作为种子液使用。
1.2.2 混合发酵培养产酶 取黄孢原毛平革菌和金顶侧耳种子液共 10亳升（设置不同接种比例），接种于装载有 100亳升的发酵培养基的 500亳升的三角瓶中，150转/分钟 恒温振荡培养。考察发酵时间、接种比例、温度、pH、碳源、氮源等对混合发酵产纤维素酶的影响，进一步采用正交试验对黄孢原毛平革菌与金顶侧耳混合发酵产纤维素酶条件进行优化。
1.2.3 粗酶液的制备 发酵液经 5000 转/分钟 离心 10分钟， 取上清液即为粗酶液测定酶活力。
1.2.4 CMC酶活测定 取1亳升的酶液加入到 2毫升 CMC- Na溶液中，50℃水浴保温反应 30分钟，采用DNS法测定还原糖含量。
2 结果与分析
2.1 发酵时间对产酶的影响
为分析培养时间对纤维素酶活的影响，将黄孢原毛平革菌和金顶侧耳菌混合培养2～10天，每隔2天，取1毫升发酵液测定酶活力。结果见图1所示，混合发酵最适的混合发酵时间为 6天。
图1 发酵时间对产酶的影响
2.2 接种比例对产酶的影响
设定种子液接种比例分别为 1∶4、2∶3、1∶1、3∶2、4∶1，分别接种于发酵培养基中，于30℃培养，摇床发酵6天，测酶活。由图2可知，菌种接种比例为3∶2时，所得纤维素酶活最高。
图2 接种比例对产酶的影响
2.3 初始pH值对混合发酵产酶的影响
用醋酸缓冲液，将基础液体培养基的初始pH值分别调为3.0，4.0，5.0，6.0和7.0，培养6天 ，测定酶活性。由图3可知，该菌种在较广泛的 pH 条件下均可产漆酶，特别是在偏酸性条件下纤维素酶活较高。最有利的产酶 pH 在 5.0 左右。
图3 pH值对产酶的影响
2.4 碳源对混合发酵产酶的影响
本研究以稻草粉为主要碳源，考虑到菌株的转化问题。在基础产酶培养基碳源总浓度为20克/升的情况下，分别以稻草粉、稻草粉与蔗糖、稻草粉与葡萄糖，稻草粉与可溶性淀粉，稻草粉与玉米秸秆粉作为碳源，振荡培养6天后，测酶活，确定最佳碳源。 图4 碳源对产酶的影响
由图4可知，在碳源中添加适当比例的葡萄糖和可溶性淀粉，更有利菌丝的生长，因此产酶活性也较高。从产酶效果及成本角度考虑，可采用稻草粉+可溶性淀粉作为培养基的碳源。
2.5 氮源对混合发酵产酶的影响
在基础产酶培养基中分别加入浓度为5克/升的氨基乙酸、（NH4）2·SO4、蛋白胨、酒石酸铵和豆粕作为氮源，培养6天后，测酶活。由图5可知，以酒石酸铵和豆粕作为发酵培养基的氮源时，都具有较好的产酶活性，从价格、来源、产酶效果考虑，豆粕比酒石酸铵更适合于作为发酵培养基的氮源。
图5 氮源对产酶的影响
2.6 最佳产酶条件的确定
在单因素实验的基础上，选取菌种接种比例、碳源浓度、氮源浓度及pH值进行4因素3水平正交设计实验，以CMC酶活为考察指标，优化产酶条件，正交设计见表1，正交实验及结果见表2。
通过正交实验分析可得如下结论， 碳源对纤维素酶活力影响最大，其次分别为氮源和接种比例，培养基的pH值对酶活的影响最小。优化后的最佳组合为A2B3C1D2，即适合稻草粉25克/升，豆粕4克/升，pH 5.0，接菌比例为3∶2。
3 结论
本研究采用单因素实验结合多因素正交实验研究黄孢原毛平革菌和金顶侧耳的产纤维素酶发酵条件，得出该菌种最适产酶条件为：培养基配方：稻草粉+可溶性淀粉25克/升，豆粕5克/升，KH2 PO4 3.0克/升，VB11.0 毫克/升，MgSO4·7H2O 1.5克/升，FeSO4·7H2O 0.2克/升，MnSO4·H2O 0.2克/升，CuSO4·5H2O 0.015克/升，CaCl2 0.4克/升， pH 值 5.0，接菌比例为3∶2，转速 150 转/分钟，发酵到第6天左右时的粗酶液酶活力最高，达到 0.86 U/mL。本研究以废弃农作物为原料进行混合发酵产纤维素酶条件的探索，可降低纤维素酶的生产成本，同时为纤维素酶混合发酵的工业化生产奠定基础。
参考文献
[1] 王顺鹏.菇渣中纤维素酶及其在沼气发酵中的作用[J]. 南京农业大学学报， 1991，14（02）：65-68.
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[7] 涂璇， 薛泉宏， 司美茹， 龚明福. 多元混菌发酵对纤维素酶活性的影响[J].工业微生物，2004（34）：30-34.
[8] 林刚，文湘华，钱易. 应用白腐真菌技术处理难降解有机物的研究进展[J].环境污染治理技术与设备，2001， 2（04）：1-8.
[9] 关艳丽，李莉，陈飞，等.1株产漆酶白腐真菌的筛选和鉴定[J]. 微生物学，2010（03）： 74-77.
[10] 费尚芬， 鹿宁， 刘坤， 等. 白腐菌纤维素酶高酶活菌株的筛选[J]. 安徽农业科学，2006，34（01）： 22- 23.
作者简介：刘晓丹，吉林农业科技学院生物工程学院，讲师， 研究方向：基因工程与酶工程教学与研究。