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摘要 [目的]探讨系统地检测水质中三甲氧苄氨嘧啶残留量的方法。[方法]通过三甲氧苄氨嘧啶与马来酸酐反应，得到三甲氧苄氨嘧啶半抗原，再通过免疫动物得到抗三甲氧苄氨嘧啶单克隆抗体，并将其应用于能够检测水质中三甲氧苄氨嘧啶残留量的ELISA试剂盒。[结果]试验表明，该试剂盒对水质中三甲氧苄氨嘧啶的检测限为2.34 μg/kg，IC50（50%抑制浓度）为4.8 μg/L，回收率为60.5%～797%，试剂盒的标准曲线范围为0～80 μg/L，批内、批间的相对标准偏差均小于10%，三甲氧苄氨嘧啶单克隆抗体与二甲氧苄氨嘧啶的交叉反应率小于1%，4 ℃下能够保存12个月，稳定性较好。[结论]研究可为监管三甲氧苄氨嘧啶的滥用提供参考。
关键词 三甲氧苄氨嘧啶；单克隆抗体；ELISA试剂盒
中图分类号 TS207.3 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2016）17-091-03
Abstract [Objective] The aim was to discuss the method for detecting Trimethoprem residues in water. [Method] The synthesized Trimethoprem hapten was prepared from a sequence of reactions that used Trimethoprem and Maleic anhydride. And Trimethoprem monoclonal antibodies were prepared by animal immune. And ELISA kit was prepared. Then the limit of detection and relative standard deviation（RSD） of trimethoprem ELISA was studied. [Result] The limit of detection was 2.34 μg/kg， with the IC50 values 48 μg/L. The recoveries were between 60.5%-79.7%. The standard curve ranged from 0 to 80 μg/L， and RSD was less than 10%. The cross reaction rate with Diaveridine was less than 1%. The stability tests results revealed that the kit can be kept at 4 ℃ for 12 months. [Conclusion] The study can provide reference for administration of the abuse of Trimethoprem.
Key words Trimethoprem； Monoclonal antibodies； Enzyme linked immunosorbent assay kit（ELISA）
三甲氧苄氨嘧啶（Synaprim，TMP）[1]属于二氨嘧啶类化合物[2]，它是一种抗菌增效剂[3-4]。磺胺类药物单独使用，会使细菌很易产生耐药性，将三甲氧苄氨嘧啶与磺胺类药物组成复方制剂，可使细菌的叶酸代谢受到双重阻断，使抗菌谱扩大、抗菌活性增强，从抑菌作用变为杀菌作用，对多数革兰氏阳性菌和阴性菌有效，在兽医临床上应用十分广泛。磺胺增效剂可发生瘙痒、皮疹，临床也有发现服用头孢羟氨苄/TMP 致过敏性休克的报道，也有发生恶心、呕吐、腹泻等胃肠道反应[5-7]。磺胺增效剂对小白鼠的半数致死量（LD50）为2 500 mg/kg体重。大剂量使用时，可影响叶酸代谢和作用，可致白细胞减少和血小板减少，故长期使用时必须注意。为了保护人类健康，各国对动物源性食品中甲氧苄氨嘧啶残留量的检测很重视，均制定了严格的限量要求。例如：欧盟、我国香港政府规定牛、猪和家禽组织中残留限量为0.05 mg/kg。我国农业行业标准《无公害食品水产品中渔药残留限量》（NY 5070—2002）中规定了以磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲噁唑4种药物按总量计最大残留限量为100 μg/kg，甲氧苄啶最大残留限量为50 μg/kg[8]。
目前磺胺类及其增效剂残留的测定方法有高效液相色谱法配合紫外检测器、荧光检测器和质谱检测器，但大多采用国外产的净化小柱处理样品，增加了测定成本。目前尚鲜有关于磺胺类药物增效剂的系统检测方法，笔者制备了抗三甲氧苄氨嘧啶单克隆抗体，同时开发了检测水质中三甲氧苄氨嘧啶残留量的酶联免疫试剂盒，以期为监管滥用三甲氧苄氨嘧啶提供有效手段。
1 材料与方法
1.1 材料
三甲氧苄氨嘧啶标准品，北京标准物质研究中心；氢氧化钠、乙酸乙酯、磷酸盐、卵清蛋白、牛血清白蛋白，北京百欣试剂公司；水质，购自超市；复溶工作液，北京勤邦生物技术有限公司。
酶标仪（最大量程为4.0），上海雷勃分析仪器有限公司；振荡器、涡旋仪，湖南湘立科学仪器有限公司。
1.2 制备抗原
1.2.1 制备半抗原。
取0.58 g三甲氧苄氨嘧啶，0.40 g马来酸酐和1 mL吡啶溶解于10 mL二甲基亚砜（DMSO）中，在40 ℃下搅拌反应12 h，蒸除溶剂，柱层析后在乙醇-水体系中重结晶得到三甲氧苄氨嘧啶单马来酸酰胺[9]。
1.2.2 制备免疫原。
取8.5 mg三甲氧苄氨嘧啶半抗原，溶解于1 mL二甲基甲酰胺（DMF）中；取15 mg碳化二亚胺（EDC）用0.2 mL水充分溶解后于加入半抗原的溶解液中，室温下搅拌24 h，即可得到反应液A。称取牛血清白蛋白40 mg，使之充分溶解在2.8 mL pH 为7.2 的PBS中，将反应液A逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24 h；用001 mol/L PBS在4 ℃透析3 d，每天换3 次透析液，以除去未反应的小分子物质；分装，于-20 ℃保存备用[9]。 1.2.3 制备包被原。
反应液A制备同“1.2.2”；称取卵清蛋白30 mg，使之充分溶解在2.8 mL pH 为7.2 的PBS 中，将反应液A 逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24 h；用0.01 mol/L PBS 在4 ℃透析3 d，每天换3 次透析液，以除去未反应的小分子物质；分装，于-20 ℃保存备用。
1.3 制备酶标记抗抗体
将“1.2”得到的免疫原注入Balb/c小鼠体内，产生抗血清。取免疫Balb/c小鼠脾细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞融合，进行克隆化，获得稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，用辛
酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到三甲氧苄氨嘧啶单克隆抗体[10]，用该抗体免疫无病原体羊，得到羊抗鼠抗抗体[11]，将羊抗鼠抗抗体与辣根过氧化物酶（HRP）偶联[12]，最终得到酶标记抗抗体。
1.4 优选抗原包被浓度、单克隆抗体浓度，制备酶标板
按照下列公式计算0、0.5 μg/L浓度的三甲氧苄氨嘧啶标准品的百分吸光率，测定波长为450 nm，抗原稀释倍数依次为：1∶1 000、1∶3 000、1∶9 000；单克隆抗体稀释倍数依次为：1∶10 000、1∶30 000、1∶90 000、1∶270 000；酶标记抗抗体液的稀释倍数为1∶1 000。
百分吸光率（%）=（标准品或样本溶液的平均吸光度值/0 μg/L标准溶液的平均吸光度值）×100%
将100 μL抗原包被液包被于酶标板中，37 ℃下孵育2 h，清洗酶标板之后，加入150 μL质量分数为0.05%BSA的0.02 mol/L PBS缓冲液，37 ℃下孵育2 h[13]，即制备完成酶标板。
1.5 水质样本的前处理方法
取水样100 μl至2 mL离心管中，加入400 μL复溶工作液，用涡旋仪充分涡动，混匀；取50 μL用于分析。
1.6 酶标板检测
向“1.4”制备完成的酶标板中依次加入浓度为0、0.5、2、6、20、80 μg/L的标准品溶液，以及“1.5”前处理完成的水质样本溶液，每孔均为50 μL，再加入抗体液，每孔50 μL，室温避光反应30 min。清洗酶标板，然后每孔加入“1.3”制备的酶标记抗抗体100 μL，室温避光反应30 min。清洗酶标板，然后每孔加入50 μL H2O2，然后每孔再加入50 μL四甲基联苯胺，室温避光反应15 min。最后每孔加入2 mol/L H2SO4 50 μL，测定酶标板孔的OD450 nm值。
1.7 计算水质样本中三甲氧苄氨嘧啶含量
标准曲线的横坐标为三甲氧苄氨嘧啶标准品浓度（μg/L）的对数，纵坐标为标准品百分吸光率，然后将水质样本的OD450 nm代入标准曲线，得到相应的浓度，该浓度乘以稀释倍数即为水质样本中三甲氧苄氨嘧啶残留量。
1.8 检测性能
1.8.1 计算检测限。
分别检测20份水体空白样本，利用空白样本浓度的平均值加上3倍标准差，计算检测限（LOD），即检测方法可检测出的最低被测物浓度[14]。
1.8.2 精密度和准确度。
分别对水质样本添加三甲氧苄氨嘧啶，使其浓度达到2.5、5.0和10.0 μg/kg，测定添加回收率，以此评价该试剂盒的准确度。同时，每个样本做4个平行，按照上述“1.4”制备3批酶标板，计算相对标准偏差（RSD），以此评价该试剂盒的精密度。
1.8.3 测定稳定性。
通过测定试剂盒的保存条件，评价该试剂盒的稳定性。将试剂盒保存于4 ℃，每个月测定一次最大吸光度值（0 μg/L）、IC50以及水质样本的回收率，连续测定12个月。
1.8.4 测定抗体特异性。
二甲氧苄氨嘧啶与三甲氧苄氨嘧啶的结构类似，测定这3种药物的IC50，根据下式计算该试剂盒对于二甲氧苄氨嘧啶的交叉反应率：
交叉反应率（%）=引起50%抑制的三甲氧苄氨嘧啶浓度引起50%抑制的三甲氧苄氨嘧啶类似物浓度×100%
2 结果与分析
2.1 鉴定半抗原
利用核磁共振氢谱法测定“1.2.1”制备的半抗原，新增加的12.0 左右的羧基信号峰以及6～7间的烯烃信号峰说明半抗原合成成功。
2.2 优选抗原包被浓度、单克隆抗体浓度
测定浓度为0和0.5 μg/L的三甲氧苄氨嘧啶标准品的OD450 nm，见表1。
当OD450 nm（0.5 μg/L）/OD450 nm（0 μg/L）的抑制率在70%～85%时，以抗原、单克隆抗体的最大稀释倍数作为抗原、单克隆抗体的最佳稀释倍数[15]。由此可见，该研究优选抗原稀释倍数为9 000，最佳单克隆抗体稀释倍数为270 000。
2.3 标准曲线 试验表明（表2，图2），标准曲线的范围为0～80 μg/L，IC50（50%抑制浓度）为4.8 μg/L；线性方程y=-1.523x+1.172，R2为0.994。
2.4 计算检测限
由表3可见，各供试样本检测结果平均值为0.83 μg/kg，标准差0.50，该研究对水质样本的检测限为2.34 μg/kg。
2.5 精密度和准确度
测定添加不同浓度三甲氧苄氨嘧啶的水质样本，回收率范围是60.5%～79.7%，可见当添加浓度为2.5、5.0和10.0 μg/kg时，批内相对标准偏差范围是50%～9.5%；批间相对标准偏差范围是7.5%～9.1%。具体见表4。
2.6 测定稳定性 将试剂盒保存在4 ℃，测定的试剂盒的最大吸光度值（0 μg/L）范围是1.60～1.93，50%抑制浓度范围是3.2～5.4 μg/L，三甲氧苄氨嘧啶添加回收率范围是618%～77.8%。由此可见，各指标均在正常范围之内（表5）。从测定结果可知，该试剂盒在4 ℃至少能够保存12个月。
2.7 测定抗体特异性
该试验得出，三甲氧苄氨嘧啶抗体与二甲氧苄氨嘧啶的交叉反应率小于1%。
3 结论与讨论
该研究制备了抗三甲氧苄氨嘧啶单克隆抗体，并研发出相应的ELISA试剂盒，优选出抗原包被浓度和单克隆抗体浓度，试剂盒的标准曲线范围0～80 μg/L，对水质的检测限为2.34 μg/kg，回收率为60.5%～79.7%，批内相对标准偏差范
围是5.0%～9.5%，批间相对标准偏差范围是7.5%～9.1%。
三甲氧苄氨嘧啶单克隆抗体的特异性较好，与二甲氧苄氨嘧啶的交叉反应率小于1%。ELISA试剂盒能够在4 ℃下保存12个月，主要指标在正常范围内，可见稳定性较好[16]。
万宇平等应用胶体金免疫层析技术建立了一种快速检测食品中三甲氧苄氨嘧啶（TMP）的方法，该方法检测的样本为牛奶，灵敏度为50 μg/L[9]。高洋洋等建立了一种超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS /MS）测定多种基质（鸡肉、鱼肉、鸡肝、鸡蛋和牛奶）中三甲氧苄氨嘧啶的分析方法，定量限（信噪比为10）为5.0 μg/kg[17]。而该试验对水质中三甲氧苄氨嘧啶的检测限为2.34 μg/kg，优于上述指标。
参考文献
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[16] 唐伟国.医学检验诊断试剂的制备与应用[M].上海：上海科技文献出版社，1996：99.
[17] 高洋洋，张朝晖，卢晓宇，等.超高效液相色谱-串联质谱法测定动物源性食品中的三甲氧苄氨嘧啶[J].分析试验室，2014，33（3）：315-318.
关键词 三甲氧苄氨嘧啶；单克隆抗体；ELISA试剂盒
中图分类号 TS207.3 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2016）17-091-03
Abstract [Objective] The aim was to discuss the method for detecting Trimethoprem residues in water. [Method] The synthesized Trimethoprem hapten was prepared from a sequence of reactions that used Trimethoprem and Maleic anhydride. And Trimethoprem monoclonal antibodies were prepared by animal immune. And ELISA kit was prepared. Then the limit of detection and relative standard deviation（RSD） of trimethoprem ELISA was studied. [Result] The limit of detection was 2.34 μg/kg， with the IC50 values 48 μg/L. The recoveries were between 60.5%-79.7%. The standard curve ranged from 0 to 80 μg/L， and RSD was less than 10%. The cross reaction rate with Diaveridine was less than 1%. The stability tests results revealed that the kit can be kept at 4 ℃ for 12 months. [Conclusion] The study can provide reference for administration of the abuse of Trimethoprem.
Key words Trimethoprem； Monoclonal antibodies； Enzyme linked immunosorbent assay kit（ELISA）
三甲氧苄氨嘧啶（Synaprim，TMP）[1]属于二氨嘧啶类化合物[2]，它是一种抗菌增效剂[3-4]。磺胺类药物单独使用，会使细菌很易产生耐药性，将三甲氧苄氨嘧啶与磺胺类药物组成复方制剂，可使细菌的叶酸代谢受到双重阻断，使抗菌谱扩大、抗菌活性增强，从抑菌作用变为杀菌作用，对多数革兰氏阳性菌和阴性菌有效，在兽医临床上应用十分广泛。磺胺增效剂可发生瘙痒、皮疹，临床也有发现服用头孢羟氨苄/TMP 致过敏性休克的报道，也有发生恶心、呕吐、腹泻等胃肠道反应[5-7]。磺胺增效剂对小白鼠的半数致死量（LD50）为2 500 mg/kg体重。大剂量使用时，可影响叶酸代谢和作用，可致白细胞减少和血小板减少，故长期使用时必须注意。为了保护人类健康，各国对动物源性食品中甲氧苄氨嘧啶残留量的检测很重视，均制定了严格的限量要求。例如：欧盟、我国香港政府规定牛、猪和家禽组织中残留限量为0.05 mg/kg。我国农业行业标准《无公害食品水产品中渔药残留限量》（NY 5070—2002）中规定了以磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲噁唑4种药物按总量计最大残留限量为100 μg/kg，甲氧苄啶最大残留限量为50 μg/kg[8]。
目前磺胺类及其增效剂残留的测定方法有高效液相色谱法配合紫外检测器、荧光检测器和质谱检测器，但大多采用国外产的净化小柱处理样品，增加了测定成本。目前尚鲜有关于磺胺类药物增效剂的系统检测方法，笔者制备了抗三甲氧苄氨嘧啶单克隆抗体，同时开发了检测水质中三甲氧苄氨嘧啶残留量的酶联免疫试剂盒，以期为监管滥用三甲氧苄氨嘧啶提供有效手段。
1 材料与方法
1.1 材料
三甲氧苄氨嘧啶标准品，北京标准物质研究中心；氢氧化钠、乙酸乙酯、磷酸盐、卵清蛋白、牛血清白蛋白，北京百欣试剂公司；水质，购自超市；复溶工作液，北京勤邦生物技术有限公司。
酶标仪（最大量程为4.0），上海雷勃分析仪器有限公司；振荡器、涡旋仪，湖南湘立科学仪器有限公司。
1.2 制备抗原
1.2.1 制备半抗原。
取0.58 g三甲氧苄氨嘧啶，0.40 g马来酸酐和1 mL吡啶溶解于10 mL二甲基亚砜（DMSO）中，在40 ℃下搅拌反应12 h，蒸除溶剂，柱层析后在乙醇-水体系中重结晶得到三甲氧苄氨嘧啶单马来酸酰胺[9]。
1.2.2 制备免疫原。
取8.5 mg三甲氧苄氨嘧啶半抗原，溶解于1 mL二甲基甲酰胺（DMF）中；取15 mg碳化二亚胺（EDC）用0.2 mL水充分溶解后于加入半抗原的溶解液中，室温下搅拌24 h，即可得到反应液A。称取牛血清白蛋白40 mg，使之充分溶解在2.8 mL pH 为7.2 的PBS中，将反应液A逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24 h；用001 mol/L PBS在4 ℃透析3 d，每天换3 次透析液，以除去未反应的小分子物质；分装，于-20 ℃保存备用[9]。 1.2.3 制备包被原。
反应液A制备同“1.2.2”；称取卵清蛋白30 mg，使之充分溶解在2.8 mL pH 为7.2 的PBS 中，将反应液A 逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24 h；用0.01 mol/L PBS 在4 ℃透析3 d，每天换3 次透析液，以除去未反应的小分子物质；分装，于-20 ℃保存备用。
1.3 制备酶标记抗抗体
将“1.2”得到的免疫原注入Balb/c小鼠体内，产生抗血清。取免疫Balb/c小鼠脾细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞融合，进行克隆化，获得稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，用辛
酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到三甲氧苄氨嘧啶单克隆抗体[10]，用该抗体免疫无病原体羊，得到羊抗鼠抗抗体[11]，将羊抗鼠抗抗体与辣根过氧化物酶（HRP）偶联[12]，最终得到酶标记抗抗体。
1.4 优选抗原包被浓度、单克隆抗体浓度，制备酶标板
按照下列公式计算0、0.5 μg/L浓度的三甲氧苄氨嘧啶标准品的百分吸光率，测定波长为450 nm，抗原稀释倍数依次为：1∶1 000、1∶3 000、1∶9 000；单克隆抗体稀释倍数依次为：1∶10 000、1∶30 000、1∶90 000、1∶270 000；酶标记抗抗体液的稀释倍数为1∶1 000。
百分吸光率（%）=（标准品或样本溶液的平均吸光度值/0 μg/L标准溶液的平均吸光度值）×100%
将100 μL抗原包被液包被于酶标板中，37 ℃下孵育2 h，清洗酶标板之后，加入150 μL质量分数为0.05%BSA的0.02 mol/L PBS缓冲液，37 ℃下孵育2 h[13]，即制备完成酶标板。
1.5 水质样本的前处理方法
取水样100 μl至2 mL离心管中，加入400 μL复溶工作液，用涡旋仪充分涡动，混匀；取50 μL用于分析。
1.6 酶标板检测
向“1.4”制备完成的酶标板中依次加入浓度为0、0.5、2、6、20、80 μg/L的标准品溶液，以及“1.5”前处理完成的水质样本溶液，每孔均为50 μL，再加入抗体液，每孔50 μL，室温避光反应30 min。清洗酶标板，然后每孔加入“1.3”制备的酶标记抗抗体100 μL，室温避光反应30 min。清洗酶标板，然后每孔加入50 μL H2O2，然后每孔再加入50 μL四甲基联苯胺，室温避光反应15 min。最后每孔加入2 mol/L H2SO4 50 μL，测定酶标板孔的OD450 nm值。
1.7 计算水质样本中三甲氧苄氨嘧啶含量
标准曲线的横坐标为三甲氧苄氨嘧啶标准品浓度（μg/L）的对数，纵坐标为标准品百分吸光率，然后将水质样本的OD450 nm代入标准曲线，得到相应的浓度，该浓度乘以稀释倍数即为水质样本中三甲氧苄氨嘧啶残留量。
1.8 检测性能
1.8.1 计算检测限。
分别检测20份水体空白样本，利用空白样本浓度的平均值加上3倍标准差，计算检测限（LOD），即检测方法可检测出的最低被测物浓度[14]。
1.8.2 精密度和准确度。
分别对水质样本添加三甲氧苄氨嘧啶，使其浓度达到2.5、5.0和10.0 μg/kg，测定添加回收率，以此评价该试剂盒的准确度。同时，每个样本做4个平行，按照上述“1.4”制备3批酶标板，计算相对标准偏差（RSD），以此评价该试剂盒的精密度。
1.8.3 测定稳定性。
通过测定试剂盒的保存条件，评价该试剂盒的稳定性。将试剂盒保存于4 ℃，每个月测定一次最大吸光度值（0 μg/L）、IC50以及水质样本的回收率，连续测定12个月。
1.8.4 测定抗体特异性。
二甲氧苄氨嘧啶与三甲氧苄氨嘧啶的结构类似，测定这3种药物的IC50，根据下式计算该试剂盒对于二甲氧苄氨嘧啶的交叉反应率：
交叉反应率（%）=引起50%抑制的三甲氧苄氨嘧啶浓度引起50%抑制的三甲氧苄氨嘧啶类似物浓度×100%
2 结果与分析
2.1 鉴定半抗原
利用核磁共振氢谱法测定“1.2.1”制备的半抗原，新增加的12.0 左右的羧基信号峰以及6～7间的烯烃信号峰说明半抗原合成成功。
2.2 优选抗原包被浓度、单克隆抗体浓度
测定浓度为0和0.5 μg/L的三甲氧苄氨嘧啶标准品的OD450 nm，见表1。
当OD450 nm（0.5 μg/L）/OD450 nm（0 μg/L）的抑制率在70%～85%时，以抗原、单克隆抗体的最大稀释倍数作为抗原、单克隆抗体的最佳稀释倍数[15]。由此可见，该研究优选抗原稀释倍数为9 000，最佳单克隆抗体稀释倍数为270 000。
2.3 标准曲线 试验表明（表2，图2），标准曲线的范围为0～80 μg/L，IC50（50%抑制浓度）为4.8 μg/L；线性方程y=-1.523x+1.172，R2为0.994。
2.4 计算检测限
由表3可见，各供试样本检测结果平均值为0.83 μg/kg，标准差0.50，该研究对水质样本的检测限为2.34 μg/kg。
2.5 精密度和准确度
测定添加不同浓度三甲氧苄氨嘧啶的水质样本，回收率范围是60.5%～79.7%，可见当添加浓度为2.5、5.0和10.0 μg/kg时，批内相对标准偏差范围是50%～9.5%；批间相对标准偏差范围是7.5%～9.1%。具体见表4。
2.6 测定稳定性 将试剂盒保存在4 ℃，测定的试剂盒的最大吸光度值（0 μg/L）范围是1.60～1.93，50%抑制浓度范围是3.2～5.4 μg/L，三甲氧苄氨嘧啶添加回收率范围是618%～77.8%。由此可见，各指标均在正常范围之内（表5）。从测定结果可知，该试剂盒在4 ℃至少能够保存12个月。
2.7 测定抗体特异性
该试验得出，三甲氧苄氨嘧啶抗体与二甲氧苄氨嘧啶的交叉反应率小于1%。
3 结论与讨论
该研究制备了抗三甲氧苄氨嘧啶单克隆抗体，并研发出相应的ELISA试剂盒，优选出抗原包被浓度和单克隆抗体浓度，试剂盒的标准曲线范围0～80 μg/L，对水质的检测限为2.34 μg/kg，回收率为60.5%～79.7%，批内相对标准偏差范
围是5.0%～9.5%，批间相对标准偏差范围是7.5%～9.1%。
三甲氧苄氨嘧啶单克隆抗体的特异性较好，与二甲氧苄氨嘧啶的交叉反应率小于1%。ELISA试剂盒能够在4 ℃下保存12个月，主要指标在正常范围内，可见稳定性较好[16]。
万宇平等应用胶体金免疫层析技术建立了一种快速检测食品中三甲氧苄氨嘧啶（TMP）的方法，该方法检测的样本为牛奶，灵敏度为50 μg/L[9]。高洋洋等建立了一种超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS /MS）测定多种基质（鸡肉、鱼肉、鸡肝、鸡蛋和牛奶）中三甲氧苄氨嘧啶的分析方法，定量限（信噪比为10）为5.0 μg/kg[17]。而该试验对水质中三甲氧苄氨嘧啶的检测限为2.34 μg/kg，优于上述指标。
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