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摘 要: 目的:探讨运动性血红蛋白低下时红细胞膜组分和功能变化的规律。对象与方法:将 雄性SD大鼠60只,随机分为3组:对照组、跑台运动组、负重游泳组。经跑台或负重游泳训 练后,将血红蛋白持续下降的大鼠纳入运动性血红蛋白低下组。取血,制备红细胞悬液,测 定红细胞膜磷脂成分、带3蛋白含量、磷脂酰丝氨酸外翻率、阴离子转运功能、葡萄糖转运 功能、钠钾ATP酶活性及变形能力。结果:与对照组比较,运动性血红蛋白低下组大鼠磷脂 中脑磷脂和卵磷脂丢失较多(p<0.01),带3蛋白含量显著升高。同时,磷脂酰丝氨 酸外翻率、红细胞滤过分数显著上升(p<0.01),阴离子转运功能、葡萄糖转运能力 、钠钾ATP酶活性均显著下降(p<0.05)。结论:长时间激烈运动通过影响红细胞膜 组分和功能,导致红细胞损伤和老化,清除标记增多,膜流变性下降,变形能力减弱,造成 红细胞溶血和/或清除增多,发生运动性血红蛋白低下。
关键词:运动性血红蛋白低下;红细胞膜;磷脂;膜蛋白
中图分类号:G804.2文献标识码:A文章编号 :1007-3612(2010)03-0062-04
Alteration of Structure and Function of Red Cell Membrane in Rat s with Sports Hypochrosis
PAN Xiaogui,XU Hongwei
(Department of Physical Education, Huzhou normal University,Huzhou 313000,Zhejiang China)
Abstract: The aim of this paper was to elucidate the alterations of red cell membrane thatoccur in rats following treadmill running or forced swimming.13 of 20 rats intreadmill training group and 10 of 20 rats in forced swimming group,whose Hb co ntent decreased insistently, were subjected to sports hypochrosis group. The pr ofile of phospholipids and band 3 protein of erythrocyte membrane were i nvestigated, and the eversion rate of phosphatidylserine, transport function ofband 3 protein, glucose transporter protein, and Na+, k+ATPase activity, f iltration index of red cell, were tested. Compared with control group, cephalinand lecitin of phospholipid profile in sports hypochrosis group decreased signi ficantly, but band3 protein increased significantly. On the other hand, the e version rate of erythrocyte membrane phosphatidylserine and filtration index ofred cell increased significantly, but band 3 protein anion transport function, g lucose transporter glucosetransport function, Na+,k+ATP activity decreas ed markedly. It is suggested that following inadaptable high intensity exercise , the content of membrane phospholipids are cut off, band 3 protein crosslinked,the function of membrane phospholipids and proteins weakened, which adversely i nfluence erythrocyte deformability. As the result, red cell clearance increasesand sports hypochrosis occurs.
Key words: sports hypochrosis; red cell membrane; membrane phospholipids ; membrane proteins
1959年日本学者Yoshimura首次提出运动性贫血概念(sports anemia),即由于剧烈运动导 致的贫血现象。运动性贫血的早期血液学检测表现为血红蛋白低下,称为运动性血红蛋白( 血色素)低下[1]。运动性血红蛋白低下的发生可能与运动诱导的红细胞膜蛋白和 脂质成分 的结构和功能异常有关,但还没有系统的相关研究。本实验在运动性血红蛋白低下动物模型 的基础上,探讨激烈运动过程中红细胞膜脂质和重要蛋白的结构和功能的变化,为阐明运动 性贫血的细胞生物学机制提供实验依据。
1 研究对象与方法
1.1 实验动物与分组
雄性SD大鼠60只,体重(200±15)g,由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供,动物许 可证编号:SCXK(沪)2003-0002,动物级别:二级。随机分为3组:对照组(CG,n=20)、 递增负荷跑台运动组(TG,n=20)、负重游泳组(SG,n=20)。动物饲养环境温度(23±2)℃, 湿度40%～60%;分笼饲养,每笼5只;自由饮食,动物饲料为全价营养颗粒饲料,由上海士 林
投稿日期:2009-08-12
基金项目:安徽省教育厅青年教师科研资助项目(2004jql904);湖州 师范学院科研创新团队计划资助(XK25002)。
作者简介:潘孝贵,副教授,博士,研究方向运动人体生物科学。 动物饲料有限公司提供;12:12光照。动物饲养和管理、处理过程符合国家实验动物管理规 定。
1.2 动物训练方案
CG组大鼠除进行跑台适应性训练(0°,15 m/min,10 min,2次/周)或游泳训练(30 min, 2次/周)外,不给予其他任何处理。
TG组大鼠进行递增负荷运动:动物跑台为DSPT-202(浙江杭州段氏制造),训练方案见 表1。训练过程中,若大鼠出现疲劳现象(不愿意跑、滞留跑台的后1/3、电击驱赶无效), 允许动物休息2～3 min,然后继续运动,直到完成预定的训练计划。
SG组大鼠进行负重(5%体重)游泳,游泳池为瓷砖铺壁,规格为60×60×150 cm,水深1 00 cm(超过动物身长的2倍),水温(25±1)℃。第1 d游泳60 min,然后每2 d递增15 min ,6 d/周训练。当游泳时间达到3 h时,维持在该运动负荷至实验结束。若大鼠沉入液面下1 0 s不能自主浮出水面,可以让其休息2～3 min,直到其完成训练计划为止。
表1 递增负荷跑台训练方案
第1 d第2 d 第3 d第4 d第5 d第6 d第1周0,15,300,15,450,15,600,20,300,20,450,20 ,60第2周3,15,303,15,453,15,603,20,303,20,453,20 ,60第3周6,15,306,15,456,15,606,20,306,20,456,20 ,60第4周9,15,309,15,459,15,609,20,309,20,459,20 ,60注:表中数据从左到右依次是跑台的坡度、速度、运动时间,单位分别为°、m/min、min 。
1.3 样本采集与测试
每2 d称体重和取尾静脉血检测血红蛋白含量。当大鼠血红蛋白下降后,继续训练2 d,然后 将血红蛋白显著下降的大鼠纳入运动性血红蛋白低下阳性组(positive sports hypoch rosis,PSH)。其中,TG组训练至第4周有13只大鼠、SG组至第6周有10只大鼠血红蛋白显著 下降。其他虽训练但血红蛋白未显著下降的大鼠纳为潜在运动性血红蛋白低下组(latent s ports hypochrosis,LSH),训练结束后24小时,所有同组大鼠同时麻醉处死(戊巴比妥钠 ,30 mg/kg,ip)。取血,肝素抗凝,分离红细胞,待用。
1.4 实验方法 血红蛋白:测定采用高铁氰化钾法,试剂由上海 开益试剂公司提供。
脂质组分:红细胞用等渗NaCl洗涤3次,Tris-Cl缓冲液低渗破膜,20 000 r/min,离心 20 min,弃去上层,留沉淀膜,重复洗涤,离心3次;取膜悬液0.5 mL加入氯仿:甲醇:盐 酸(比例按2:1:0.01,V/V)混合液5 mL,振荡,静置,加入0.05 mol/LCaCl2溶液振荡 ,2 000 r/min,离心10 min,取下层清液,40～50℃水浴下,用N2气吹干,加入正己烷 :异丙醇(比例按3:1,V/V)0.2 mL,冲N2,密闭,-80℃保存;参考Shafiq-UR-Rehman 建立的方法,采用HP1090M高效色谱仪,HP108309移液系统,HP9153A数据处理机和HPDAD(2 极管阵列测 器)。按Lowry法进行膜悬液蛋白定量。
带3蛋白含量:采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法。凝胶用凝胶电泳成像分析仪进行扫描 ,Image plus pro 2.0 软件分析条带的光密度值。以Sigma公司提供的标准品(兔磷酸化 酶)为参照进行定量测定,标准品量为12.5 μg。
磷酯酰丝氨酸外翻率:采用Coulter流式细胞仪,由Boehringer mannheim公司提供AnnexinV-Fluos S试剂盒。1 μL压积红细胞中加入1 mL生理盐水,混匀悬浮;取100 μL红细胞 混悬液(相当于红细胞计数106个),加入100 μLPS反应液室温下孵育10～15 min,洗去反应 液,加入400 μLPS孵育液,上机测定,结果以百分比表示。
带3蛋白阴离子转运功能:根据周汉清、张志鸿方法[2]。用50%溶血时间来表 示阴离子转运功能。50%溶血时间越长,阴离子转运能力越弱,反之,越强。
葡萄糖载体蛋白-1:根据张志鸿研究方法[3]。从红细胞加入PBS时计时,到光 密度值不 变时止所需的时间代表葡萄糖转运的能力。时间越短,葡萄糖转运能力越强,反之越弱。
Na+,K+-ATP酶活性:定磷法,试剂盒由南京建成生物工程公司提供,严格按说明 书操作。膜蛋白定量用考马斯亮兰法。
红细胞变形能力:采用上海医科大学生产的DXC-300型红细胞变形能力测定仪。主要原 理是根据红细胞通过一定孔径时,变形能力差的红细胞不能通过滤膜孔。未通过的红细胞数 占红细胞总数的百分比,称为滤过系数(index of filtration,IF)。IF越大,表明红细 胞的变形能力越差。
1.5 统计学处理 数据用SPSS11.0 for windows软件处理,one way ANOVA分析,结果用均值±标准差表 示,显著性水平为p<0.05。
2 结 果
2.1 运动性血红蛋白低下动物模型的建立 通过递增负荷的4周跑台或6周游泳训练后,将血红蛋白连续下降的大鼠纳入PSH组。与 对照组比较,LSH组大鼠体重和血红蛋白没有显著差异,而PSH组大鼠体重和血红蛋白显著下 降(p<0.01)(表2)。
表2 大鼠体重和血红蛋白的变化
CG(n=20)LSH (n= 17)PSH(n=23)体重/s353.32±22.46338.25±12.65315.67±11.34** 血红蛋白/g•L-1184.32±19.28177.20±18.50164.72±15.35 **** 与CG比较,p<0.01。CG为对照组,LSH为潜在运动性血红蛋白低下组,PSH运动性 血红蛋白低下阳性组。
2.2 运动性血红蛋白低下时大鼠红细胞膜功能的变化
从表3可以看出,与对照组比较,PSH组红细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻率显著增加,带3蛋 白阴离子转运功能、葡萄糖受体转运葡萄糖能力、Na+,k+-ATP调节离子平衡的能力显 著下降,红细胞变形能力显著减弱(P<0.05)。
表3 大鼠红细胞膜功能的变化
组别PS/% Band 3(S)GluT-1(S)Na+,k+-ATP/μmp•mgpr•hr-1RC D(IF)CG(n=20)10.8±0.01769.39±21.78152.25±39.640.124±0.0 324.33±0.65LSH(n=17)10.5±0.01887.63±24.69169.78±41.240.123±0. 0315.56±1.24PSH(n=23)19.2±0.012*100.84±25.78*183.68±47.21*0. 096±0.021*6.43±1.35** 与CG比较,P<0.05。CG为对照组,LSH为潜在运动性血红蛋白低下组,PSH运动性血 红蛋白低下阳性组;PS:磷脂酰丝氨酸,Band 3:带3蛋白,GluT-1:葡萄糖载体-1,Na+ ,k+-ATP:钠,钾-ATP酶,RCD:红细胞变形能力。
2.3 运动性血红蛋白低下大鼠红细胞膜脂质组分的变化
从表4可以看出,与对照组比较,PSH组红细胞膜脂质组分中,脑磷脂和卵磷脂明显减少(P <0.01),而其他组分没有明显的变化。LSH组大鼠与安静组比较没有显著差异。
表4 大鼠红细胞膜脂质成分的变化 μg/mg protein
组别PSPEP CSMCG(n=20)0.108±0.0170.245±0.0320.225±0.0810.210±0.0 37LSH(n=17)0.105±0.0180.234±0.0310.220±0.0910.208±0. 038PSH(n=23)0.092±0.0120.196±0.011**0.202±0.032** 0.199±0.034** 与CG比较,P<0.01。CG为对照组,LSH为潜在运动性血红蛋白低下组,PSH运动性 血红蛋白低下阳性组;PS:磷脂酰丝氨酸,PE:脑磷脂,PC:卵磷脂,SM:鞘磷脂。
2.4 运动性血红蛋白低下大鼠红细胞膜带3蛋白组分的变化 如表5所示,与对照组、LSH组比较,PSH组红细胞膜上重要的蛋白-带3蛋白含量显著增 高。
表5 红细胞膜带3蛋白含量的变化OD
CG(n=20)L SH (n=17)PSH(n=23)Band 379.63±15.1675.62±16.2585.34±17.98** 与对照组比较,P<0.05。CG为对照组,LSH为潜在运动性血红蛋白低下组,PSH为运 动性血红蛋白低下组。
3 讨 论
尽管正常情况下,红细胞寿命为120 d,但运动,尤其是长时间大强度运动,可以加速 红细胞的衰老,衰老的红细胞易发生破裂而溶血或被吞噬细胞清除,加上机体蛋白质和铁缺 乏造成的血红蛋白合成不足,诱发运动性血红蛋白低下。以前研究者多采用溶血指标如血浆 中血红蛋白、触珠蛋白含量来反映红细胞破坏,但红细胞的清除主要发生在血管外(肝脏和 脾脏处),并不涉及溶血过程,故诸多学者将目光投向红细胞膜,希冀从膜生物学的角度来 阐明运动诱导的红细胞损伤机制。
红细胞膜主要由磷脂和蛋白质组成,磷脂主要包括PS(磷脂酰丝氨酸)、PE(脑磷脂)、PC (卵磷脂)、SM(鞘磷脂)四种组分。当红细胞能量供应不足,或细胞内Ca2+超负荷 , 激活细胞膜上的混转酶(scramblase),它将细胞膜内部的PS转移到红细胞表面,即外翻。PS 外翻被认为是红细胞衰亡和清除的重要信号[4],PS外翻率是常用的红细胞老化参 数,巨噬 细胞表面存在磷脂酰丝氨酸受体,它可以识别、吞噬并降解红细胞。本研究发现,与对照组 比较,运动性血红蛋白低下大鼠红细胞膜PS外翻率增加,表明红细胞膜出现衰亡标记,易被 吞噬细胞识别而清除,与金丽等人的结果相似[5]。同时,本研究还发现,运动性 血红蛋白低下大鼠红细胞膜PC、PE含量显著降低(P<0.05),与孙福茂等人的研究结 果一致[6]。提 示,运动性血红蛋白低下时红细胞膜存在以PC、PE降低为主的磷脂组分代谢障碍。膜磷脂丢 失,导致磷脂和胆固醉含量及其比值降低,红细胞膜形态结构异常,功能下降,抗原暴露增 多,脆性增加,易被吞噬细胞吞噬或破裂溶血。磷脂的丢失可能与运动激活了红细胞膜上的 磷脂酶A 2有关。磷脂酶A 2将脑磷脂和卵磷脂分解为溶血性磷脂,细胞膜结构部分丢失 [7],也可能与自由基攻击诱导的脂质过氧化有关[8]。
红细胞膜蛋白种类较多,约8～12种,是红细胞生理功能的执行者。其中,带3蛋白是红 细胞膜上含量最丰富的蛋白,占总蛋白含量的25%,主要介导阴离子转运功能,与氧和二氧 化碳的运输密切相关,还介导衰老红细胞的清除;葡萄糖载体蛋白-1通过协助扩散方式将血 浆中的葡萄糖快速转运入膜内,以保证红细胞正常的能量代谢;Na+,K+-ATP酶是维持 红细 胞膜内外离子浓度梯度最重要的离子泵,是反映红细胞活力的主要酶指标。已有研究表明, 激烈运动后,红细胞膜带3蛋白转运功能下降[9],Na+,K+-ATP酶活性升高或 降低[9-11], 取决于运动负荷,葡萄糖载体-1转运能力降低[9]。本研究发现,运动性血红蛋白 低下大鼠 红细胞膜带3蛋白转运阴离子、葡萄糖载体-1转运葡萄糖、Na+,K+-ATP酶活性、红细胞 变形 能力显著下降,与衰老的红细胞相似。金丽也发现,运动性贫血的运动员和大鼠红细胞膜Na +,K+-ATP酶活性显著降低[12]。一些研究也发现,运动性血红蛋白低下大鼠 异型红细 胞(棘形、口形、草帽形等)数量增多,表明一些红细胞无法保持正常形态,从另一个方面 支持本研究结果。红细胞膜蛋白功能下降可能与运动造成的内环境酸化和自由基攻击诱导的 脂质过氧化有关[8,9]。
激烈运动过程中,红细胞膜蛋白组分可能会发生丢失或交联。带3蛋白作为红细胞膜上 整合蛋白,可结合锚蛋白分子,约40%的带3蛋白分子参与了膜骨架的锚定,对维持红细胞膜 骨架的稳定至关重要。一些疾病,如刺状红细胞增多症、遗传性椭圆形细胞增多症,均与带 3蛋白的变异有关[4]。李开刚[12]等用SDS-聚丙酰胺凝胶电泳研究发现, 一次性大强度训练 带3蛋白含量减少。陈筱春等人[13]发现,疲劳运动后,大鼠红细胞膜带3蛋白含量 显著下降 ,红细胞渗透脆性增加。Jordan[14]发现,经过马拉松运动后,血浆结合珠蛋白浓 度下降, 扫描电镜发现红细胞膜骨架面积显著高于运动前,表明激烈运动可以导致红细胞膜蛋白结构 发生改变。Brzeszczynska发现,尽管普通健康成年人一次性力竭性运动(递增负荷自行车 运动至力竭)并不会出现溶血现象,但造成了红细胞膜蛋白交联、硬度提高(运动后即刻和 1 h最明显),与脂质过氧化有关[15]。另外,运动过程中,膜骨架蛋白中主要 蛋白-收 缩蛋白(spectrins)也可能受到损伤。Yusof等人[16]发现,6个男性受试者在完 成216 k m跑步过程中,42 km后红细胞膜收缩蛋白含量最低,且渗透脆性最高,在最先84 km的跑步 中有溶血发生,主要以一些衰老的红细胞为主。本研究发现,运动性血红蛋白低下大鼠红细 胞膜带3蛋白含量显著增加,即产生交联[17]。因此,激烈运动可以造成带3蛋白等 膜蛋白的 丢失或交联,造成膜骨架结构异常,使骨架蛋白失去与膜内表面的连接,红细胞对切应力的 应答能力丧失,变形能力下降,易发生溶血或被吞噬细胞吞噬。曹建民等[18]认为 ,由于运 动训练导致大鼠红细胞膜带3蛋白磷酸化显著增加,从而影响红细胞膜骨架,进而使红细胞 溶血增加,是导致运动性低血色素发生的重要原因。
4 结 论
持续4～6周的递增负荷训练后,部分大鼠血红蛋白水平显著降低,即发生运动性血红蛋 白低下。运动性血红蛋白低下大鼠红细胞膜脂质组分中脑磷脂和卵磷脂丢失较多,衰亡标记 -磷脂酰丝氨酸外翻率显著增加,呈老化状态;与红细胞生理功能密切相关的重要蛋白-带3 蛋白、葡萄糖载体蛋白-1、Na+,K+-ATP酶的功能下降,且带3蛋白发生交联,从而影响 膜骨架的稳定。
提示,长时间激烈运动通过影响红细胞膜组分和功 能,导致红细胞损伤和老化, 清除标记增多,膜流变性下降,变形能力减弱,造成红细胞溶血和/或清除增多,这可能是 运动性血红蛋白低下发生的重要细胞生物学机制。
参考文献:
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关键词:运动性血红蛋白低下;红细胞膜;磷脂;膜蛋白
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Alteration of Structure and Function of Red Cell Membrane in Rat s with Sports Hypochrosis
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(Department of Physical Education, Huzhou normal University,Huzhou 313000,Zhejiang China)
Abstract: The aim of this paper was to elucidate the alterations of red cell membrane thatoccur in rats following treadmill running or forced swimming.13 of 20 rats intreadmill training group and 10 of 20 rats in forced swimming group,whose Hb co ntent decreased insistently, were subjected to sports hypochrosis group. The pr ofile of phospholipids and band 3 protein of erythrocyte membrane were i nvestigated, and the eversion rate of phosphatidylserine, transport function ofband 3 protein, glucose transporter protein, and Na+, k+ATPase activity, f iltration index of red cell, were tested. Compared with control group, cephalinand lecitin of phospholipid profile in sports hypochrosis group decreased signi ficantly, but band3 protein increased significantly. On the other hand, the e version rate of erythrocyte membrane phosphatidylserine and filtration index ofred cell increased significantly, but band 3 protein anion transport function, g lucose transporter glucosetransport function, Na+,k+ATP activity decreas ed markedly. It is suggested that following inadaptable high intensity exercise , the content of membrane phospholipids are cut off, band 3 protein crosslinked,the function of membrane phospholipids and proteins weakened, which adversely i nfluence erythrocyte deformability. As the result, red cell clearance increasesand sports hypochrosis occurs.
Key words: sports hypochrosis; red cell membrane; membrane phospholipids ; membrane proteins
1959年日本学者Yoshimura首次提出运动性贫血概念(sports anemia),即由于剧烈运动导 致的贫血现象。运动性贫血的早期血液学检测表现为血红蛋白低下,称为运动性血红蛋白( 血色素)低下[1]。运动性血红蛋白低下的发生可能与运动诱导的红细胞膜蛋白和 脂质成分 的结构和功能异常有关,但还没有系统的相关研究。本实验在运动性血红蛋白低下动物模型 的基础上,探讨激烈运动过程中红细胞膜脂质和重要蛋白的结构和功能的变化,为阐明运动 性贫血的细胞生物学机制提供实验依据。
1 研究对象与方法
1.1 实验动物与分组
雄性SD大鼠60只,体重(200±15)g,由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供,动物许 可证编号:SCXK(沪)2003-0002,动物级别:二级。随机分为3组:对照组(CG,n=20)、 递增负荷跑台运动组(TG,n=20)、负重游泳组(SG,n=20)。动物饲养环境温度(23±2)℃, 湿度40%～60%;分笼饲养,每笼5只;自由饮食,动物饲料为全价营养颗粒饲料,由上海士 林
投稿日期:2009-08-12
基金项目:安徽省教育厅青年教师科研资助项目(2004jql904);湖州 师范学院科研创新团队计划资助(XK25002)。
作者简介:潘孝贵,副教授,博士,研究方向运动人体生物科学。 动物饲料有限公司提供;12:12光照。动物饲养和管理、处理过程符合国家实验动物管理规 定。
1.2 动物训练方案
CG组大鼠除进行跑台适应性训练(0°,15 m/min,10 min,2次/周)或游泳训练(30 min, 2次/周)外,不给予其他任何处理。
TG组大鼠进行递增负荷运动:动物跑台为DSPT-202(浙江杭州段氏制造),训练方案见 表1。训练过程中,若大鼠出现疲劳现象(不愿意跑、滞留跑台的后1/3、电击驱赶无效), 允许动物休息2～3 min,然后继续运动,直到完成预定的训练计划。
SG组大鼠进行负重(5%体重)游泳,游泳池为瓷砖铺壁,规格为60×60×150 cm,水深1 00 cm(超过动物身长的2倍),水温(25±1)℃。第1 d游泳60 min,然后每2 d递增15 min ,6 d/周训练。当游泳时间达到3 h时,维持在该运动负荷至实验结束。若大鼠沉入液面下1 0 s不能自主浮出水面,可以让其休息2～3 min,直到其完成训练计划为止。
表1 递增负荷跑台训练方案
第1 d第2 d 第3 d第4 d第5 d第6 d第1周0,15,300,15,450,15,600,20,300,20,450,20 ,60第2周3,15,303,15,453,15,603,20,303,20,453,20 ,60第3周6,15,306,15,456,15,606,20,306,20,456,20 ,60第4周9,15,309,15,459,15,609,20,309,20,459,20 ,60注:表中数据从左到右依次是跑台的坡度、速度、运动时间,单位分别为°、m/min、min 。
1.3 样本采集与测试
每2 d称体重和取尾静脉血检测血红蛋白含量。当大鼠血红蛋白下降后,继续训练2 d,然后 将血红蛋白显著下降的大鼠纳入运动性血红蛋白低下阳性组(positive sports hypoch rosis,PSH)。其中,TG组训练至第4周有13只大鼠、SG组至第6周有10只大鼠血红蛋白显著 下降。其他虽训练但血红蛋白未显著下降的大鼠纳为潜在运动性血红蛋白低下组(latent s ports hypochrosis,LSH),训练结束后24小时,所有同组大鼠同时麻醉处死(戊巴比妥钠 ,30 mg/kg,ip)。取血,肝素抗凝,分离红细胞,待用。
1.4 实验方法 血红蛋白:测定采用高铁氰化钾法,试剂由上海 开益试剂公司提供。
脂质组分:红细胞用等渗NaCl洗涤3次,Tris-Cl缓冲液低渗破膜,20 000 r/min,离心 20 min,弃去上层,留沉淀膜,重复洗涤,离心3次;取膜悬液0.5 mL加入氯仿:甲醇:盐 酸(比例按2:1:0.01,V/V)混合液5 mL,振荡,静置,加入0.05 mol/LCaCl2溶液振荡 ,2 000 r/min,离心10 min,取下层清液,40～50℃水浴下,用N2气吹干,加入正己烷 :异丙醇(比例按3:1,V/V)0.2 mL,冲N2,密闭,-80℃保存;参考Shafiq-UR-Rehman 建立的方法,采用HP1090M高效色谱仪,HP108309移液系统,HP9153A数据处理机和HPDAD(2 极管阵列测 器)。按Lowry法进行膜悬液蛋白定量。
带3蛋白含量:采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法。凝胶用凝胶电泳成像分析仪进行扫描 ,Image plus pro 2.0 软件分析条带的光密度值。以Sigma公司提供的标准品(兔磷酸化 酶)为参照进行定量测定,标准品量为12.5 μg。
磷酯酰丝氨酸外翻率:采用Coulter流式细胞仪,由Boehringer mannheim公司提供AnnexinV-Fluos S试剂盒。1 μL压积红细胞中加入1 mL生理盐水,混匀悬浮;取100 μL红细胞 混悬液(相当于红细胞计数106个),加入100 μLPS反应液室温下孵育10～15 min,洗去反应 液,加入400 μLPS孵育液,上机测定,结果以百分比表示。
带3蛋白阴离子转运功能:根据周汉清、张志鸿方法[2]。用50%溶血时间来表 示阴离子转运功能。50%溶血时间越长,阴离子转运能力越弱,反之,越强。
葡萄糖载体蛋白-1:根据张志鸿研究方法[3]。从红细胞加入PBS时计时,到光 密度值不 变时止所需的时间代表葡萄糖转运的能力。时间越短,葡萄糖转运能力越强,反之越弱。
Na+,K+-ATP酶活性:定磷法,试剂盒由南京建成生物工程公司提供,严格按说明 书操作。膜蛋白定量用考马斯亮兰法。
红细胞变形能力:采用上海医科大学生产的DXC-300型红细胞变形能力测定仪。主要原 理是根据红细胞通过一定孔径时,变形能力差的红细胞不能通过滤膜孔。未通过的红细胞数 占红细胞总数的百分比,称为滤过系数(index of filtration,IF)。IF越大,表明红细 胞的变形能力越差。
1.5 统计学处理 数据用SPSS11.0 for windows软件处理,one way ANOVA分析,结果用均值±标准差表 示,显著性水平为p<0.05。
2 结 果
2.1 运动性血红蛋白低下动物模型的建立 通过递增负荷的4周跑台或6周游泳训练后,将血红蛋白连续下降的大鼠纳入PSH组。与 对照组比较,LSH组大鼠体重和血红蛋白没有显著差异,而PSH组大鼠体重和血红蛋白显著下 降(p<0.01)(表2)。
表2 大鼠体重和血红蛋白的变化
CG(n=20)LSH (n= 17)PSH(n=23)体重/s353.32±22.46338.25±12.65315.67±11.34** 血红蛋白/g•L-1184.32±19.28177.20±18.50164.72±15.35 **** 与CG比较,p<0.01。CG为对照组,LSH为潜在运动性血红蛋白低下组,PSH运动性 血红蛋白低下阳性组。
2.2 运动性血红蛋白低下时大鼠红细胞膜功能的变化
从表3可以看出,与对照组比较,PSH组红细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻率显著增加,带3蛋 白阴离子转运功能、葡萄糖受体转运葡萄糖能力、Na+,k+-ATP调节离子平衡的能力显 著下降,红细胞变形能力显著减弱(P<0.05)。
表3 大鼠红细胞膜功能的变化
组别PS/% Band 3(S)GluT-1(S)Na+,k+-ATP/μmp•mgpr•hr-1RC D(IF)CG(n=20)10.8±0.01769.39±21.78152.25±39.640.124±0.0 324.33±0.65LSH(n=17)10.5±0.01887.63±24.69169.78±41.240.123±0. 0315.56±1.24PSH(n=23)19.2±0.012*100.84±25.78*183.68±47.21*0. 096±0.021*6.43±1.35** 与CG比较,P<0.05。CG为对照组,LSH为潜在运动性血红蛋白低下组,PSH运动性血 红蛋白低下阳性组;PS:磷脂酰丝氨酸,Band 3:带3蛋白,GluT-1:葡萄糖载体-1,Na+ ,k+-ATP:钠,钾-ATP酶,RCD:红细胞变形能力。
2.3 运动性血红蛋白低下大鼠红细胞膜脂质组分的变化
从表4可以看出,与对照组比较,PSH组红细胞膜脂质组分中,脑磷脂和卵磷脂明显减少(P <0.01),而其他组分没有明显的变化。LSH组大鼠与安静组比较没有显著差异。
表4 大鼠红细胞膜脂质成分的变化 μg/mg protein
组别PSPEP CSMCG(n=20)0.108±0.0170.245±0.0320.225±0.0810.210±0.0 37LSH(n=17)0.105±0.0180.234±0.0310.220±0.0910.208±0. 038PSH(n=23)0.092±0.0120.196±0.011**0.202±0.032** 0.199±0.034** 与CG比较,P<0.01。CG为对照组,LSH为潜在运动性血红蛋白低下组,PSH运动性 血红蛋白低下阳性组;PS:磷脂酰丝氨酸,PE:脑磷脂,PC:卵磷脂,SM:鞘磷脂。
2.4 运动性血红蛋白低下大鼠红细胞膜带3蛋白组分的变化 如表5所示,与对照组、LSH组比较,PSH组红细胞膜上重要的蛋白-带3蛋白含量显著增 高。
表5 红细胞膜带3蛋白含量的变化OD
CG(n=20)L SH (n=17)PSH(n=23)Band 379.63±15.1675.62±16.2585.34±17.98** 与对照组比较,P<0.05。CG为对照组,LSH为潜在运动性血红蛋白低下组,PSH为运 动性血红蛋白低下组。
3 讨 论
尽管正常情况下,红细胞寿命为120 d,但运动,尤其是长时间大强度运动,可以加速 红细胞的衰老,衰老的红细胞易发生破裂而溶血或被吞噬细胞清除,加上机体蛋白质和铁缺 乏造成的血红蛋白合成不足,诱发运动性血红蛋白低下。以前研究者多采用溶血指标如血浆 中血红蛋白、触珠蛋白含量来反映红细胞破坏,但红细胞的清除主要发生在血管外(肝脏和 脾脏处),并不涉及溶血过程,故诸多学者将目光投向红细胞膜,希冀从膜生物学的角度来 阐明运动诱导的红细胞损伤机制。
红细胞膜主要由磷脂和蛋白质组成,磷脂主要包括PS(磷脂酰丝氨酸)、PE(脑磷脂)、PC (卵磷脂)、SM(鞘磷脂)四种组分。当红细胞能量供应不足,或细胞内Ca2+超负荷 , 激活细胞膜上的混转酶(scramblase),它将细胞膜内部的PS转移到红细胞表面,即外翻。PS 外翻被认为是红细胞衰亡和清除的重要信号[4],PS外翻率是常用的红细胞老化参 数,巨噬 细胞表面存在磷脂酰丝氨酸受体,它可以识别、吞噬并降解红细胞。本研究发现,与对照组 比较,运动性血红蛋白低下大鼠红细胞膜PS外翻率增加,表明红细胞膜出现衰亡标记,易被 吞噬细胞识别而清除,与金丽等人的结果相似[5]。同时,本研究还发现,运动性 血红蛋白低下大鼠红细胞膜PC、PE含量显著降低(P<0.05),与孙福茂等人的研究结 果一致[6]。提 示,运动性血红蛋白低下时红细胞膜存在以PC、PE降低为主的磷脂组分代谢障碍。膜磷脂丢 失,导致磷脂和胆固醉含量及其比值降低,红细胞膜形态结构异常,功能下降,抗原暴露增 多,脆性增加,易被吞噬细胞吞噬或破裂溶血。磷脂的丢失可能与运动激活了红细胞膜上的 磷脂酶A 2有关。磷脂酶A 2将脑磷脂和卵磷脂分解为溶血性磷脂,细胞膜结构部分丢失 [7],也可能与自由基攻击诱导的脂质过氧化有关[8]。
红细胞膜蛋白种类较多,约8～12种,是红细胞生理功能的执行者。其中,带3蛋白是红 细胞膜上含量最丰富的蛋白,占总蛋白含量的25%,主要介导阴离子转运功能,与氧和二氧 化碳的运输密切相关,还介导衰老红细胞的清除;葡萄糖载体蛋白-1通过协助扩散方式将血 浆中的葡萄糖快速转运入膜内,以保证红细胞正常的能量代谢;Na+,K+-ATP酶是维持 红细 胞膜内外离子浓度梯度最重要的离子泵,是反映红细胞活力的主要酶指标。已有研究表明, 激烈运动后,红细胞膜带3蛋白转运功能下降[9],Na+,K+-ATP酶活性升高或 降低[9-11], 取决于运动负荷,葡萄糖载体-1转运能力降低[9]。本研究发现,运动性血红蛋白 低下大鼠 红细胞膜带3蛋白转运阴离子、葡萄糖载体-1转运葡萄糖、Na+,K+-ATP酶活性、红细胞 变形 能力显著下降,与衰老的红细胞相似。金丽也发现,运动性贫血的运动员和大鼠红细胞膜Na +,K+-ATP酶活性显著降低[12]。一些研究也发现,运动性血红蛋白低下大鼠 异型红细 胞(棘形、口形、草帽形等)数量增多,表明一些红细胞无法保持正常形态,从另一个方面 支持本研究结果。红细胞膜蛋白功能下降可能与运动造成的内环境酸化和自由基攻击诱导的 脂质过氧化有关[8,9]。
激烈运动过程中,红细胞膜蛋白组分可能会发生丢失或交联。带3蛋白作为红细胞膜上 整合蛋白,可结合锚蛋白分子,约40%的带3蛋白分子参与了膜骨架的锚定,对维持红细胞膜 骨架的稳定至关重要。一些疾病,如刺状红细胞增多症、遗传性椭圆形细胞增多症,均与带 3蛋白的变异有关[4]。李开刚[12]等用SDS-聚丙酰胺凝胶电泳研究发现, 一次性大强度训练 带3蛋白含量减少。陈筱春等人[13]发现,疲劳运动后,大鼠红细胞膜带3蛋白含量 显著下降 ,红细胞渗透脆性增加。Jordan[14]发现,经过马拉松运动后,血浆结合珠蛋白浓 度下降, 扫描电镜发现红细胞膜骨架面积显著高于运动前,表明激烈运动可以导致红细胞膜蛋白结构 发生改变。Brzeszczynska发现,尽管普通健康成年人一次性力竭性运动(递增负荷自行车 运动至力竭)并不会出现溶血现象,但造成了红细胞膜蛋白交联、硬度提高(运动后即刻和 1 h最明显),与脂质过氧化有关[15]。另外,运动过程中,膜骨架蛋白中主要 蛋白-收 缩蛋白(spectrins)也可能受到损伤。Yusof等人[16]发现,6个男性受试者在完 成216 k m跑步过程中,42 km后红细胞膜收缩蛋白含量最低,且渗透脆性最高,在最先84 km的跑步 中有溶血发生,主要以一些衰老的红细胞为主。本研究发现,运动性血红蛋白低下大鼠红细 胞膜带3蛋白含量显著增加,即产生交联[17]。因此,激烈运动可以造成带3蛋白等 膜蛋白的 丢失或交联,造成膜骨架结构异常,使骨架蛋白失去与膜内表面的连接,红细胞对切应力的 应答能力丧失,变形能力下降,易发生溶血或被吞噬细胞吞噬。曹建民等[18]认为 ,由于运 动训练导致大鼠红细胞膜带3蛋白磷酸化显著增加,从而影响红细胞膜骨架,进而使红细胞 溶血增加,是导致运动性低血色素发生的重要原因。
4 结 论
持续4～6周的递增负荷训练后,部分大鼠血红蛋白水平显著降低,即发生运动性血红蛋 白低下。运动性血红蛋白低下大鼠红细胞膜脂质组分中脑磷脂和卵磷脂丢失较多,衰亡标记 -磷脂酰丝氨酸外翻率显著增加,呈老化状态;与红细胞生理功能密切相关的重要蛋白-带3 蛋白、葡萄糖载体蛋白-1、Na+,K+-ATP酶的功能下降,且带3蛋白发生交联,从而影响 膜骨架的稳定。
提示,长时间激烈运动通过影响红细胞膜组分和功 能,导致红细胞损伤和老化, 清除标记增多,膜流变性下降,变形能力减弱,造成红细胞溶血和/或清除增多,这可能是 运动性血红蛋白低下发生的重要细胞生物学机制。
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