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摘要：目的：观察人参提取物Rb1成分对增生性瘢痕的作用。方法：选取十分成熟的兔耳增生性瘢痕模型，每只耳朵做3处增生性瘢痕，每个瘢痕做不同处理：空白对照组（a），生理盐水注射组（b），人参提取物组（c ）。测定Masson染色，胶原含量，免疫组织化学上相关胶原Ⅰ型蛋白表达。结果：人参Rb1组瘢痕增生程度轻、胶原含量下降、Ⅰ型胶原蛋白表达低。结论：Rb1可以抑制增生性瘢痕的发展。
关键词： 人参提取物；瘢痕；动物瘢痕模型
Abstract： Objective To study the effect of ginseng extract Rb1 component on hypertrophic scars， providing a new method for the treatment of hypertrophic scars. Methods Select a very mature hypertrophic scar model rabbit ears， do three in each ear hypertrophic scars， scars do each different treatment： control group （a）， saline injection group （b）， ginseng extract （c）. To subject the Masson staining， collagen determination and chemical related expression of immunohistochemistry protein collagen type 1 in each group. Results The Masson staining， collagen determination and chemical related expression of immunohistochemistry protein collagen type 1 in Rb1 group were lower than the other groups. Conclusion The Rb1 can inhibit the development of hypertrophic scars.
Keywords：ginseng extract； scar； animal scar model
瘢痕的治疗作为一种世界性的难题一直以来就缠绕着每一个研究者和患者。难以确定的发病原因和多种影响因素正是纠缠不休的源头。
增强的炎症反应，细胞外基质过度沉寂，血管化反应局部增强，细胞凋亡的变化等都是可能造成增生性瘢痕的原因。其中，胶原是细胞外基质的主要成分，p53、bcl-2等基因影响细胞凋亡。
而中医在病理性瘢痕的治疗上一直都有卓越的贡献，如红花、黑布膏药等[1]。神秘的祖国医学在处理此类难题上具有独特的优势，关于人参提取物在增生性瘢痕的研究上报道不多，此次选取Rb1成分探讨其对增生性瘢痕的治疗是否有效。
1材料和方法
1.1 实验动物、主要仪器与试剂
普通大耳白兔9只，雌雄不限，体重2.6-3.5 kg，单笼饲养。
人参皂苷Rb1纯品（纯度≥98%）——天津灏洋生物科技有限公司提供，配制成浓度为1.0mg/mL。
胶原I型蛋白（bs-0578R）、Masson染色试剂盒--购自北京中衫金桥生物技术有限公司。
光学显微镜，图像分析软件Motic等由河北联合大学基础实验室提供。
1.2 试验方法
1.2.1 增生性瘢痕动物模型的建立
实验兔子适应性喂养7d后，根据李荟元[2]等建立的增生性瘢痕动物模型法，严格无菌操作下，用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉3.0mL/kg。分别于兔耳腹侧面中段的内、外、中部用直径约为1.0 cm的打孔器各形成一个圆形标记，每只耳朵3处，建立兔耳增生性瘢痕模型。术中严格无菌操作切除圆形标记范围内除包括软骨膜在内的全层皮肤至软骨膜表面，保留软骨，压迫止血，不予包扎。术后7d严格无菌操作下去除创面新生的肉芽组织和血痂，不包扎，任其愈合。
1.2.2 实验分组、标本取材固定
每只兔子耳3处创面分别为空白对照组（a）：术后不进行任何处理；生理盐水对照组（b）：上皮化后（即26d后）在兔耳创面周围皮下注射生理盐水；治疗组上皮化（约26d）后兔耳创面周围皮下注射不同浓度的人参皂苷Rb1（c）。即每个瘢痕做不同处理。每处创面注射剂量约为0.3 ml，每3d一次，共三次。大体观察创面愈合和增生性瘢痕情况。
分别于术后第2、4、6周切去瘢痕组织标本每次取3只兔子，置于多聚甲醛固定液中，石蜡包埋，沿组织横切面进行切片。行Masson染色，免疫组织化学胶原Ⅰ型蛋白表达检测。
1.3 结果检测
1.3.1 观察
观察创面愈合情况；术后26d，肉眼观察各组增生性瘢痕的硬度，色泽，形态。
镜下观察（Masson染色）
采集标本须包括瘢痕组织周边部分正常皮肤，4 %多聚甲醛固定24-72 h，乙醇脱水，石蜡包埋，沿瘢痕凸起最高点纵行切片。
Masson染色：胶原纤维、粘液、软骨呈蓝色；胞浆、肌肉、纤维素、神经胶质呈红色；胞核蓝紫色。
胶原含量测定：Masson染色，×200倍光镜下，每个切片随机选取3个视野，利用图像分析系统计算胶原含量、密度，结果取均数。
1.3.2 免疫组化（collagen I蛋白的表达）
collagen I：应用常规二步免疫组化法严格按试剂和说明书操作，以PBS代替一抗为阴性对照，有棕黄色颗粒者为阳性细胞，在200倍光镜观察下随机取3个视野进行计数，结果取均数。 阳性细胞反应率=阳性细胞数/细胞总数×100%。
1.4 统计学处理
用SPSS 13.0 进行数据处理，计量资料以“均数（x ）标准差（s）”的表现形式，检查数据的方差齐性，如若不齐还需添加纠正检验，之后再进行配对t检验，方差分析等。选α=0.05，当 P≤0.05为差异有统计学意义，P？0.05则认为差异无统计学意义。
2结果
2.1观察
各组创面均愈合良好，未见感染不愈，各组愈合时间约为26d，外观粗略观察各组间无显著差别。瘢痕增生隆起突出于周围正常皮肤表面，但未超出创伤范围，可见a， b组形成的增生性瘢痕最显著，瘢痕呈圆形，范围未能超出造模时打孔器的标记范围，中央呈“小丘样”或“乳头样”凸起，质硬；c组与前两组比较，瘢痕增生程度较轻，表面较平坦，质略软，色浅。
1.造模术后第一天 2.达到完全上皮化时，造模成功 3.用药后第6w
2.2组织学变化
Masson染色：胶原纤维、粘液、软骨呈蓝色；胞浆、肌肉、纤维素、神经胶质呈红色；胞核蓝紫色。表皮细胞层数少，细胞排列整齐，胶原排列整齐几乎成平行状态，间隙分明，条理性明显，细胞成分少，少见血管组织。a、b组表皮细胞层数明显增多，细胞排列杂乱，体积变大，胶原增生明显，胶原纤维排列杂乱扭曲难以看到整体形态，间隙不明显，常见胶原结节出现和漩涡状结构，细胞成分明显增多，细胞体积变大，血管组织数量较正常组增多。c组胶原排列整齐、数量减少，观察到的细胞成分减少，并且可见到趋于水平排列的多层胶原纤维束，新生血管和胶原结节的数量也相应减少。
1.正常组织×200 a.空白对照a组 ×400 b.生理盐水b组 ×400 c.药物干预c组×400
胶原纤维密度，含量测定，结果见表一：a，b组之间胶原纤维密度无显著性差异（p>0.05），c组的胶原密度相比a、b组下降，有统计学意义 （P<0.05）。
2.3免疫组织化学结果见表一：
Ⅰ型胶原蛋白的阳性表现见棕黄色颗粒，略粗，密度高，排列不规则，可呈旋涡状（如图四）。a，b组的差异无统计学意义（P>0.05），c组collagen I的阳性表达相比a，b组降低，有统计学意义 （P<0.05）
3讨论
病理性瘢痕分为增生性瘢痕、瘢痕疙瘩，其形成是由于创伤愈合过程成纤维细胞合成胶原能力增强，导致以胶原为主要成分的细胞外基质（ECM）增多和过度沉积。增生性瘢痕（HS）是皮肤真皮损伤愈合后遗留的高出周围正常皮肤、发红、坚硬的病理结构，瘙痒、疼痛等症状，既影响外貌和功能，也会对患者心理造成不同程度的障碍。
常见的治疗方法有：药物、压迫、放射、激光[3]及手术治疗等。然而至今还没有发现非常令人满意的特别有效的防治策略。
中药治疗瘢痕有悠久的历史，认为瘢痕形成主要由气血壅滞、经络痹阻、痰湿搏结所致， 或相辅相成。有内治法、外治法和内外兼治。人参皂苷单体抗细胞纤维化，促血管生成与抑制TGF-β1的刺激胶原增生的作用均提示人参皂苷有效成分具有促进伤口愈合预防增生性瘢痕的产生的作用。人参皂甙Rb1有强大的促进创面愈合能力[4]，以及抑制ECM分泌的作用[5]。刘鹤松[6]等认为人参皂苷Rg3能够抑制病理性瘢痕的增生。而对人参皂甙Rb1的研究主要在神经和心血管方面[7，8]，而在瘢痕的研究仍少见。但李俊飞[9]认为Rb1能增加正常人成纤维细胞的增殖水平，所以对Rb1对增生性瘢痕的治疗效果还要从用药时机、浓度和方式等多方面进行深入探讨。
瘢痕组织中基质成分包括胶原纤维、结构性蛋白及蛋白多糖等，其中胶原纤维是瘢痕组织的主要成分，其中又以Ⅰ型胶原纤维居多。胶原的合成与降解是一个复杂的动态过程，在这个过程中，多种生物活性酶如氧化酶、蛋白酶、胶原酶和金属蛋白酶等参与其中[10]。正常情况下，胶原合成与分解呈动态平衡。当这种平衡被打破，导致成纤维、肌纤维母细胞合成胶原增多，分解减少，合成速度远大于胶原分解，最终导致了胶原沉积，从而形成瘢痕组织。成纤维细胞是产生胶原的主要细胞，所以抑制成纤维细胞的增殖和调节胶原蛋白的合成可能是治疗增生瘢痕的有效途径。
增生性瘢痕组织的主要成分是Ⅰ型胶原，如实验结果显示，a、b组的表达最高无差异，c组的阳性表达与前者相比有所下降。
本研究通过对瘢痕用药干预，通过外观形态，组织切片染色，免疫组化方法研究胶原量的变化趋势，认为人参皂苷对增生性瘢痕的治疗有效。中药应用于增生性瘢痕期待有更升入全面的探索。
参考文献：
[1] 刘燕，傅跃先，邱林，等.红花注射治疗对兔耳增生性瘢痕中.TGFβ1的表达变化[J].重庆医学，2011，40（13）：1294-1296.
[2] 李荟元，刘建波，夏炜等.建立增生性瘢痕动物实验模型的建立与应用[J].第四军医大学学报，1998，19（6）：655-657.
[3] De Carvalho Pde T， da Silva IS， Reis FA， et al. Influence of ingaalp laser （660 nm） on the healing of skin wounds in diabetic rats[J]. Acta Cir Bras，2010，25（1）：71-79.
[4]Kimura Y， Sumiyoshi M， Kawahira K， Sakanaka M. Effects of ginseng saponins isolated from Red Ginseng roots on burn wound healing in tmice[J].Br J Pharmacol. 2006 Jul；148（6）：860-70. Epub 2006 Jun 12.
[5] 谢席胜，刘衡川，樊均明，等。人参皂苷Rb1对转化生长因子诱导的肾小管上皮细胞p47phox的表达及细胞外基质的影响[J].四川大学学报：医学版， 2009，40（1）：106-110.
[6] 刘鹤松，赵自然，兰珊珊），等。人参皂苷Rg3对人成纤维细胞增殖和凋亡影响的实验研究[J].中国实验诊断学，2010，14（11）：1697-1700.
[7] 孔宏亮，李占全，袁龙. 一氧化氮合酶/一氧化氮介导人参皂苷Rb1对心肌细胞肥大的抑制效应[J].广东医学，2012，33（2）：167-169.
[8]李玉倩，王芳，陈建国。人参皂苷Rb1抗抑郁作用的动物行为学研究[J].河南医学研究，2011，20（3）：257-263.
[9]李俊飞，周大兴，洪先业，等. 人参皂苷Rb1，Rb1及Re对人皮肤胶原代谢作用的研究[J].同济大学学报：医学版，2011，32（3）：28-32.
[10]Peters T，Sindrilaru A，Huber R，et al.Overexpression of manganese superoxide dismutase in human dermal fibroblasts enhances the contraction of free floating collagen lattice：implications for ageing and hyperplastic scar formation [J].Archives of Dermatological Research，2009，30（4）：273-287.
关键词： 人参提取物；瘢痕；动物瘢痕模型
Abstract： Objective To study the effect of ginseng extract Rb1 component on hypertrophic scars， providing a new method for the treatment of hypertrophic scars. Methods Select a very mature hypertrophic scar model rabbit ears， do three in each ear hypertrophic scars， scars do each different treatment： control group （a）， saline injection group （b）， ginseng extract （c）. To subject the Masson staining， collagen determination and chemical related expression of immunohistochemistry protein collagen type 1 in each group. Results The Masson staining， collagen determination and chemical related expression of immunohistochemistry protein collagen type 1 in Rb1 group were lower than the other groups. Conclusion The Rb1 can inhibit the development of hypertrophic scars.
Keywords：ginseng extract； scar； animal scar model
瘢痕的治疗作为一种世界性的难题一直以来就缠绕着每一个研究者和患者。难以确定的发病原因和多种影响因素正是纠缠不休的源头。
增强的炎症反应，细胞外基质过度沉寂，血管化反应局部增强，细胞凋亡的变化等都是可能造成增生性瘢痕的原因。其中，胶原是细胞外基质的主要成分，p53、bcl-2等基因影响细胞凋亡。
而中医在病理性瘢痕的治疗上一直都有卓越的贡献，如红花、黑布膏药等[1]。神秘的祖国医学在处理此类难题上具有独特的优势，关于人参提取物在增生性瘢痕的研究上报道不多，此次选取Rb1成分探讨其对增生性瘢痕的治疗是否有效。
1材料和方法
1.1 实验动物、主要仪器与试剂
普通大耳白兔9只，雌雄不限，体重2.6-3.5 kg，单笼饲养。
人参皂苷Rb1纯品（纯度≥98%）——天津灏洋生物科技有限公司提供，配制成浓度为1.0mg/mL。
胶原I型蛋白（bs-0578R）、Masson染色试剂盒--购自北京中衫金桥生物技术有限公司。
光学显微镜，图像分析软件Motic等由河北联合大学基础实验室提供。
1.2 试验方法
1.2.1 增生性瘢痕动物模型的建立
实验兔子适应性喂养7d后，根据李荟元[2]等建立的增生性瘢痕动物模型法，严格无菌操作下，用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉3.0mL/kg。分别于兔耳腹侧面中段的内、外、中部用直径约为1.0 cm的打孔器各形成一个圆形标记，每只耳朵3处，建立兔耳增生性瘢痕模型。术中严格无菌操作切除圆形标记范围内除包括软骨膜在内的全层皮肤至软骨膜表面，保留软骨，压迫止血，不予包扎。术后7d严格无菌操作下去除创面新生的肉芽组织和血痂，不包扎，任其愈合。
1.2.2 实验分组、标本取材固定
每只兔子耳3处创面分别为空白对照组（a）：术后不进行任何处理；生理盐水对照组（b）：上皮化后（即26d后）在兔耳创面周围皮下注射生理盐水；治疗组上皮化（约26d）后兔耳创面周围皮下注射不同浓度的人参皂苷Rb1（c）。即每个瘢痕做不同处理。每处创面注射剂量约为0.3 ml，每3d一次，共三次。大体观察创面愈合和增生性瘢痕情况。
分别于术后第2、4、6周切去瘢痕组织标本每次取3只兔子，置于多聚甲醛固定液中，石蜡包埋，沿组织横切面进行切片。行Masson染色，免疫组织化学胶原Ⅰ型蛋白表达检测。
1.3 结果检测
1.3.1 观察
观察创面愈合情况；术后26d，肉眼观察各组增生性瘢痕的硬度，色泽，形态。
镜下观察（Masson染色）
采集标本须包括瘢痕组织周边部分正常皮肤，4 %多聚甲醛固定24-72 h，乙醇脱水，石蜡包埋，沿瘢痕凸起最高点纵行切片。
Masson染色：胶原纤维、粘液、软骨呈蓝色；胞浆、肌肉、纤维素、神经胶质呈红色；胞核蓝紫色。
胶原含量测定：Masson染色，×200倍光镜下，每个切片随机选取3个视野，利用图像分析系统计算胶原含量、密度，结果取均数。
1.3.2 免疫组化（collagen I蛋白的表达）
collagen I：应用常规二步免疫组化法严格按试剂和说明书操作，以PBS代替一抗为阴性对照，有棕黄色颗粒者为阳性细胞，在200倍光镜观察下随机取3个视野进行计数，结果取均数。 阳性细胞反应率=阳性细胞数/细胞总数×100%。
1.4 统计学处理
用SPSS 13.0 进行数据处理，计量资料以“均数（x ）标准差（s）”的表现形式，检查数据的方差齐性，如若不齐还需添加纠正检验，之后再进行配对t检验，方差分析等。选α=0.05，当 P≤0.05为差异有统计学意义，P？0.05则认为差异无统计学意义。
2结果
2.1观察
各组创面均愈合良好，未见感染不愈，各组愈合时间约为26d，外观粗略观察各组间无显著差别。瘢痕增生隆起突出于周围正常皮肤表面，但未超出创伤范围，可见a， b组形成的增生性瘢痕最显著，瘢痕呈圆形，范围未能超出造模时打孔器的标记范围，中央呈“小丘样”或“乳头样”凸起，质硬；c组与前两组比较，瘢痕增生程度较轻，表面较平坦，质略软，色浅。
1.造模术后第一天 2.达到完全上皮化时，造模成功 3.用药后第6w
2.2组织学变化
Masson染色：胶原纤维、粘液、软骨呈蓝色；胞浆、肌肉、纤维素、神经胶质呈红色；胞核蓝紫色。表皮细胞层数少，细胞排列整齐，胶原排列整齐几乎成平行状态，间隙分明，条理性明显，细胞成分少，少见血管组织。a、b组表皮细胞层数明显增多，细胞排列杂乱，体积变大，胶原增生明显，胶原纤维排列杂乱扭曲难以看到整体形态，间隙不明显，常见胶原结节出现和漩涡状结构，细胞成分明显增多，细胞体积变大，血管组织数量较正常组增多。c组胶原排列整齐、数量减少，观察到的细胞成分减少，并且可见到趋于水平排列的多层胶原纤维束，新生血管和胶原结节的数量也相应减少。
1.正常组织×200 a.空白对照a组 ×400 b.生理盐水b组 ×400 c.药物干预c组×400
胶原纤维密度，含量测定，结果见表一：a，b组之间胶原纤维密度无显著性差异（p>0.05），c组的胶原密度相比a、b组下降，有统计学意义 （P<0.05）。
2.3免疫组织化学结果见表一：
Ⅰ型胶原蛋白的阳性表现见棕黄色颗粒，略粗，密度高，排列不规则，可呈旋涡状（如图四）。a，b组的差异无统计学意义（P>0.05），c组collagen I的阳性表达相比a，b组降低，有统计学意义 （P<0.05）
3讨论
病理性瘢痕分为增生性瘢痕、瘢痕疙瘩，其形成是由于创伤愈合过程成纤维细胞合成胶原能力增强，导致以胶原为主要成分的细胞外基质（ECM）增多和过度沉积。增生性瘢痕（HS）是皮肤真皮损伤愈合后遗留的高出周围正常皮肤、发红、坚硬的病理结构，瘙痒、疼痛等症状，既影响外貌和功能，也会对患者心理造成不同程度的障碍。
常见的治疗方法有：药物、压迫、放射、激光[3]及手术治疗等。然而至今还没有发现非常令人满意的特别有效的防治策略。
中药治疗瘢痕有悠久的历史，认为瘢痕形成主要由气血壅滞、经络痹阻、痰湿搏结所致， 或相辅相成。有内治法、外治法和内外兼治。人参皂苷单体抗细胞纤维化，促血管生成与抑制TGF-β1的刺激胶原增生的作用均提示人参皂苷有效成分具有促进伤口愈合预防增生性瘢痕的产生的作用。人参皂甙Rb1有强大的促进创面愈合能力[4]，以及抑制ECM分泌的作用[5]。刘鹤松[6]等认为人参皂苷Rg3能够抑制病理性瘢痕的增生。而对人参皂甙Rb1的研究主要在神经和心血管方面[7，8]，而在瘢痕的研究仍少见。但李俊飞[9]认为Rb1能增加正常人成纤维细胞的增殖水平，所以对Rb1对增生性瘢痕的治疗效果还要从用药时机、浓度和方式等多方面进行深入探讨。
瘢痕组织中基质成分包括胶原纤维、结构性蛋白及蛋白多糖等，其中胶原纤维是瘢痕组织的主要成分，其中又以Ⅰ型胶原纤维居多。胶原的合成与降解是一个复杂的动态过程，在这个过程中，多种生物活性酶如氧化酶、蛋白酶、胶原酶和金属蛋白酶等参与其中[10]。正常情况下，胶原合成与分解呈动态平衡。当这种平衡被打破，导致成纤维、肌纤维母细胞合成胶原增多，分解减少，合成速度远大于胶原分解，最终导致了胶原沉积，从而形成瘢痕组织。成纤维细胞是产生胶原的主要细胞，所以抑制成纤维细胞的增殖和调节胶原蛋白的合成可能是治疗增生瘢痕的有效途径。
增生性瘢痕组织的主要成分是Ⅰ型胶原，如实验结果显示，a、b组的表达最高无差异，c组的阳性表达与前者相比有所下降。
本研究通过对瘢痕用药干预，通过外观形态，组织切片染色，免疫组化方法研究胶原量的变化趋势，认为人参皂苷对增生性瘢痕的治疗有效。中药应用于增生性瘢痕期待有更升入全面的探索。
参考文献：
[1] 刘燕，傅跃先，邱林，等.红花注射治疗对兔耳增生性瘢痕中.TGFβ1的表达变化[J].重庆医学，2011，40（13）：1294-1296.
[2] 李荟元，刘建波，夏炜等.建立增生性瘢痕动物实验模型的建立与应用[J].第四军医大学学报，1998，19（6）：655-657.
[3] De Carvalho Pde T， da Silva IS， Reis FA， et al. Influence of ingaalp laser （660 nm） on the healing of skin wounds in diabetic rats[J]. Acta Cir Bras，2010，25（1）：71-79.
[4]Kimura Y， Sumiyoshi M， Kawahira K， Sakanaka M. Effects of ginseng saponins isolated from Red Ginseng roots on burn wound healing in tmice[J].Br J Pharmacol. 2006 Jul；148（6）：860-70. Epub 2006 Jun 12.
[5] 谢席胜，刘衡川，樊均明，等。人参皂苷Rb1对转化生长因子诱导的肾小管上皮细胞p47phox的表达及细胞外基质的影响[J].四川大学学报：医学版， 2009，40（1）：106-110.
[6] 刘鹤松，赵自然，兰珊珊），等。人参皂苷Rg3对人成纤维细胞增殖和凋亡影响的实验研究[J].中国实验诊断学，2010，14（11）：1697-1700.
[7] 孔宏亮，李占全，袁龙. 一氧化氮合酶/一氧化氮介导人参皂苷Rb1对心肌细胞肥大的抑制效应[J].广东医学，2012，33（2）：167-169.
[8]李玉倩，王芳，陈建国。人参皂苷Rb1抗抑郁作用的动物行为学研究[J].河南医学研究，2011，20（3）：257-263.
[9]李俊飞，周大兴，洪先业，等. 人参皂苷Rb1，Rb1及Re对人皮肤胶原代谢作用的研究[J].同济大学学报：医学版，2011，32（3）：28-32.
[10]Peters T，Sindrilaru A，Huber R，et al.Overexpression of manganese superoxide dismutase in human dermal fibroblasts enhances the contraction of free floating collagen lattice：implications for ageing and hyperplastic scar formation [J].Archives of Dermatological Research，2009，30（4）：273-287.