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摘要：建立一种测定L-环己基甘氨酸工业品中L-苯甘氨酸含量的高效液相色谱（HPLC）法。色谱柱为Agela InnovalC18（250mmx4.6mmx5μm），采用乙腈-20mmol/L磷酸二氢钾溶液（v：v=8：92）为流动相（pH 5.0）。L-苯甘氨酸在质量浓度为1.25xlO-4-0.5mg/mL时线性关系良好，相关系数r2为0.9987。实际样品中L-苯甘氨酸日内和日间测定精密度分别为1.2%和2.7%，回收率为102.7%。所建立的HPLC方法能够很好地提供L-环己基甘氨酸样品中相关杂质L-苯甘氨酸的含量信息，并可反映出L-环己基甘氨酸的原料转化率，从而有效地指导其生产工艺的控制。
关键词：高效液相色谱（HPLC）；L-苯甘氨酸；L-环己基甘氨酸；生产工艺控制
文献标志码：A
文章编号：1674-5124（2015）02-0046-04
引 言
环己基甘氨酸是一种非天然氨基酸，广泛用于药学以及肽化学研究，是生产医药产品B-内从事色谱分离和分析工作。
酰氨类抗生素、合成多肽激素以及农药的重要中间体。由于它用途广泛，在医药市场前景广阔。
Adriaan等报道了L-环己基甘氨酸的工业合成方法，L-苯甘氨酸作为原料，以Rh/C为催化剂，通入氢气进行还原，得到L-环己基甘氨酸。L-苯甘氨酸加氢还原的催化剂还有Pd（OH）2/C和Pt02等。该方法原料易得，合成路线简单，易于工业化生产。从合成路径（见图1）可看出，L-苯甘氨酸是L-环己基甘氨酸中的主要杂质。由于两者结构相似，它们在反应上也具有相似性，所以，当L-环己基甘氨酸作为原料生产下游产品时，残留的L-苯甘氨酸将发生与之类似的反应，引入难以分离的副产物，严重影响下游产品质量，因此必须严格控制。
目前国内外对L-苯甘氨酸测定的报道主要集中在手性拆分和纯度检验方面，包括高效液相色谱法、液相色谱一质谱联用法、毛细管电泳法、差减光度法和电致化学发光一分子印迹法等。然而，对于L-苯甘氨酸作为杂质进行测定的方法，国内外暂未见公开报道。因此，实验建立了对L-环己基甘氨酸工业品中L-苯甘氨酸进行快速测定的高效液相色谱法。
1.实验部分
1.1 仪器和试剂
Waters Alliance 2695型高效液相色谱仪（美国Wal.ers公司），配有真空脱气机、四元梯度泵、120位自动进样器、智能型柱温箱、996型二极管阵列（PDA）检测器和Waters Empower色谱管理系统。
甲醇、乙腈为色谱纯（美国Honeywell公司）；磷酸二氢钾为分析纯（南京化学试剂有限公司）；实验中所用水均为娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。L-苯甘氨酸标准品为分析纯（99%），购自上海诚凛生物公司。
1.2色谱条件
色谱柱：Agela Innoval C18柱（250mmx4.6mmX5μm）（天津艾杰尔科技有限公司）；柱温为30℃；流动相：乙腈一磷酸二氢钾溶液（20 mmol/L，pH5.0），8∶92（v∶v）；流速为1.0 mL/min；进样量为10μL；检测波长为210nm。
1.3 溶液的配制
1.3.1 标准溶液的配制
准确称取L-苯甘氨酸标准品lO.OOmg，置于lOmL容量瓶中，用流动相溶解并定容，配得1.000 mg/mL的标准储备液。取标准储备液，用流动相逐级稀释至0.5，0.3，0.1，0.05，0.01，0.005， 0.001， 0.0005，1.25x10-4，3.75xlO-smg/mL。
1.3.2 样品溶液的配制
准确称取L-环己基甘氨酸样品约10.00mg置于10 mL容量瓶中，用流动相溶解并定容，然后超声20min。样品溶液冷却至室温后，经0.45μm孔径的微孔滤膜过滤后进HPLC柱分析。
2.结果与讨论
2.1 色谱条件的优化
2.1.1 检测波长的选择
用二极管阵列检测器在200～400nm波长下进行扫描，L-苯甘氨酸的特征紫外吸收波长为260nm和210nm，其中，260nm处的吸收明显弱于210nm（见图2）。考虑到L-苯甘氨酸为L-环己基甘氨酸样品中的残留，含量不会很高，为提高检测灵敏度、降低检出限，选择210nm为检测波长。
2.1.2 流动相的选择
由于检测波长为210nm，甲醇的截止波长为205nm，乙腈的截止波长为190nm，因此选用乙腈作为有机调节剂，避免流动相吸收引起的干扰。
L-苯甘氨酸和L-环己基甘氨酸都是两性化合物，在中性含水流动相中会部分解离，为防止峰形畸变，保证各被测物质得到足够的色谱保留，在流动相中加入磷酸二氢钾作为离子抑制剂。实验分别考察了乙腈比例和磷酸二氢钾溶液的pH值对分离的影响。
1）有机调节剂比例的影响
固定流动相中磷酸二氢钾水溶液的摩尔浓度为20mmol/L.当乙腈的体积分数由5%变化到10%时，分析物L-苯甘氨酸以及未知杂质I的保留时间均有所缩短（见图3），说明乙腈比例对L-苯甘氨酸及相关杂质的保留行为均有影响，改变乙腈比例可以有效地调节分离时间和各物质的分离情况。综合考虑分离的效果和时间，选择流动相中乙腈的比例为8%。
2）磷酸二氢钾溶液pH的影响
固定流动相中乙腈的比例为8%，考察20mmol/L磷酸二氢钾水溶液pH值变化对分析物保留行为的影响（见图4）。随磷酸二氢钾水溶液pH值的增大，分析物的保留时间逐渐缩短，但是并不显著，峰形也无明显变化，说明磷酸二氢钾溶液的pH值对检测无明显影响。考虑到保护色谱柱的寿命，流动相pH值不应过高或者过低，因此选择pH5.0为最终pH值。
2.2 标准曲线和检出限
在1.2色谱条件下，L-苯甘氨酸标准溶液和L环己基氨酸样品溶液的色谱图如图5所示。各质量浓度的L-苯甘氨酸标准溶液进样两次。其中质量浓度为0.05mg/mL的标准溶液重复进样5次，其峰面积的相对标准偏差（RSD）为0.85%。以峰面积4对质量浓度c作图，如图6所示，L-苯甘氨酸标准溶液质量浓度在1.25xlO-4～0.5mg/mL范围内成线性，线性回归方程为A=l.97xl07c+70018，相关系数r2=0.9987，当S/N=3时，检出限为3.75xl0-5mg/mL。
2.3 回收率测定
精确称取3份L-环己基甘氨酸样品分别置于3只10mL容量瓶中，向其中分别添加已知量的不同浓度的混合标准溶液，按流动相比例稀释至刻度，在建立的色谱条件下进行回收率的测定。L-苯甘氨酸的回收率为102.7%，相对标准偏差为0.5%，结果见表1。
2.4 1-环己基甘氨酸工业品中L-苯甘氨酸质量分
数的测定
平行配制3份样品溶液，每份溶液进样2次，进行日内含量的测定。同法每隔一天配制一份样品溶液，连续3天，进行日间含量的测定。样品色谱图如图5中曲线b所示，质量分数测定结果如表2所示。
3.结束语
本文建立了测定L-环己基甘氨酸工业品中L-苯甘氨酸含量的HPLC方法，成功地实现了L-苯甘氨酸与其他杂质的分离与定量。实验采用AgelaInnoval C18色谱柱，以乙腈-20mmol/L磷酸二氢钾溶液（pH 5.0），8：92（v：v）等度洗脱，检测波长为210nm。本方法不仅操作简便，而且测定快速，准确可靠，可用于L-环己基甘氨酸工业生产的产品检验和中间控制。
关键词：高效液相色谱（HPLC）；L-苯甘氨酸；L-环己基甘氨酸；生产工艺控制
文献标志码：A
文章编号：1674-5124（2015）02-0046-04
引 言
环己基甘氨酸是一种非天然氨基酸，广泛用于药学以及肽化学研究，是生产医药产品B-内从事色谱分离和分析工作。
酰氨类抗生素、合成多肽激素以及农药的重要中间体。由于它用途广泛，在医药市场前景广阔。
Adriaan等报道了L-环己基甘氨酸的工业合成方法，L-苯甘氨酸作为原料，以Rh/C为催化剂，通入氢气进行还原，得到L-环己基甘氨酸。L-苯甘氨酸加氢还原的催化剂还有Pd（OH）2/C和Pt02等。该方法原料易得，合成路线简单，易于工业化生产。从合成路径（见图1）可看出，L-苯甘氨酸是L-环己基甘氨酸中的主要杂质。由于两者结构相似，它们在反应上也具有相似性，所以，当L-环己基甘氨酸作为原料生产下游产品时，残留的L-苯甘氨酸将发生与之类似的反应，引入难以分离的副产物，严重影响下游产品质量，因此必须严格控制。
目前国内外对L-苯甘氨酸测定的报道主要集中在手性拆分和纯度检验方面，包括高效液相色谱法、液相色谱一质谱联用法、毛细管电泳法、差减光度法和电致化学发光一分子印迹法等。然而，对于L-苯甘氨酸作为杂质进行测定的方法，国内外暂未见公开报道。因此，实验建立了对L-环己基甘氨酸工业品中L-苯甘氨酸进行快速测定的高效液相色谱法。
1.实验部分
1.1 仪器和试剂
Waters Alliance 2695型高效液相色谱仪（美国Wal.ers公司），配有真空脱气机、四元梯度泵、120位自动进样器、智能型柱温箱、996型二极管阵列（PDA）检测器和Waters Empower色谱管理系统。
甲醇、乙腈为色谱纯（美国Honeywell公司）；磷酸二氢钾为分析纯（南京化学试剂有限公司）；实验中所用水均为娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。L-苯甘氨酸标准品为分析纯（99%），购自上海诚凛生物公司。
1.2色谱条件
色谱柱：Agela Innoval C18柱（250mmx4.6mmX5μm）（天津艾杰尔科技有限公司）；柱温为30℃；流动相：乙腈一磷酸二氢钾溶液（20 mmol/L，pH5.0），8∶92（v∶v）；流速为1.0 mL/min；进样量为10μL；检测波长为210nm。
1.3 溶液的配制
1.3.1 标准溶液的配制
准确称取L-苯甘氨酸标准品lO.OOmg，置于lOmL容量瓶中，用流动相溶解并定容，配得1.000 mg/mL的标准储备液。取标准储备液，用流动相逐级稀释至0.5，0.3，0.1，0.05，0.01，0.005， 0.001， 0.0005，1.25x10-4，3.75xlO-smg/mL。
1.3.2 样品溶液的配制
准确称取L-环己基甘氨酸样品约10.00mg置于10 mL容量瓶中，用流动相溶解并定容，然后超声20min。样品溶液冷却至室温后，经0.45μm孔径的微孔滤膜过滤后进HPLC柱分析。
2.结果与讨论
2.1 色谱条件的优化
2.1.1 检测波长的选择
用二极管阵列检测器在200～400nm波长下进行扫描，L-苯甘氨酸的特征紫外吸收波长为260nm和210nm，其中，260nm处的吸收明显弱于210nm（见图2）。考虑到L-苯甘氨酸为L-环己基甘氨酸样品中的残留，含量不会很高，为提高检测灵敏度、降低检出限，选择210nm为检测波长。
2.1.2 流动相的选择
由于检测波长为210nm，甲醇的截止波长为205nm，乙腈的截止波长为190nm，因此选用乙腈作为有机调节剂，避免流动相吸收引起的干扰。
L-苯甘氨酸和L-环己基甘氨酸都是两性化合物，在中性含水流动相中会部分解离，为防止峰形畸变，保证各被测物质得到足够的色谱保留，在流动相中加入磷酸二氢钾作为离子抑制剂。实验分别考察了乙腈比例和磷酸二氢钾溶液的pH值对分离的影响。
1）有机调节剂比例的影响
固定流动相中磷酸二氢钾水溶液的摩尔浓度为20mmol/L.当乙腈的体积分数由5%变化到10%时，分析物L-苯甘氨酸以及未知杂质I的保留时间均有所缩短（见图3），说明乙腈比例对L-苯甘氨酸及相关杂质的保留行为均有影响，改变乙腈比例可以有效地调节分离时间和各物质的分离情况。综合考虑分离的效果和时间，选择流动相中乙腈的比例为8%。
2）磷酸二氢钾溶液pH的影响
固定流动相中乙腈的比例为8%，考察20mmol/L磷酸二氢钾水溶液pH值变化对分析物保留行为的影响（见图4）。随磷酸二氢钾水溶液pH值的增大，分析物的保留时间逐渐缩短，但是并不显著，峰形也无明显变化，说明磷酸二氢钾溶液的pH值对检测无明显影响。考虑到保护色谱柱的寿命，流动相pH值不应过高或者过低，因此选择pH5.0为最终pH值。
2.2 标准曲线和检出限
在1.2色谱条件下，L-苯甘氨酸标准溶液和L环己基氨酸样品溶液的色谱图如图5所示。各质量浓度的L-苯甘氨酸标准溶液进样两次。其中质量浓度为0.05mg/mL的标准溶液重复进样5次，其峰面积的相对标准偏差（RSD）为0.85%。以峰面积4对质量浓度c作图，如图6所示，L-苯甘氨酸标准溶液质量浓度在1.25xlO-4～0.5mg/mL范围内成线性，线性回归方程为A=l.97xl07c+70018，相关系数r2=0.9987，当S/N=3时，检出限为3.75xl0-5mg/mL。
2.3 回收率测定
精确称取3份L-环己基甘氨酸样品分别置于3只10mL容量瓶中，向其中分别添加已知量的不同浓度的混合标准溶液，按流动相比例稀释至刻度，在建立的色谱条件下进行回收率的测定。L-苯甘氨酸的回收率为102.7%，相对标准偏差为0.5%，结果见表1。
2.4 1-环己基甘氨酸工业品中L-苯甘氨酸质量分
数的测定
平行配制3份样品溶液，每份溶液进样2次，进行日内含量的测定。同法每隔一天配制一份样品溶液，连续3天，进行日间含量的测定。样品色谱图如图5中曲线b所示，质量分数测定结果如表2所示。
3.结束语
本文建立了测定L-环己基甘氨酸工业品中L-苯甘氨酸含量的HPLC方法，成功地实现了L-苯甘氨酸与其他杂质的分离与定量。实验采用AgelaInnoval C18色谱柱，以乙腈-20mmol/L磷酸二氢钾溶液（pH 5.0），8：92（v：v）等度洗脱，检测波长为210nm。本方法不仅操作简便，而且测定快速，准确可靠，可用于L-环己基甘氨酸工业生产的产品检验和中间控制。