论文部分内容阅读
摘要：文章建立了水产品中氯霉素药物残留量测定的液相色谱-串联质谱法（GC-MS/MS），实验数据分析表明：该方法用于氯霉素残留的检测中，灵敏度、精密度和准确度均能满足检测分析要求，在水产品中氯霉素药物的残留测定中具有很好的应用前景。
关键词：氯霉素；残留检测；GC-MS/MS；试验；样品前处理
1 引言
氯霉素（chloramphenicol，以下简称CAP）作为人工合成的广谱抗菌药，因其具有抑菌性和杀菌性而被广泛用于水产养殖过程中的细菌性疾病预防及治疗。但同时也带来了水产品中氯霉素残留的严重问题。研究表明，氯霉素一般较稳定，不易降解，在水产品中的残留可通过食物链进入人体，易引起人体血中毒，导致不可逆的再生障碍性贫血，严重影响人体的正常生理功能。因此，氯霉素残留问题已引起人类的高度重视。本试验采用气相色谱-串联质谱法（GC-MS/MS），以串联质谱作为检测器进行试验检验。现将试验过程及结果分析小结如下。
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 试验原材料
鱼肉组织，市场销售。
2.1.2 主要试剂与材料
乙酸乙酯、正己烷、甲醇、乙腈（色谱纯，美国Fisher Scientific公司）；氯霉素标准、衍生化试剂BSTFA（美国Supelco公司）；C18固相萃取柱（美国安捷伦公司）。
2.1.3主要仪器
气相色谱-串联质谱仪（78卯B-7000B，美国安捷伦公司）；均质机（T18 digital，德国IKA公司离心机（CT18RT，上海天美公司）；固相萃取装置（Visiprep DLSPE，美国Supelco公司）；分析天平（CP213，美国OHAUS公司）；氮吹仪（MG-2000，日本EYELA公司）；旋转蒸发仪（SB-1100，日本EYELA公司）。
2.2 标准溶液配制
氯霉素标准溶液：配制100mg/L的标准储备液，保存于1～4℃冰箱中冷藏，使用时用甲醇稀释至相应浓度做标准工作曲线。
2.3 样品前处理
2.3.1 分离提取
准确称取鱼肉（鱼糜状）（5±0.01）g于具塞离心管中，加人20mL乙酸乙酯，在组织匀浆机均质1min后，用15mL乙酸乙酯清洗刀头倒人离心管中，高速离心机10000r/min离心3min，将上清液倒入浓缩品中，浓缩近干，用甲醇-水（V：V=1：l）溶液5mL定容，待净化。
2.3.2 固相萃取净化
在固相萃取装置上放置C18萃取柱，依次用甲醇、蒸馏水活化C18柱后抽干，将2.3.1定容液过柱，用5mL蒸馏水淋洗柱子，抽干后用甲醇溶剂洗脱，收集洗脱液于10mL试管中氮氣吹干。
2.3.3 衍生化
吹干的试管中加人0.5mL的甲苯和0.2mL的BSTFA衍生化试剂，在70℃烘箱中衍生30min，取出后氮气吹干0.5mL正已烷定容上机。
2.3.4 标准曲线及质控样
分别配置0.5、1.0、2.0、5.0、10.0mg/L浓度的标准液，按2.3.3衍生化后进样制作标准曲线，同时在2.3.1过程中称取2个样品做添加回收率试验。
2.4 测定方法
2.4.1 仪器条件
色谱柱：HP-5MS（30m×0.25mm，0.5fun）；载气：氦气（99.999%）；恒流模式流速：1.0mL/min；进样：1.0nL，不分流；进样口温度：250V；程序升温：80℃保持1min，以20℃/min升温至280℃，保持10min；离子化方式：电子轰击（EI）；离子化能量：70eV；离子源温度：230℃；传输线温度270℃；溶剂延迟：3min；扫描方式：多反应监测（MRM）。扫描范围：50～450amu；定量方式：外标法。
2.4.2 样品测定
将衍生化后定容的样品及标准装入带内衬管的进样瓶中，按上述色谱-质谱条件进行分析测定，通过色谱工作站记录保留时间、峰面积及二级质谱离子的丰度比。
3 结果与讨论
3.1 气相色谱-串联质谱法（GC-MS/MS）优化和选择
在设定的色谱条件下对氯霉素衍生物标准品进行测试分析，首先采用全离子扫描确定目标化合物的保留时间和一级质谱图，设定质谱条件优化子离子及碰撞电压。
3.2 方法的线性范围
通过气相色谱-串联质谱联用仪分析氯霉素标准品的色谱图，以峰面积对应其浓度做标准曲线，方法学参数见表1，
3.3 方法回收率、精密度及检出限
对样品添加0.5和1.0mg/kg两种不同浓度的混合标准，按试验步骤操作，每个浓度各添加5个平行样品，进行回收率重复测定。对样品基质空白进行20次测定，按照3倍信噪比（S/N）作为定量检出限，通过计算所得氯霉素检出限为0.01mg/kg。
3.4 样品的测定
为验证该方法的可靠性和准确性，本次试验选择市场销售的鲫鱼、草鱼、鲤鱼、河鲈及罗非鱼20个样品进行试验，同时选择上述样品做添加回收试验进行质控。在检测的样品中均未检出氯霉素药物残留，检测结果准确、可靠。
4 分析
本次试验所选择的梯度浓度绘制的标准工作曲线，得到线性回归方程相关系数大于0.99以上，表明氯霉素在相应的浓度范围内呈现良好的线性关系，可满足残留检出的定量要求，在对空白鱼肉样品添加的两个浓度水平的氯霉素标准品进行质控试验，氯霉素标准品的回收率大于80%以上，相对标准偏差小于5%，通过计算得到定量检出限（LOD）为0.01mg/kg，以上指标均符合药物残留试验及相关标准法规的分析要求。
5 结论
试验表明，GC-MS/MS法前处理步骤相对简单，杂质干扰少，线性系数在0.99以上，检出限可达到0.01mg/kg，方法简便、快速，具备良好的操作性，以及较高的准确度和精密度，不失为一种高效的水产品氯霉素类药物残留检测方法，应得到推广使用。
参考文献
[1]万译文，邓克国，刘丽.高效液相色谱-串联质谱法同时测定水产品中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的残留量[J].分析试验室，2013（5）：84-87
[2]叶赛，胡莹莹，张奎文，那广水，姚子伟，王菊英，马德毅. 高效液相色谱-串联质谱测定海水中氯霉素残留量[J].分析试验室.2007（02）
关键词：氯霉素；残留检测；GC-MS/MS；试验；样品前处理
1 引言
氯霉素（chloramphenicol，以下简称CAP）作为人工合成的广谱抗菌药，因其具有抑菌性和杀菌性而被广泛用于水产养殖过程中的细菌性疾病预防及治疗。但同时也带来了水产品中氯霉素残留的严重问题。研究表明，氯霉素一般较稳定，不易降解，在水产品中的残留可通过食物链进入人体，易引起人体血中毒，导致不可逆的再生障碍性贫血，严重影响人体的正常生理功能。因此，氯霉素残留问题已引起人类的高度重视。本试验采用气相色谱-串联质谱法（GC-MS/MS），以串联质谱作为检测器进行试验检验。现将试验过程及结果分析小结如下。
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 试验原材料
鱼肉组织，市场销售。
2.1.2 主要试剂与材料
乙酸乙酯、正己烷、甲醇、乙腈（色谱纯，美国Fisher Scientific公司）；氯霉素标准、衍生化试剂BSTFA（美国Supelco公司）；C18固相萃取柱（美国安捷伦公司）。
2.1.3主要仪器
气相色谱-串联质谱仪（78卯B-7000B，美国安捷伦公司）；均质机（T18 digital，德国IKA公司离心机（CT18RT，上海天美公司）；固相萃取装置（Visiprep DLSPE，美国Supelco公司）；分析天平（CP213，美国OHAUS公司）；氮吹仪（MG-2000，日本EYELA公司）；旋转蒸发仪（SB-1100，日本EYELA公司）。
2.2 标准溶液配制
氯霉素标准溶液：配制100mg/L的标准储备液，保存于1～4℃冰箱中冷藏，使用时用甲醇稀释至相应浓度做标准工作曲线。
2.3 样品前处理
2.3.1 分离提取
准确称取鱼肉（鱼糜状）（5±0.01）g于具塞离心管中，加人20mL乙酸乙酯，在组织匀浆机均质1min后，用15mL乙酸乙酯清洗刀头倒人离心管中，高速离心机10000r/min离心3min，将上清液倒入浓缩品中，浓缩近干，用甲醇-水（V：V=1：l）溶液5mL定容，待净化。
2.3.2 固相萃取净化
在固相萃取装置上放置C18萃取柱，依次用甲醇、蒸馏水活化C18柱后抽干，将2.3.1定容液过柱，用5mL蒸馏水淋洗柱子，抽干后用甲醇溶剂洗脱，收集洗脱液于10mL试管中氮氣吹干。
2.3.3 衍生化
吹干的试管中加人0.5mL的甲苯和0.2mL的BSTFA衍生化试剂，在70℃烘箱中衍生30min，取出后氮气吹干0.5mL正已烷定容上机。
2.3.4 标准曲线及质控样
分别配置0.5、1.0、2.0、5.0、10.0mg/L浓度的标准液，按2.3.3衍生化后进样制作标准曲线，同时在2.3.1过程中称取2个样品做添加回收率试验。
2.4 测定方法
2.4.1 仪器条件
色谱柱：HP-5MS（30m×0.25mm，0.5fun）；载气：氦气（99.999%）；恒流模式流速：1.0mL/min；进样：1.0nL，不分流；进样口温度：250V；程序升温：80℃保持1min，以20℃/min升温至280℃，保持10min；离子化方式：电子轰击（EI）；离子化能量：70eV；离子源温度：230℃；传输线温度270℃；溶剂延迟：3min；扫描方式：多反应监测（MRM）。扫描范围：50～450amu；定量方式：外标法。
2.4.2 样品测定
将衍生化后定容的样品及标准装入带内衬管的进样瓶中，按上述色谱-质谱条件进行分析测定，通过色谱工作站记录保留时间、峰面积及二级质谱离子的丰度比。
3 结果与讨论
3.1 气相色谱-串联质谱法（GC-MS/MS）优化和选择
在设定的色谱条件下对氯霉素衍生物标准品进行测试分析，首先采用全离子扫描确定目标化合物的保留时间和一级质谱图，设定质谱条件优化子离子及碰撞电压。
3.2 方法的线性范围
通过气相色谱-串联质谱联用仪分析氯霉素标准品的色谱图，以峰面积对应其浓度做标准曲线，方法学参数见表1，
3.3 方法回收率、精密度及检出限
对样品添加0.5和1.0mg/kg两种不同浓度的混合标准，按试验步骤操作，每个浓度各添加5个平行样品，进行回收率重复测定。对样品基质空白进行20次测定，按照3倍信噪比（S/N）作为定量检出限，通过计算所得氯霉素检出限为0.01mg/kg。
3.4 样品的测定
为验证该方法的可靠性和准确性，本次试验选择市场销售的鲫鱼、草鱼、鲤鱼、河鲈及罗非鱼20个样品进行试验，同时选择上述样品做添加回收试验进行质控。在检测的样品中均未检出氯霉素药物残留，检测结果准确、可靠。
4 分析
本次试验所选择的梯度浓度绘制的标准工作曲线，得到线性回归方程相关系数大于0.99以上，表明氯霉素在相应的浓度范围内呈现良好的线性关系，可满足残留检出的定量要求，在对空白鱼肉样品添加的两个浓度水平的氯霉素标准品进行质控试验，氯霉素标准品的回收率大于80%以上，相对标准偏差小于5%，通过计算得到定量检出限（LOD）为0.01mg/kg，以上指标均符合药物残留试验及相关标准法规的分析要求。
5 结论
试验表明，GC-MS/MS法前处理步骤相对简单，杂质干扰少，线性系数在0.99以上，检出限可达到0.01mg/kg，方法简便、快速，具备良好的操作性，以及较高的准确度和精密度，不失为一种高效的水产品氯霉素类药物残留检测方法，应得到推广使用。
参考文献
[1]万译文，邓克国，刘丽.高效液相色谱-串联质谱法同时测定水产品中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的残留量[J].分析试验室，2013（5）：84-87
[2]叶赛，胡莹莹，张奎文，那广水，姚子伟，王菊英，马德毅. 高效液相色谱-串联质谱测定海水中氯霉素残留量[J].分析试验室.2007（02）