【摘 要】
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目的 构建严重急性呼吸道综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus-2,SARS-CoV-2)全长cDNA,为SARS-CoV-2基因功能、药物筛选和安全减毒灭活疫苗株的研究提供重要工具,也为大基因组RNA病毒cDNA的构建提供新的方法.方法 结合In-Fusion、Gibson Assembly以及Recombineering技术对SARS-CoV-2基因组进行全长cDNA克隆的从头合成.首先将SARS-CoV-2全长基因组分17个片段进
【机 构】
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武汉生物制品研究所有限责任公司,湖北武汉430207;国家联合疫苗工程技术研究中心,湖北武汉430207;湖北省疫苗技术创新中心,湖北武汉430207;武汉生物制品研究所有限责任公司,湖北武汉4302
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目的 构建严重急性呼吸道综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus-2,SARS-CoV-2)全长cDNA,为SARS-CoV-2基因功能、药物筛选和安全减毒灭活疫苗株的研究提供重要工具,也为大基因组RNA病毒cDNA的构建提供新的方法.方法 结合In-Fusion、Gibson Assembly以及Recombineering技术对SARS-CoV-2基因组进行全长cDNA克隆的从头合成.首先将SARS-CoV-2全长基因组分17个片段进行扩增,利用In-Fusion试剂盒将这些小片段连接、克隆,以获得插入序列约5000bp的6个pUC19重组质粒;然后利用Gibson Assembly试剂盒将30000 bp SARS-CoV-2全长基因组分3次逐步连接至pBR322载体,每次连接10000 bp,得到含30000 bp SARS-CoV-2全长cDNA的重组质粒;最后利用Recombineering技术修复逐步连接过程中通过Not I位点引入的两处多余GC碱基.结果 构建了SARS-CoV-2 WIV04株的全长cDNA,插入基因组的重组质粒经酶切和测序鉴定正确.为区别于野生型毒株SARS-CoV-2 WIV04,分别在全长cDNA的8791 nt和12655 nt进行了同义突变,引入了两处BglI酶切位点,以此作为遗传标记.结论 成功构建了SARS-CoV-2全长cDNA,为SARS-CoV-2基础研究和应用研究提供了技术平台.
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